本發(fā)明屬于病原體的鑒定與藥敏實驗技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種微流控芯片，及使用該微流控芯片同步實現(xiàn)宮頸病原體檢測與藥敏實驗的方法。

背景技術(shù)：

近年來宮頸癌的生物學(xué)因素方面取得了突破性進(jìn)展，大量的流行病學(xué)及分子生物學(xué)等研究認(rèn)為有些病原體尤其是通過性傳播的病原體與宮頸癌的發(fā)生有密切關(guān)系，在婦科疾病中，發(fā)病率最高的一種疾病就是慢性宮頸炎以及陰道炎。目前對于這些疾病的治療，大多數(shù)醫(yī)院還是以西醫(yī)治療為主，但隨著社會的不斷發(fā)展，中藥也逐漸被應(yīng)用到慢性宮頸炎以及陰道炎的治療過程中，利用中藥對患有婦科疾病的患者進(jìn)行治療效果顯著，這為患者健康的恢復(fù)奠定了基礎(chǔ)。

現(xiàn)有的檢測病原體的方法主要通過直接涂片染色鏡下觀察，或者將病原體分離培養(yǎng)鑒定，傳統(tǒng)的藥敏實驗是在96孔板的液體培養(yǎng)基中稀釋或使用紙片法形成梯度的方法。確定最小抑菌濃度指導(dǎo)方針的方法是由臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)研究所公布的，這些標(biāo)準(zhǔn)化的測試是可靠的，但是操作繁瑣，孵育時間較長(通常為16至20小時)，直到MIC可以通過視覺檢測培養(yǎng)的濁度或菌落生長。這不利于及時診斷和抗生素選擇指導(dǎo)。

傳統(tǒng)的細(xì)菌鑒定方法是將病人體液標(biāo)本涂布在含有培養(yǎng)基的瓊脂平板上培養(yǎng)增菌，繼而挑選優(yōu)勢細(xì)菌培養(yǎng)鑒定并且進(jìn)行藥敏實驗，這種方法存在的問題在于樣品消耗量大和檢測時間長，經(jīng)常無法有效滿足臨床工作的需求，此外，傳統(tǒng)細(xì)菌鑒定方法大多依賴于眾多的大型專業(yè)化設(shè)備，限制了該技術(shù)在基層醫(yī)療單位的推廣。

Mohan等在Biosensors and Bioelectronics雜志上第49期公開了一篇名為A multiplexed microfluidic platform for rapid antibiotic susceptibility testing的文章，制作了一種集成了24個微室的高通量微流控芯片。其微室中設(shè)有微型閥片用來促進(jìn)菌液和藥物溶液的混合，通過往微室中注入不同濃度的抗生素與細(xì)菌充分混合、反應(yīng)，并監(jiān)測不同種類及不同濃度抗生素作用下的細(xì)菌生長狀態(tài)，以篩選出有效的抗菌藥及最佳的藥物濃度。Sun等在Biosensors and Bioelectronics雜志上的2011年第26期發(fā)表一篇名為High-throughput microfluidic system for long-term bacterial colony monitoring and antibiotic testing in zero-flow environments的文章，設(shè)計了一個由7條平行主通道和多個平行微室構(gòu)成的芯片，主通道與微室間通過“梅花形”的微型柱狀結(jié)構(gòu)相連，這一設(shè)計既能減少液流產(chǎn)生的剪切力對微室中細(xì)菌的影響，又能確保將細(xì)菌限制于微室內(nèi)與泵入的藥物持續(xù)反應(yīng)。

近年發(fā)展起來的微流控芯片細(xì)菌分析技術(shù)，較之傳統(tǒng)方法具有很多優(yōu)勢。首先，芯片細(xì)菌分析平臺小巧便攜，操作簡便，非常適合于現(xiàn)場快速檢測，其次，芯片微分析平臺有利于提高測試通量和降低試樣消耗量，便于實現(xiàn)高通量分析；此外，大多數(shù)芯片細(xì)菌分析方法可以免去預(yù)增菌步驟，因而可以顯著縮短分析時間。因此，微流控芯片技術(shù)為細(xì)菌分析提供了一種理想的解決方案。然而，目前報道的微流控芯片細(xì)菌分析大多只針對單一種類細(xì)菌檢測，無法滿足臨床上對病原菌的分析需求。

目前微流控芯片中常用的免疫分選方式是通過在固相載體上修飾特異性抗體等生物探針進(jìn)行的。根據(jù)探針固定的載體不同，主要分為：微通道免疫分選、免疫磁珠分選以及免疫微珠分選等。但是微通道免疫分選由于微通道直接固定法處理步驟較為繁瑣，且因其比表面積較低導(dǎo)致探針的固定數(shù)量相當(dāng)有限，而影響芯片的分選效率。免疫磁珠分選相對于微通道免疫分選法，磁珠有更大的比表面積，能將更多的探針固定于一定表面上，同時無論從設(shè)計角度，或是從操作的自動化角度，微流控芯片磁分選相對于大平臺上的磁分選而言更具靈活性。磁珠的使用無論是從價格方面或是從分選設(shè)備方便都不利于批量生產(chǎn)，甚至電磁場產(chǎn)熱還有導(dǎo)致蛋白變性的可能而影響分選效率。免疫微珠分選方式研究是在芯片特定微腔內(nèi)填充微珠，且使微腔的高度與微珠直徑尺寸相近，因而微珠在微腔中呈單層排列，這種設(shè)計有效防止了由于微珠在腔內(nèi)重疊造成光信號的阻滯和因堆砌的微珠導(dǎo)致流體傳輸阻力的增加。但芯片中為限定微珠于微腔內(nèi)而設(shè)計的“階梯樣”或“堰堤”結(jié)構(gòu)加大了芯片模具的制備難度。

用于細(xì)菌鑒定的最現(xiàn)代的儀器的分析是基于完善的表型檢測，即根據(jù)顏色變化進(jìn)行鑒別。Holt JG等在Baltimore,MD:Williams&Wilkins上發(fā)表Bergey’s manual of determinative bacteriology，使用一個常用的含有發(fā)酵糖的試驗測試平臺檢測未知的細(xì)菌。pH指示劑或熒光染料顯示了不同糖發(fā)酵的結(jié)果。將代謝結(jié)果通過與已知的制得的數(shù)據(jù)庫表進(jìn)行對比，從而對一個病原體作出鑒別。

本方法簡便快速，實驗所用試劑簡單易得，尤其適于醫(yī)療資源匱乏條件下的細(xì)菌快速分析。該項技術(shù)是將現(xiàn)代化學(xué)合成技術(shù)、細(xì)菌代謝組學(xué)與微流控技術(shù)相結(jié)合應(yīng)用于病原體檢驗領(lǐng)域的一項新技術(shù)。顯色培養(yǎng)基克服了傳統(tǒng)培養(yǎng)基在各種細(xì)菌分離、鑒別、計數(shù)等操作過程中比較復(fù)雜(需要有經(jīng)驗的技術(shù)人員)、敏感性低和特異性差的缺點。顯色培養(yǎng)基與微流控技術(shù)結(jié)合，節(jié)約了試劑的使用量，減少了待檢標(biāo)本的需要量。傳統(tǒng)檢測細(xì)菌，需培養(yǎng)24小時才能通過肉眼觀察菌落顏色進(jìn)行定性或定量分析。本實驗既不需要使用磁珠或者微珠作為載體，也不需要使用普通貨熒光顯微鏡來進(jìn)行結(jié)果判定。將待檢樣品引入芯片并分隔于不同培養(yǎng)池，借助于培養(yǎng)池陣列的空間分辨力，實現(xiàn)多重病原體分析，根據(jù)特異性顯色結(jié)果通過肉眼觀察菌落顏色變化實現(xiàn)細(xì)菌鑒定，通過實時顯色強度Tt值分析實現(xiàn)細(xì)菌定量確定病原體的濃度，依據(jù)抑制顯色反應(yīng)的最低抗生素濃度確定抗生素敏感性。既縮短了檢測時間，又免除了增菌等過程，極大提高了工作效率，節(jié)省了能源。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決上述問題，本發(fā)明提供一種具有新型結(jié)構(gòu)的微流控芯片，同時提供一種利用所述芯片在病原體的鑒定與藥敏實驗中的使用方法，具體方案如下：

首先，本發(fā)明所述具有新型結(jié)構(gòu)的微流控芯片，包含3層PDMS結(jié)構(gòu)，微流控芯片頂層、微流控芯片中層和微流控芯片底層，其中：

微流控芯片底層為平板結(jié)構(gòu)；例如載玻片；

微流控芯片中層有培養(yǎng)池；所述培養(yǎng)池為16個通孔，排列為4列×4行的矩陣；

微流控芯片頂層設(shè)置有入口、液體通道、凹槽和廢液孔；

所述入口為兩個并列設(shè)置的通孔，通孔貫穿微流控芯片頂層；所述的凹槽為16個，排列為4列×4行的矩陣，兩個入口和凹槽之間通過液體通道聯(lián)通；此液體通道嵌合于流控芯片頂層，每一列之內(nèi)的4個培養(yǎng)池通過液體通道連通；且通過液體通道的設(shè)置，使得按照同樣速度向入口加樣品的時候，相鄰列的樣品濃度呈梯度變化；

所述廢液孔有4個，分別對應(yīng)的設(shè)置于4列凹槽的下游，且通過液體通道相連通；其還具有排氣孔的作用。

微流控芯片頂層、中層與底層載玻片封接后形成圖3結(jié)構(gòu)；頂層的凹槽與中層的培養(yǎng)池吻合，培養(yǎng)池用于盛裝培養(yǎng)基，凹槽相當(dāng)于培養(yǎng)基的蓋子，凹槽內(nèi)的空間可以使培養(yǎng)基處于厭氧環(huán)境。

對于上述技術(shù)方案中，優(yōu)選的情況下，所述液體通道在縱向上的通道數(shù)由入口的2個分為3個、再由3個分為4個，最終此4個液體通道分別和4×4的凹槽的每列首個凹槽相連通。

對于上述技術(shù)方案中，優(yōu)選的情況下，所述液體通道深度小于微流控芯片頂層厚度，凹槽深度小于微流控芯片頂層厚度。

對于上述技術(shù)方案中，優(yōu)選的情況下，所述的平板結(jié)構(gòu)為載玻片。

對于上述技術(shù)方案中，優(yōu)選的情況下，所述凹槽直徑為3mm；廢液孔直徑1mm；培養(yǎng)池直徑為3mm，培養(yǎng)池高為2mm；液體通道的高為50μm，寬為150μm。

本發(fā)明的另一方面，在于公開利用上文所述的微流控芯片在病原體的鑒定與藥敏實驗中的應(yīng)用，其方法包括如下步驟：

(1)芯片各層經(jīng)滅菌后，將底層與中層封接，向培養(yǎng)池中加入液狀的顯色培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基冷卻凝固后將上層封接，制得完整芯片；封接后的芯片置于4℃保濕盒中儲存，使用前使用紫外燈照射芯片表面1h；

(2)向芯片的兩個入口，都注入無水乙醇并使之充滿整個液體通道，靜置10分鐘，然后用無菌蒸餾水沖洗芯片液體通道，后將芯片進(jìn)行高壓及紫外照射滅菌處理后使用；

(3)向兩個入口分別加入稀釋液和藥物，二孔同時加樣，且加樣速度一致，使液體通過液體通道后，分別經(jīng)由凹槽流至各個培養(yǎng)池，待全部培養(yǎng)池充盈后，將廢液孔中流出的多余藥液去除；

(4)從兩個入口同時以50μL/min流速加入待檢標(biāo)本，待全部培養(yǎng)池充盈后，將廢液孔中流出的多余菌液去除，進(jìn)樣后將芯片置于溫箱中培養(yǎng)，最后觀察培養(yǎng)結(jié)果。

本發(fā)明提供了一種微流控芯片的病原體分析技術(shù)，用于多重病原體鑒定與抗生素敏感性測試，利用瓊脂培養(yǎng)基具有高溫溶解低溫凝固的特性，將鑒定培養(yǎng)基置于芯片中層，利用上層芯片濃度梯度發(fā)生器(兩個入口和凹槽之間通過液體通道又稱為濃度梯度發(fā)生器)，將待研究藥物引入。并分隔于不同培養(yǎng)池，借助于培養(yǎng)池陣列的空間分辨力，實現(xiàn)多重病原體分析，具有操作簡便、耗時短、低消耗和高通量的優(yōu)勢，根據(jù)特異性顯色結(jié)果實現(xiàn)細(xì)菌定性鑒定，實驗使用的瓊脂培養(yǎng)基中含有特異性的顯色底物，可以在細(xì)菌產(chǎn)生酶的作用下發(fā)生顯色反應(yīng)；實驗通過實時顯色強度分析實現(xiàn)細(xì)菌定量測定，依據(jù)抑制顯色反應(yīng)的最低抗生素濃度確定抗生素敏感性，因此在芯片上實現(xiàn)了多重細(xì)菌的同時定性與定量分析和AST。

本發(fā)明所述的的微流控芯片特別適合于醫(yī)療資源匱乏條件下的病原體分析，后續(xù)工作將進(jìn)一步擴展檢測對象范圍，以提高該技術(shù)的實際應(yīng)用性能

附圖說明

圖1：微流控芯片頂層示意圖，1是入口，2是加樣通道，3是凹槽，4是廢液孔。兩個入口都是加樣口，其一加入山楂核提取液藥物，另一入口加入生理鹽水，要求向兩個入口加樣的速度一致；經(jīng)濃度發(fā)生器在第1、2、3、4列形成0:1:2:3濃度梯度的藥物(即：第1列為原濃度的稀釋液，第4列為原濃度的藥液，第2列為藥液經(jīng)過2倍稀釋的藥液，第3列為藥液經(jīng)過1倍稀釋的藥液)，以加樣時，右側(cè)入口山楂核提取液濃度是25mg/ml為例，在第1、2、3、4列將形成0、6.25mg/mL、12.5mg/mL、25mg/mL濃度梯度；所有液體均經(jīng)廢液口排出。

圖2：微流控芯片中層示意圖；含有16個培養(yǎng)池；

圖3：微流控芯片三層結(jié)構(gòu)組合示意圖；

圖4：實時強度定量參考值。

具體實施方式

下述非限制性實施例可以使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。

本發(fā)明實施例中使用的試劑有：

山楂核提取液，步長紅核婦潔洗液10ml購自山東步長神州制藥有限公司

本發(fā)明實施例中用到的白色念珠菌鑒定培養(yǎng)基、金黃色葡萄球菌鑒定培養(yǎng)基、大腸桿菌鑒定培養(yǎng)基、糞腸球菌培養(yǎng)基均購自青島海博試劑公司；

實施例1

本發(fā)明所述的微流控芯片包含3層PDMS結(jié)構(gòu)：

微流控芯片頂層有入口、液體通道、凹槽、廢液孔；微流控芯片中層有培養(yǎng)池，微流控芯片底層為平板結(jié)構(gòu)，例如：載玻片；其中：

所述微流控芯片中層的培養(yǎng)池為16個通孔，排列為4列×4行的矩陣，培養(yǎng)池直徑3mm，培養(yǎng)池高2mm。

所述微流控芯片頂層的入口有兩個；所述的凹槽為16個，排列為4列×4行的矩陣，直徑3mm。兩個入口和凹槽之間的液體通道稱為濃度發(fā)生器，所述濃度發(fā)生器在縱向上的通道數(shù)由入口的2個分為3個、再由3個分為4個，最終此4個液體通道分別和4×4的凹槽的每列首個凹槽相連通。所述廢液孔有4個，直徑1mm，分別對應(yīng)的設(shè)置于4列凹槽的下游，且通過液體通道相連通；其既是廢液孔也是排氣孔。

本發(fā)明使用自行搭建的微型化細(xì)菌培養(yǎng)裝置。采用軟刻蝕工藝加工成微流控芯片。

微流控芯片頂層、中層與底層載玻片封接后形成圖3結(jié)構(gòu)；頂層的凹槽與中層的培養(yǎng)池吻合，培養(yǎng)池用于盛裝培養(yǎng)基，凹槽相當(dāng)于培養(yǎng)基的蓋子，凹槽內(nèi)的空間可以使培養(yǎng)基處于厭氧環(huán)境。所述微流控芯片頂層的兩個入口分別通過液體通道(內(nèi)徑的高為50μm；寬為150μm)和4列×4行的培養(yǎng)池相連通，每一列之內(nèi)的4個培養(yǎng)池通過液體通道連通；且通過液體通道的設(shè)置，使得按照同樣速度向入口加樣品的時候，相鄰列的樣品濃度呈梯度變化。

實施例2

芯片封接過程：

芯片各層經(jīng)高壓121℃滅菌30min。在無菌條件下完成芯片封接，首先將芯片的中層與下層分別經(jīng)過等離子處理，然后封接，再向培養(yǎng)池中加入液狀的特異性顯色培養(yǎng)基，所述液狀的特異性顯色培養(yǎng)基是指，培養(yǎng)基先經(jīng)過高溫高壓滅菌后，在其尚未冷卻時，所呈現(xiàn)的狀態(tài)為液體狀態(tài)(大約45℃以下)；待培養(yǎng)基冷卻凝固后將上層與中層等離子處理封接，制得完整芯片。封接后的芯片置于4℃保濕盒中儲存，使用前使用紫外燈照射芯片表面1h。

其中，所述的培養(yǎng)基種類分別為：第一行加入白色念珠菌鑒定培養(yǎng)基，第二行加入大腸桿菌鑒定培養(yǎng)基，第三行加入金黃色葡萄球菌鑒定培養(yǎng)基，第四行加入糞腸球菌培養(yǎng)基。

實施例3

本發(fā)明所述的微流控芯片在宮頸病原體的鑒定與藥敏實驗中的應(yīng)用

每次實驗前，首先向芯片的兩個入口，都注入無水乙醇并使之充滿整個液體通道，靜置10分鐘，然后用無菌蒸餾水沖洗芯片液體通道3次。

微量注射器和聚四氟乙烯毛細(xì)管在75％酒精中浸泡6h后，用滅菌蒸餾水沖洗3次，置于紫外燈下照射30min。

使用時，在超凈工作臺上將微量注射器與聚四氟乙烯毛細(xì)管連接。選取山楂核提取液作為藥敏實驗測試藥物，在濃度發(fā)生器的兩個入口，右側(cè)入口泵入山楂核提取液(25mg/mL)，另一孔泵入生理鹽水，二孔同時加樣，且加樣速度一致，使其通過液體通道的濃度發(fā)生器，分別經(jīng)由凹槽流至各個培養(yǎng)池。待全部培養(yǎng)池充盈后，將廢液孔中流出的多余藥液去除，從兩個入口同時加入待檢標(biāo)本，待檢標(biāo)本為采集的使用生理鹽水稀釋后的宮頸分泌物懸液，進(jìn)樣時，通過微量注射泵向毛細(xì)管中吸入1mL稀釋液，然后將毛細(xì)管與芯片進(jìn)樣通道連接，并以50μL/min流速灌注入芯片。待全部培養(yǎng)池充盈后，將廢液孔中流出的多余菌液去除，進(jìn)樣后將芯片置于含有一定濕度的便攜式培養(yǎng)裝置中，37℃培養(yǎng)18h。

實驗過程中，每2h使用佳能Lide 100掃描儀掃描微流控芯片一次并成像，掃描儀的設(shè)置為自定義分辨率600DPI的彩色照片。將得到的圖像載入到Photoshop CS5中讀取平均顯色強度值。軟件的圖像模式為灰度，并用矩形選擇工具選定顯色區(qū)域，讀取平均顯色強度值。

檢測結(jié)果：

第一行白色念珠菌鑒定培養(yǎng)基：呈綠色；第一列至第四列綠色顏色呈濃度梯度遞減，證明藥物濃度為0，病原體正常生長，并起到鑒定待檢標(biāo)本是否存在該病原體的作用，藥物濃度越高，病原體存活率越低。

第二行金黃色葡萄球菌鑒定培養(yǎng)基：呈藍(lán)綠色；第一列至第四列藍(lán)綠色顏色呈濃度梯度遞減，證明藥物濃度為0，病原體正常生長，并起到鑒定待檢標(biāo)本是否存在該病原體的作用，藥物濃度越高，病原體存活率越低。

第三行大腸桿菌鑒定培養(yǎng)基：呈黃色；第一列至第四列黃色顏色呈濃度梯度遞減，證明藥物濃度為0，病原體正常生長，并起到鑒定待檢標(biāo)本是否存在該病原體的作用，藥物濃度越高，病原體存活率越低。

第四行糞腸球菌培養(yǎng)基：呈粉紅色；第一列至第四列粉紅色顏色呈濃度梯度遞減，證明藥物濃度為0，病原體正常生長，并起到鑒定待檢標(biāo)本是否存在該病原體的作用，藥物濃度越高，病原體存活率越低。

以金黃色葡萄球菌作為質(zhì)控菌株，由于細(xì)菌初始數(shù)量與顯色時間存在相關(guān)性，在含有金黃色葡萄球菌鑒定培養(yǎng)基的芯片上分別接種系列濃度金黃色葡萄球菌，分別在培養(yǎng)2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24h檢測平均顯色強度，拍照結(jié)果顯示細(xì)菌顯色時間值與初始細(xì)菌密度相關(guān)(圖4)。根據(jù)圖4，可以判斷細(xì)菌初始濃度。在本實驗中，在培養(yǎng)2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24h后，可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程分別計算微流控通道中樣品的四種病原體的含量，從而判斷病原體對藥物的敏感性。

將本法應(yīng)用于臨床實際的宮頸標(biāo)本中病原體的同時測定。

本實驗比較了芯片和傳統(tǒng)病原體培養(yǎng)方法中細(xì)菌的生存率與增殖率，以金黃色葡萄球菌為例，在分別培養(yǎng)0，2，4，6，8，10，12、14、16、18、20、22、24h后，顯微鏡下計數(shù)結(jié)果顯示使用兩種方法培養(yǎng)的細(xì)菌數(shù)量在此階段均不斷增加，呈現(xiàn)指數(shù)增殖狀態(tài)，細(xì)菌生存率均為100％.芯片組細(xì)菌的增殖率總體上要高于培養(yǎng)瓶組，得益于芯片微小培養(yǎng)池中充足的養(yǎng)分和良好的氧氣供應(yīng)，

由于本實驗使用的細(xì)菌特異性顯色培養(yǎng)基種類有限，芯片方法細(xì)菌鑒定僅限于四種病原體，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明所述的技術(shù)方案，按照各自實際培養(yǎng)的病原菌種類，在不脫離本發(fā)明精神的前提下，在實驗中增加顯色培養(yǎng)基種類加以解決。