相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用

本申請(qǐng)要求在2014年11月21日提交的申請(qǐng)?zhí)枮?2/082,830，名稱為“biomoleculeextractionsystem”的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)，在此通過(guò)引用將其全部?jī)?nèi)容并入本文。

背景技術(shù)：

從用于測(cè)試的生物樣本中收集、提取和檢測(cè)核酸的現(xiàn)有系統(tǒng)和方法通常比較復(fù)雜，需要經(jīng)過(guò)專業(yè)培訓(xùn)的人員實(shí)施多個(gè)步驟，并且沒(méi)有針對(duì)處理大體積樣本而進(jìn)行優(yōu)化，也沒(méi)有針對(duì)防止樣本處理和穩(wěn)定運(yùn)輸中的交叉污染而進(jìn)行優(yōu)化。

各種體液，例如血液、血漿、血清、腦脊液(csf)、胸腔積液、腹水、尿液等都含有短鏈核酸(na)片段，即，無(wú)細(xì)胞核酸(cfna)或循環(huán)核酸(cna)。內(nèi)源性地源自于腫瘤或者“外源性地”源自于胎兒或者體內(nèi)病原性感染的改變的核酸可以以非常低的濃度作為外周血液中的cfna存在，并且是可檢測(cè)的，并且可以與正常的宿主cfna區(qū)分開(kāi)。從血漿或血清中提取足量的這些cfna用于測(cè)試需要處理相對(duì)較大體積的流體，這在臨床診斷環(huán)境中提出了不可避免的技術(shù)挑戰(zhàn)。因此，在該領(lǐng)域需要新的方法來(lái)應(yīng)對(duì)這些挑戰(zhàn)。

用于檢測(cè)例如結(jié)核病的示例性的這類方法在pct公開(kāi)申請(qǐng)wo2012135815(也由本申請(qǐng)的發(fā)明人發(fā)明)中進(jìn)行了描述，并且通過(guò)引用并入本文。然而，這樣的測(cè)試可能在世界上缺乏分析樣本中所使用的昂貴處理設(shè)備的地區(qū)是最有用的。因此，在本領(lǐng)域中需要一種收集系統(tǒng)和方法，其將允許從大體積的生物樣本中捕獲足量的核酸，以進(jìn)行后續(xù)分析、以防止來(lái)自環(huán)境和操作員的污染、以及保存和運(yùn)送核酸，使得可以使用相對(duì)便宜的設(shè)備在定點(diǎn)照護(hù)設(shè)施處收集核酸，然后以穩(wěn)定的形式運(yùn)送到中心地點(diǎn)進(jìn)行進(jìn)一步的處理和測(cè)定。

適用于從大體積生物流體中分離循環(huán)dna或rna的各種提取方法是已知的，例如在“circulatingnucleicacidhandbook”(第2版，2011年02月，qiagen)中描述的那些方法，以及基于第5,234,809(boom技術(shù))號(hào)美國(guó)專利的技術(shù)原理改進(jìn)而成的第8,685,742號(hào)美國(guó)專利中描述的旋轉(zhuǎn)柱提取方法。第5,346,994號(hào)美國(guó)專利描述了一種使用苯酚-氯仿的有機(jī)液體提取方法的技術(shù)。這些方法都可用于從例如血漿或血清樣本的大體積提取，但有機(jī)試劑是有毒的，這限制了其用途。不管洗脫還是沉淀，上述技術(shù)都需要高速離心機(jī)(>10000g)，以獲得提取的na給下游應(yīng)用。

另外，第7,897,378和8,158,349號(hào)美國(guó)專利描述了用于從較大樣本體積中純化或分離核酸的裝置和方法，包括系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含一對(duì)協(xié)作的中空體，樣本穿過(guò)所述中空體進(jìn)入收集容器，使核酸結(jié)合到所述中空體之一內(nèi)的結(jié)合材料。將含有保留樣本的中空體轉(zhuǎn)移到第一接收容器中進(jìn)行洗滌，然后將純化或分離的核酸洗脫并收集在第二接收容器中用于進(jìn)一步分析。也需要用高速離心機(jī)從固相基質(zhì)中洗脫結(jié)合的核酸。

例如，通過(guò)引用并入本文的第5,234,809號(hào)美國(guó)專利(boom)公開(kāi)了一種分離核酸的方法，其適用于多種不同用途。它描述了通過(guò)將含核酸的起始材料、離液緩沖液、以及結(jié)合dna的固相一起孵育來(lái)從所述起始材料中分離核酸的方法。如果需要，所述離液緩沖液影響所述起始材料的裂解和所述核酸與固相的結(jié)合。

本申請(qǐng)人的序列號(hào)為61/827,244的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)和序列號(hào)為us14/39,320的pct申請(qǐng)(“原始申請(qǐng)”)首次描述了新的生物分子提取系統(tǒng)，上述兩篇專利申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用并入本文。所述原始申請(qǐng)公開(kāi)了涉及用于處理生物樣本的方法和系統(tǒng)的發(fā)明，即裂解、結(jié)合、洗滌、穩(wěn)定和洗脫生物樣本的生物分子。一種實(shí)施方式包括用于收集核酸樣本的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括限定內(nèi)部容積的容器、用于所述容器的可移除蓋、與所述蓋中的樣本連接端口流體連通的連接接口、適于可移除地附接到所述容器蓋的連接接口的過(guò)濾柱、樣本收集容器、以及運(yùn)輸容器。公開(kāi)了該系統(tǒng)的各種其它部件。所述原始申請(qǐng)還公開(kāi)了收集核酸樣本的方法，該方法包括以下步驟：(a)提供本文所述的收集系統(tǒng)；(b)在所述樣本收集容器中收集一定體積的含樣本的流體；(c)通過(guò)所述樣本收集端口將所述樣本收集容器連接到所述容器；(d)使所述樣本收集容器中的一定體積的含樣本的流體穿過(guò)所述過(guò)濾柱，從而在所述基底上收集所述樣本，并在所述容器中收集提示物；(e)將所述運(yùn)輸容器的開(kāi)口端放置在所述過(guò)濾柱上，將所述過(guò)濾柱與所述運(yùn)輸容器接合，并且將所述過(guò)濾柱從所述容器蓋上拆下，以及(f)用所述可拆卸蓋臨時(shí)密封所述運(yùn)輸容器。所公開(kāi)的方法對(duì)于在最低配置的醫(yī)療設(shè)施(例如小型診所、遠(yuǎn)程診所和/或周邊診所)處理所收集的核酸特別有用，并將收集的樣本運(yùn)送到設(shè)備更好的中央實(shí)驗(yàn)室，以進(jìn)一步分析所收集的樣本來(lái)檢測(cè)疾病，例如檢測(cè)潛伏性結(jié)核病。

隨著分子技術(shù)的迅速發(fā)展，血漿、血清和其他體液中的循環(huán)無(wú)細(xì)胞核酸(na)的生物標(biāo)志物檢測(cè)作為較小侵入性的方法而變得新興起來(lái)，所述循環(huán)無(wú)細(xì)胞核酸分別包括無(wú)細(xì)胞dna和無(wú)細(xì)胞rna(cfdna和cfrna)，或者一起的(cfna或cna)，所述的方法用于產(chǎn)前遺傳異常、癌癥、實(shí)體器官移植排斥反應(yīng)和感染性疾病(如結(jié)核病)的早期發(fā)現(xiàn)的診斷和預(yù)后。然而，由于體液極不充裕，因此將cfna作為臨床分析物仍然面臨著各種技術(shù)問(wèn)題，這些技術(shù)問(wèn)題影響著cfna樣本的質(zhì)量、數(shù)量以及隨之產(chǎn)生的最終診斷結(jié)果。所述技術(shù)問(wèn)題包括：1)樣本收集/運(yùn)輸，2)樣本處理，和3)使用cfrna進(jìn)行疾病狀態(tài)監(jiān)測(cè)的潛在機(jī)會(huì)。

樣本收集/運(yùn)輸問(wèn)題

cfna的大多數(shù)可獲得的來(lái)源是外周血液中的血漿或血清(合稱為ps)。正常個(gè)體中cfna的血漿濃度非常低，在1.8-44ng/ml或約500-10000個(gè)基因組當(dāng)量/ml(ge/ml)的范圍內(nèi)。如果存在的話，ps中痕量的腫瘤衍生的cfna或循環(huán)腫瘤na(ctna)可能僅為每ml一至幾百個(gè)拷貝，或總cfna(4)的約0.005-0.01％。為了收集足夠的目標(biāo)ctna，通常需要大量的ps，即1-5ml。此外，即使從血液中釋放小百分比的細(xì)胞dna或rna也會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)cfna的下游分析困難。為了防止血細(xì)胞中的cfna降解和基因組na(gna)釋放，根據(jù)不同的方案，通常應(yīng)在靜脈注射后2小時(shí)、2-4小時(shí)或7小時(shí)內(nèi)分離ps與血細(xì)胞。分離通常需要1步或2步，在1000-2000g離心10分鐘，并且可選地5000-16000g。在血液凝固后通過(guò)簡(jiǎn)單離心分離血清可能更容易，但是可能由于凝血引起可預(yù)測(cè)程度的細(xì)胞裂解，這可能不會(huì)顯著影響最終分析。雖然血漿和血清中目標(biāo)ctdna的濃度大致相同，但注意到血清含有更多的大的gdna片段，可能是在凝血過(guò)程中從血細(xì)胞釋放出來(lái)的。

樣本收集的另一個(gè)問(wèn)題是溫度。從血細(xì)胞分離后的ps通常需要在-20℃(短時(shí)間)或-80℃(長(zhǎng)時(shí)間)下儲(chǔ)存。樣本收集站點(diǎn)，例如靜脈切開(kāi)術(shù)站點(diǎn)，并不總是靠近分子診斷設(shè)施。因此，在運(yùn)輸期間通常需要保持冷凍的ps低溫貯藏。斯特雷克公司(ne)開(kāi)發(fā)了新型的采血裝置，cell-freednabct^tm(bct)和cell-freernabct。它們防止細(xì)胞dna和rna釋放，并在環(huán)境溫度下穩(wěn)定血液中的cfdna和cfrna，分別持續(xù)長(zhǎng)達(dá)7天和2天。bct技術(shù)部分解決了分離延遲和運(yùn)輸條件的問(wèn)題。然而，如下所述，它仍然面臨著在分子診斷設(shè)備中進(jìn)行樣本處理的障礙。

樣本處理問(wèn)題

cfna測(cè)試的臨床應(yīng)用也受到樣本處理的影響，即，從大量相同流體中有效提取、富集和回收痕量的脆性cfna。通?；趦煞N方法從生物材料中提取和純化核酸：有機(jī)萃取和固相吸收。有機(jī)萃取，即，硫氰酸胍-苯酚/氯仿法，適用于大體積生物液體，如ps，但不適用于臨床實(shí)驗(yàn)室，因?yàn)樵噭┑亩拘院投啻蝿?dòng)手處理步驟?；赽oom技術(shù)的固相萃取已逐漸發(fā)展成兩種主要形式：柱(或旋轉(zhuǎn)柱)和磁珠技術(shù)?；驹硎歉叨葷饪s的離液劑破壞蛋白質(zhì)和脂質(zhì)復(fù)合物的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，使酶(包括dna和rna核酸酶)失活，并從結(jié)合的微結(jié)構(gòu)中釋放核酸(裂解)。將酒精加入到裂解物中有助于將游離核酸與吸收性基質(zhì)結(jié)合(結(jié)合)。在柱(旋轉(zhuǎn)柱)形式中，將結(jié)合裂解物的混合物加入到微量柱中，通過(guò)離心或真空流過(guò)多孔基質(zhì)(即，二氧化硅膜)?；旌衔镏械膁na或rna被吸收在基質(zhì)上，其余的(廢物)被除去。然后，通常進(jìn)行1-2個(gè)洗滌步驟以去除殘留污染物(洗滌)。最后，結(jié)合的核酸從基質(zhì)中釋放并通過(guò)離心收集到新管中(洗脫)。不容易實(shí)現(xiàn)旋轉(zhuǎn)柱操作的自動(dòng)化；然而，(qiagen)最近開(kāi)發(fā)了一種專門用于旋轉(zhuǎn)柱的自動(dòng)化儀器(qiacube)。用旋轉(zhuǎn)柱處理樣本通常需要，例如，用高速桌面型離心機(jī)重復(fù)離心四至五次。如果使用真空裝置的話，離心可以減少到一個(gè)步驟(洗脫)，但是仍然需要多次移液。旋轉(zhuǎn)柱通常設(shè)計(jì)用于處理小體積樣本，通常<300μl。一種流行的試劑盒，dnabloodmini試劑盒(dbm，qiagen)已廣泛用于從母體血液中提取胎兒cfdna或ctdna。據(jù)信，旋轉(zhuǎn)柱的體積容量限制了其在用于敏感性要求較高的研究的cfna提取中的用途。

另一個(gè)專門為cfna提取而設(shè)計(jì)的試劑盒是qiagen的循環(huán)核酸試劑盒(q-cna試劑盒)，其包含延伸管，如第8,685,742號(hào)美國(guó)專利中所述，其內(nèi)容通過(guò)引用并入本文。q-cna試劑盒具有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：1)對(duì)于樣本體積具有可擴(kuò)展的容量(1-5ml)，2)真空啟動(dòng)，特別是3)它被配制用于回收ps中的短cfna片段。在最近的嚴(yán)格比較研究中，使用q-cna試劑盒回收的短dna(115pb和461bp)比qiagen的dbm試劑盒(24)回收的短dna多3-4倍。盡管在腫瘤診斷和非侵入性產(chǎn)前檢測(cè)(nipt)中，采用q-cna試劑盒在定量pcr(qpcr)、數(shù)字pcr(dpcr)和下一代測(cè)序(ngs)應(yīng)用的cfna提取中日益普及，但是仍然存在幾個(gè)問(wèn)題阻止著它在臨床環(huán)境中被廣泛使用：1)多次重復(fù)移液步驟造成的可能的錯(cuò)誤移液和交叉污染的問(wèn)題；2)q-cna配置為與由真空泵供電的真空歧管qiavac^tm24plus(qiagen)一起使用，因此在操作中，樣本管暴露于空氣中并承受交替的負(fù)壓，因此可能會(huì)發(fā)生環(huán)境污染；3)此外，多孔二氧化硅膜上的不一致的流速和偶爾的結(jié)合裂解物的混合堵塞物可能導(dǎo)致不均勻的流動(dòng)和/或可能完全阻止流過(guò)；4)最后，為了洗脫固相結(jié)合的cna，高速離心仍然是不可避免的。因此，所有上述方法都需要一定的設(shè)備和電力供應(yīng)。

二氧化硅涂覆的磁珠(mb)技術(shù)是基于相同的原理，并具有與上述相似的步驟。柱形式中的吸收劑被固定在柱上，與此不同的是，磁珠被分散至裂解物中并用磁場(chǎng)收集。由于自動(dòng)化，mb處理操作相對(duì)容易。幾個(gè)制造商提供了針對(duì)特定需求量身定制的多種模型，但是它們中的大多數(shù)樣本體積容量限制為1毫升。

因此，仍然需要解決一個(gè)或多個(gè)上述問(wèn)題的系統(tǒng)和方法，改進(jìn)并提供在原始申請(qǐng)中描述的收集系統(tǒng)的替代性實(shí)施方式。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)方面包括用于收集生物分子的系統(tǒng)。在一種實(shí)施方式中，所述系統(tǒng)包括：提取器組件，其包括頂蓋、提取器芯、提取器芯適配器、具有內(nèi)部容積的提取器主體、以及底蓋環(huán)。所述頂蓋適于用所述底蓋環(huán)可拆卸地固定到所述提取器主體上，所述頂蓋具有內(nèi)側(cè)和外側(cè)，所述內(nèi)側(cè)面向所述提取器主體的內(nèi)部容積，所述外側(cè)背對(duì)所述提取器主體。所述頂蓋包括在所述內(nèi)側(cè)和外側(cè)之間連通的樣本連接端口，所述蓋在所述內(nèi)側(cè)和外側(cè)之間沒(méi)有其他的連通孔。所述樣本連接端口包括用于將其可釋放地鎖定到協(xié)作的第二互鎖部件的第一互鎖部件。所述蓋的內(nèi)側(cè)包括與所述樣本連接端口流體連通的連接接口。所述提取器芯適于可移除地附接到所述頂蓋的所述連接接口，并且具有敞開(kāi)的上游端、敞開(kāi)的下游端以及位于其間的內(nèi)部通道，所述內(nèi)部通道容納用于收集所述生物分子的基底。所述提取器主體具有第一開(kāi)口端和第二端，所述第一開(kāi)口端構(gòu)造成與所述頂蓋配合，所述第二端包括構(gòu)造成接納所述提取器芯適配器的開(kāi)口。所述提取器芯適配器具有上游開(kāi)口端、下游突起、下游開(kāi)口端以及所述上游開(kāi)口端和所述下游開(kāi)口端之間的內(nèi)部通道，所述上游開(kāi)口端用于與所述提取器芯的下游端配合，所述下游突起構(gòu)造成突出穿過(guò)所述提取器主體中的開(kāi)口。

所述系統(tǒng)還可以包括注射器和限定適于容納所述提取器芯的體積的運(yùn)輸容器，所述注射器包括第二互鎖部件，所述第二互鎖部件適于連接到所述頂蓋中的樣本收集端口的第一互鎖部件。所述運(yùn)輸容器適于可釋放地接合所述提取器芯以使其從所述頂蓋的連接接口分離，所述運(yùn)輸容器還包括用于將提取器芯暫時(shí)密封在該運(yùn)輸容器內(nèi)的可拆卸蓋。

所述收集系統(tǒng)還可以包含一個(gè)或多個(gè)樣本處理試劑緩沖液，例如裂解緩沖液、結(jié)合緩沖液、洗滌緩沖液和洗脫緩沖液，或廢物收集容器，這些容器中的一個(gè)或多個(gè)包括具有可膨脹體積的柔性容器。例如，柔性容器可以是塑料袋，其可以進(jìn)一步具有整合到所述袋中的一個(gè)或多個(gè)剛性加強(qiáng)件，以給所述袋提供結(jié)構(gòu)強(qiáng)度，例如提供足夠的結(jié)構(gòu)以使柔性容器在充滿或部分填充液體時(shí)保持在豎直位置的剛性加強(qiáng)件。特別地，一個(gè)或多個(gè)所述柔性容器可以包括樣本處理容器，所述樣本處理容器具有密封蓋和蓋中的開(kāi)口，所述開(kāi)口的尺寸被設(shè)置成接收穿過(guò)所述密封蓋插入且與所述柔性容器的內(nèi)側(cè)流體連通的一段長(zhǎng)度的管子。所述穿過(guò)柔性容器的密封蓋插入的一段長(zhǎng)度的管子可以具有第一端和第二端，所述第一端設(shè)置在所述柔性容器的內(nèi)部，所述第二端包括第一互鎖部件，所述第一互鎖部件適于連接到所述注射器的所述第二互鎖部件。所述密封蓋中的開(kāi)口可以進(jìn)一步設(shè)計(jì)成接收所述提取器適配器的下游端。

所述收集系統(tǒng)可進(jìn)一步包括驅(qū)避劑。從多孔基底中洗脫被吸收的核酸的現(xiàn)有技術(shù)程序需要首先在所述基底上加入少量的洗脫緩沖液以從所述基底釋放結(jié)合的核酸，然后再通過(guò)高速離心或空氣吹掃來(lái)收集所述洗脫液。高速離心需要昂貴的離心機(jī)和電力供應(yīng)。空氣吹掃可能會(huì)導(dǎo)致樣本顯著損失。一種方法包括首先在所述基底上加入洗脫緩沖液，然后將疏水性驅(qū)避劑注射到所述提取器芯中，這種方法導(dǎo)致大部分釋放的核酸的水性的洗脫緩沖液從多孔基底中排出，從而使其容易收集。

本發(fā)明的另一方面包括收集生物分子樣本的方法。所述方法包括以下步驟：提供如本文所討論的用于收集生物分子的所述系統(tǒng)，然后在所述注射器中收集一定體積的含樣本的液體，通過(guò)所述樣本收集端口將所述注射器連接到所述提取器組件，并將所述提取器適配器的下游端連接到所述樣本處理容器的密封蓋，并將來(lái)自所述注射器的含有樣本的液體的體積穿過(guò)所述提取器芯，從而在所述基底上收集所述樣本，并在所述樣本處理容器中收集提示物。使來(lái)自所述注射器的含樣本液體的體積穿過(guò)所述提取器芯的步驟可選地重復(fù)一次或多次，并且該方法還可以包括可選地實(shí)施一次或多次洗滌步驟。所述方法可以進(jìn)一步包括以下步驟：在提取器芯的基底上收集樣本之后，通過(guò)驅(qū)避劑洗脫再水化的樣本；或?qū)⑺鲞\(yùn)輸容器的開(kāi)口端放置在所述提取器芯上，將所述提取器芯與所述運(yùn)輸容器接合，并將所述提取器芯從所述頂蓋分離，并用所述可拆卸蓋臨時(shí)密封所述運(yùn)輸容器。因此，該系統(tǒng)可以消除對(duì)用于樣本處理的特殊設(shè)備和電力的需要，使其更適合在農(nóng)村或遠(yuǎn)程護(hù)理點(diǎn)(poc)設(shè)置中使用。然后，所述運(yùn)輸容器可以在周圍無(wú)氣候控制的條件下運(yùn)輸，此后該方法還可以包括處理收集在所述提取器芯中的生物分子，以檢測(cè)疾病或感染性病原體，例如深層感染，例如，結(jié)核病，特別是潛伏性結(jié)核病。

附圖說(shuō)明

圖1a示出了示例性容器蓋的透視側(cè)視圖。

圖1b示出了圖1a的示例性容器蓋的橫截面圖。

圖2示出了示例性過(guò)濾柱。

圖3示出了圖2的示例性過(guò)濾柱/提取器芯的橫截面。

圖4是展示了圖2的過(guò)濾柱和圖1a-1b的容器蓋如何彼此連接的分解圖，其與圖9a-9b的提取器芯和圖8a-8c的頂蓋的連接相同。

圖5示出了附接到示例性容器的、圖1a-1b的容器蓋。

圖6a示出了新實(shí)施方式的示例性運(yùn)輸容器底部部分。

圖6b示出了圖6a的示例性運(yùn)輸容器如何套在示例性過(guò)濾柱或提取器芯上，以使其從示例性容器蓋或頂蓋旋出。

圖6c是示例性運(yùn)輸容器頂部的橫截面圖。

圖6d是被圖6c的示例性運(yùn)輸容器頂部密封的、圖6a的示例性運(yùn)輸容器底部部分的橫截面圖。

圖6e是圖6d的密封運(yùn)輸容器的立體圖。

圖7a示出了在示例性提取系統(tǒng)中使用的示例性注射器。

圖7b示出了在示例性提取系統(tǒng)中使用的示例性提取器組件。

圖7c和7d分別示出了用于示例性提取系統(tǒng)的示例性樣本處理/含有試劑的塑料袋的透視俯視圖和縱向剖視圖。

圖8a-8c分別示出了示例性提取器組件的示例性頂蓋的透視俯視圖、側(cè)視圖和透視仰視圖。

圖9a-9c分別示出了示例性提取器芯的透視俯視圖、縱向剖視圖和透視仰視圖。

圖10a-10c分別示出了示例性提取器芯適配器的透視俯視圖、側(cè)視圖和透視仰視圖。

圖11a-11c分別示出了示例性提取器主體的透視俯視圖、側(cè)視圖和透視仰視圖。

圖12a-12c分別示出了示例性底蓋環(huán)的透視俯視圖、縱向剖視圖和透視仰視圖。

具體實(shí)施方式

原始申請(qǐng)中所公開(kāi)的系統(tǒng)

在原始申請(qǐng)中描述的示例性系統(tǒng)包括容器，例如圖5的容器400，其定義了內(nèi)部容積。雖然以示例性幾何形式示出，本發(fā)明不限于容器的任何特定尺寸和形狀。如本文稍后討論的，在一個(gè)改進(jìn)的實(shí)施方式中，所述容器可以包括柔性袋，如圖7c和7d所示。在原始申請(qǐng)中描述的實(shí)施方式具有可移除蓋101，例如圖1a-1c所示的示例性實(shí)施方式，其具有面向所述容器的內(nèi)部容積的內(nèi)側(cè)107和背對(duì)內(nèi)部容積的外側(cè)102。圖1a示出了所述蓋的外側(cè)。所述蓋具有通過(guò)通道106連通所述內(nèi)側(cè)和外側(cè)的通氣端口105，例如公魯爾滑動(dòng)連接，以及通過(guò)通道104連通所述內(nèi)側(cè)和外側(cè)的樣本連接端口103。在與本文稍后討論的原始申請(qǐng)的系統(tǒng)的改進(jìn)相比，頂蓋900基本上與頂蓋101相同，但沒(méi)有通氣端口105。所述樣本連接端口包括第一互鎖部件，例如魯爾鎖連接件120，用于將所述樣本連接端口可釋放地鎖定到諸如注射器的樣本轉(zhuǎn)移容器(未示出)的協(xié)作的第二互鎖部件。端口120和105都可以通過(guò)魯爾適配蓋或插頭(未示出)容易地打開(kāi)或關(guān)閉。當(dāng)向連接到端口120的注射器的柱塞施加向下的壓力以迫使液體移動(dòng)時(shí)，打開(kāi)端口105以允許移動(dòng)的空氣離開(kāi)容器400。當(dāng)使用真空來(lái)強(qiáng)制來(lái)自連接的源頭(其仍然可能是注射器)的液體移動(dòng)時(shí)，所述端口105連接到真空源。所述蓋的內(nèi)側(cè)包括與所述樣本連接端口103流體連通的連接接口108。雖然在所述蓋和容器之間可以使用任何連接方式，但是所述蓋可以帶有陰螺紋110，用于螺紋連接到具有陽(yáng)螺紋(未示出)的容器上。如將在下文中討論的那樣，所述系統(tǒng)的改進(jìn)使用具有可膨脹體積的柔性容器7c和7d，而不是剛性的不可膨脹容器400，這樣消除了對(duì)通氣端口105的需要。

內(nèi)部具有固相萃取基質(zhì)(例如硅膠膜、燒結(jié)多孔玻璃料或玻璃纖維濾紙)的過(guò)濾柱，例如圖2和3所示的示例性過(guò)濾柱200，適于可移除地附接到所述容器蓋的連接接口。例如，如圖1c所示，所述連接接口108可以具有與過(guò)濾柱200上的陽(yáng)螺紋220配合的陰螺紋109。所述過(guò)濾柱具有開(kāi)口端202和204，以及其間的內(nèi)部通道206，其內(nèi)部包含用于收集核酸的基底212。所述過(guò)濾柱也可以稱為“中空體”，因?yàn)樗辉O(shè)計(jì)成使流體通過(guò)，而不會(huì)使流體以保留在容器中的方式留在過(guò)濾柱中。所述過(guò)濾柱基底212可以鄰近多孔玻璃料214，并且保持環(huán)210可以產(chǎn)生緊貼所述柱的內(nèi)部的摩擦接合，以將基底和玻璃料保持在與過(guò)濾柱的頸部相鄰的位置。至少就與所述頂蓋的連接接口配合的陽(yáng)螺紋和相對(duì)于所述基底、玻璃料和保持環(huán)而言，后面將要詳細(xì)描述的提取器芯300可以基本上與過(guò)濾柱200相同。

基底212可以包括柱結(jié)合基質(zhì)，所述基質(zhì)包含允許流體穿過(guò)所述基質(zhì)的固體基質(zhì)。在某些方面，所述基質(zhì)是高度多孔的，以便使暴露于緩沖溶液的表面積最大化，從而使所述基質(zhì)的結(jié)合能力最大化。所述基質(zhì)可以由各種材料制成。在某些具體實(shí)施方式中，所述結(jié)合基質(zhì)可以是二氧化硅材料(主要由sio2形成)，例如玻璃纖維、二氧化硅珠、硅膠、燒結(jié)多孔玻璃料等。已知許多商業(yè)提供者的二氧化硅基質(zhì)，例如，例如，由whatman(nj)生產(chǎn)的gf/a、gf/b、gf/c、gf/d和gf/f玻璃纖維過(guò)濾器。這種過(guò)濾器已知特別用于核酸分子的純化。在其它實(shí)施方式中，可以應(yīng)用各種固體基質(zhì)，例如適于某些生物分子的提取和分離的離子交換基質(zhì)、親和力基質(zhì)和表面改性的基質(zhì)。所述結(jié)合基質(zhì)可以是被核酸結(jié)合材料的顆?；蚶w維嵌入的任何材料。所述基質(zhì)材料通常對(duì)液體而言是可滲透的，使得樣本可以通過(guò)所述基質(zhì)，核酸與核酸結(jié)合材料接觸并結(jié)合核酸結(jié)合材料，樣本的其它組分可以離開(kāi)所述基質(zhì)。所述結(jié)合基質(zhì)可以包括本領(lǐng)域已知的任何支撐材料，包括選自下組的材料：硅質(zhì)材料、硅膠、玻璃、沸石、氧化鋁、二氧化鈦、二氧化鋯、高嶺土、凝膠狀二氧化硅、磁性顆粒、燒結(jié)體多孔玻璃料、以及陶瓷或聚合物支撐材料。所述核酸結(jié)合材料可以是核酸在某些條件下結(jié)合(通常非共價(jià))的任何材料，而樣本中的其它物質(zhì)在這些條件下不結(jié)合。核酸結(jié)合通常是可逆的，使得核酸可以隨后通過(guò)改變條件從材料中再次洗脫。

在一個(gè)實(shí)施方式中，柱200的幾何形狀可以與可由bocascientific(fl)獲得的mobicol柱類似，或者可以是其特別修改或特別制造的版本。具有這種幾何形狀的設(shè)計(jì)可以在微量離心機(jī)中離心，并允許用注射器容易地處理大體積的樣本。多孔玻璃料214可以包括孔徑為10-90μm的惰性塑料。固體提取基質(zhì)(基底)可以包括gf/d過(guò)濾紙(whatman，nj)，例如通過(guò)將過(guò)濾紙沖壓成適合于所述柱的內(nèi)部直徑的圓盤制成?？梢詫蓪踊蚨鄬舆^(guò)濾盤放在玻璃料的頂部。可以在過(guò)濾盤的頂部放置支撐環(huán)(ring-store，wa)(如圖2所示)，例如由ptfe(例如)或例如聚乙烯(pe)或聚丙烯(pp)的塑料制成的環(huán)，以防止過(guò)濾盤移動(dòng)。提取器芯300中存在類似的內(nèi)部組件。

開(kāi)啟器和運(yùn)輸容器，例如圖6e中的完全組裝構(gòu)造中所描繪的示例性容器650，包括底部部分600和適配的頂部部分610。所述相配合的底部部分和頂部部分限定了適于容納用于運(yùn)輸?shù)倪^(guò)濾柱的體積。運(yùn)輸容器的底部600具有敞開(kāi)的頂部，并且適于可釋放地接合所述過(guò)濾柱，以將其從容器蓋的連接接口上拆下。例如，過(guò)濾柱可以具有圖2所示的突片222或圖6b所示的凸片362，或提取器芯300可以具有如圖9c所示的突片360，其中任一個(gè)被配置為與圖6a的切口602接合。所述封閉的運(yùn)輸容器與周圍環(huán)境隔絕，以防止可能導(dǎo)致核酸(特別是rna)加速降解(水解)的污染和水分。所述封閉的運(yùn)輸容器可以進(jìn)一步包括預(yù)先包裝的干燥劑，例如顆粒狀或串珠形狀的硅膠，以產(chǎn)生或維持其內(nèi)的干燥(脫水)狀態(tài)，例如在圖6c和6d的容器的上部中所示的干燥劑612。干燥劑的位置也可以在容器的下部，并且不限于任何特定的位置或構(gòu)型。干燥劑可以包括本領(lǐng)域已知的用于提供和維持干燥的任何合適的材料，例如但不限于蒙脫石粘土、氯化鋰、活性氧化鋁、堿鋁硅酸鹽、dq11塊狀硅膠、硅膠、分子篩、硫酸鈣、或氧化鈣。干燥劑可含有水分指示劑，當(dāng)干燥劑從無(wú)水(干)轉(zhuǎn)變?yōu)樗?濕)狀態(tài)時(shí)，水分指示劑逐漸改變顏色，例如對(duì)于一些硅膠是已知的。

盡管用魯爾鎖定配件示出了從所述蓋的外側(cè)突出的樣本連接端口，但是本發(fā)明不限于任何特定類型的互鎖連接，也不限于樣本連接端口的任何特定配置。盡管樣本連接端口和樣本容器之間的一些類型的鎖定接合是優(yōu)選的，但是可以提供任何類型的可逆鎖定接合。所述樣本轉(zhuǎn)移容器未示出，但可以是具有配合的魯爾鎖配件的標(biāo)準(zhǔn)注射器。因此，在一個(gè)示例性方法中，注射器與容器蓋互鎖，并且在所述注射器的柱塞被壓下以迫使包含核酸的溶液在存在諸如離液劑和酒精之類的結(jié)合試劑的情況下通過(guò)過(guò)濾柱。因此，核酸被保留在過(guò)濾器212上，同時(shí)濾液進(jìn)入容器400。如上所述，在具有剛性容器400和通氣端口105的實(shí)施方式中，注射器柱塞可以手動(dòng)壓下，端口105打開(kāi)，或者真空源可以附接到端口105，使得當(dāng)從注射器清空溶液時(shí)，真空使得注射器柱塞被壓下。

離液劑在本領(lǐng)域中作為改變蛋白質(zhì)或核酸的二級(jí)、三級(jí)和/或四級(jí)結(jié)構(gòu)但至少不影響其一級(jí)結(jié)構(gòu)的物質(zhì)是眾所周知的。實(shí)例是硫氰酸胍、鹽酸胍、nai、ki、硫氰酸鈉或這些物質(zhì)的組合。離液劑會(huì)擾亂液態(tài)水的有序結(jié)構(gòu)，使dna或rna從該水溶液與玻璃表面結(jié)合。在某些條件下，加入醇，如乙醇或異丙醇，可促進(jìn)na與表面結(jié)合。如nacl、kcl或cacl2的物質(zhì)可能存在于溶液中，以便改變離子強(qiáng)度。dna和rna可以在離液條件下結(jié)合到玻璃表面的性質(zhì)被用來(lái)將它們從含有其他生物材料的溶液中分離出來(lái)。在結(jié)合步驟之后，可以應(yīng)用洗滌和清潔緩沖液來(lái)除去污染物。與玻璃表面的結(jié)合是可逆的，例如，如果離液劑的濃度降低或完全除去離液劑，則可以再次洗脫dna或rna。洗脫緩沖液可以是純的、不含dnase/rnase的水，或含有低濃度tris(羥甲基)-氨基甲烷和edta(乙二胺四乙酸)(通常分別為5-10mm和50-100μm)的緩沖液。通常，洗脫緩沖液(eb)的體積在50-200μl的范圍內(nèi)。

現(xiàn)有技術(shù)方法通常使用高速離心從過(guò)濾柱收集洗脫液。為了盡可能多地從多孔基質(zhì)中回收洗脫液，通常需要高速離心機(jī)，即相對(duì)離心力(rcf)>10,000g。或者，在一些情況下也可以采用重復(fù)的空氣吹掃，但只有一部分水溶液被回收。在本發(fā)明的收集方法的一種實(shí)施方式中，采用疏水性驅(qū)避劑來(lái)手動(dòng)收集洗脫液，而不需要電力和設(shè)備。合適的疏水性驅(qū)避劑優(yōu)選具有以下特征：高疏水性、低粘度、低于特定密度(即<1，低于水的密度)、低表面張力和高鋪展性、與水相不混溶、不揮發(fā)、與普通塑料(或至少與本文所述系統(tǒng)中使用的塑料)相容、化學(xué)惰性并且無(wú)毒。令人驚訝的是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一組聚二甲基硅氧烷(pdms、硅油或硅液)可以滿足所有這些要求。聚二甲基硅氧烷的粘度取決于其聚合度，即，聚合度越低，粘度越低。pdms是極好的驅(qū)避劑。

在一種示例性方法中，當(dāng)組裝和連接如圖4所示的部件101和200時(shí)，或者組裝如圖7b所示的提取器組件10的部件410、500、900和800時(shí)，樣本收集后，通過(guò)端口103將少量的洗脫緩沖液(例如50-200μl)加到多孔基底上，水性eb被快速吸收到多孔基質(zhì)中。之后，通過(guò)緊密連接到端口103的注射器垂直注入一定體積的pdms，例如0.2至1ml。疏水pdms具有比水性eb更小的密度。因此，在緩慢注射的過(guò)程中，包括附著于多孔基質(zhì)表面的痕量水性eb在內(nèi)的水性eb被pdms置換，并通過(guò)重力從出口204洗出。此外，可以將針附接到出口204，從而可以更精確地收集洗脫液。由于疏水性pdms的表面張力非常低，疏水性pdms可以迫使水性洗脫液在收集管的底部形成單個(gè)片段，其與pdms的上層由清楚的邊界分開(kāi)。合適的低粘度pdms包括由clearcoproductsco.，inc.(pa)公司提供的psf-5、10和20cst純硅油(puresiliconefluids)。

所述原始申請(qǐng)公開(kāi)了還包括真空室(未示出)的收集系統(tǒng)實(shí)施方式。這里描述的新實(shí)施方式的改進(jìn)避免了對(duì)頂蓋上的真空室和通氣端口的需要，從而使處理樣本所需的設(shè)備的總量最小化。

新實(shí)施方式附加詳情

本發(fā)明的示例性生物分子提取器用于從含有生物分子，特別是大分子如核酸、蛋白質(zhì)脂質(zhì)、多糖的大體積流體中濃縮和提取生物分子。所述提取基于固相萃取(spe)。通常，spe包括具有目標(biāo)生物分子的移動(dòng)系統(tǒng)(液相)和包含表面的固定相(固相)，所述表面包含與目標(biāo)分子具有高親和力的官能團(tuán)。在典型的方法中，由正壓或負(fù)壓或簡(jiǎn)單地通過(guò)重力驅(qū)動(dòng)的液相穿過(guò)多孔固體基質(zhì)，所述多孔固體基質(zhì)包含具有官能團(tuán)的表面，并且目標(biāo)生物分子通?？赡娴匚栈蚪Y(jié)合官能團(tuán)，并在隨后的步驟中從基質(zhì)中洗脫出來(lái)。

示例性的提取器裝置系統(tǒng)具有以下特征：1)基本上無(wú)污染的封閉系統(tǒng)；2)配置為便攜且手動(dòng)處理的提取操作，包括無(wú)儀器無(wú)電力操作的能力；3)配置為允許處理大體積的(例如1-5ml)生物流體，使得血漿、血清和其他體液中的低豐度分子濃縮高達(dá)100倍，所述低豐度分子為，例如，腫瘤的片段dna和rna的無(wú)細(xì)胞循環(huán)核酸、諸如tb(結(jié)核桿菌)的病原體、和胎兒dna；4)配置為使分子(例如核酸，特別是rna物質(zhì))穩(wěn)定，以使得樣本在周圍環(huán)境條件下運(yùn)輸；5)配置為在不離心的情況下洗脫所提取的核酸；6)配置為在設(shè)備中進(jìn)行樣本的無(wú)病原體處理，來(lái)為下游應(yīng)用準(zhǔn)備樣本，在核酸的情況下，例如為pcr、定量pcr(qpcr)、數(shù)字pcr(dpcr)、微陣列和下一代測(cè)序(ngs)準(zhǔn)備樣本。

如圖7a-7d所示的示例性提取系統(tǒng)包括提取器組件10(圖7b)(優(yōu)選塑料)、一組多個(gè)樣本處理/含有試劑的袋子(圖7c，7d)(優(yōu)選塑料)、以及用于所述提取器芯的分離和運(yùn)輸?shù)谋Ｗo(hù)容器(圖6a-6f，如上面所詳細(xì)討論的)。該系統(tǒng)還適用于與用于其操作的一個(gè)或多個(gè)注射器一起使用，或可包括用于其操作的一個(gè)或多個(gè)注射器(圖7a)。

所述示例性提取器組件10具有五個(gè)部件：(1)頂蓋900(圖8a-8c)；(2)提取器芯300(圖9a-9c)(與原始申請(qǐng)的公開(kāi)內(nèi)容中提及的“過(guò)濾柱”基本相同)；(3)從所述提取器芯延伸的提取器芯適配器410(圖10a-10c)；(4)提取器主體500(圖11a-11c)；和(5)底蓋環(huán)800(圖12a-12c)。所述頂蓋，如圖8a-8c所示，在其外部頂部上具有鎖連接器902(諸如母魯爾鎖連接器)，其適于連接到塑料的一次性注射器。所述頂蓋900進(jìn)一步構(gòu)造成在設(shè)置在頂蓋內(nèi)側(cè)的提取器芯容納構(gòu)件910上可拆卸地接收提取器芯300(例如用螺釘連接)。除了頂蓋900沒(méi)有通氣端口，所述頂蓋900基本上與圖1a-1c所示的以及原始申請(qǐng)中描述的可拆卸蓋101相同，并且蓋中除了樣本端口902之外沒(méi)有提供連通所述蓋的內(nèi)表面和外表面之間的其它開(kāi)口。因此，除了沒(méi)有通氣端口105，所述頂蓋900縱向截面與圖1b中的蓋101大致相同。

如圖9a-9c所示的提取器芯具有兩個(gè)連接器：用于連接到頂蓋900的接收構(gòu)件910的上游連接器310，使得所述提取器芯與由頂蓋上的陰鎖定連接器902限定的通道流體連通；以及下游連接器320(例如魯爾滑動(dòng)公連接器)，其被配置為連接到所述適配器410。所述提取器芯300在其內(nèi)部包括固定的多孔固體吸收性基質(zhì)340。如圖9b所示，在一種實(shí)施方式中，支撐環(huán)330將吸收性基質(zhì)340設(shè)置在多孔玻璃料350的頂部上。所述提取器芯的外表面具有一個(gè)或多個(gè)構(gòu)件，例如突片360和插入突片之間的槽364，用于相配合的一組突片和槽，以提供用于接收扭矩的機(jī)構(gòu)，施加扭矩以旋轉(zhuǎn)提取器芯300，將其與頂蓋900中的接收構(gòu)件910分離。例如，如圖6a和6b所示的示意性實(shí)施方式所示，保護(hù)容器600具有單個(gè)槽602，用于接收提取器芯300上的突片362。應(yīng)當(dāng)理解，與單個(gè)突片和匹配的槽不同的是，每個(gè)保護(hù)容器600和提取器芯300中都可以具有多個(gè)互相嚙合的突片和槽，其設(shè)計(jì)成嚙合在一起，例如圖9a和圖9c所示的多個(gè)均勻間隔的突片360。

所述適配器410，如圖10a-10c所示，適于在其上游連接器(例如魯爾滑動(dòng)母連接器420)附接到提取器芯的下游連接器320時(shí)作為提取器芯的延伸部進(jìn)行操作。所述適配器還包括延伸的下游連接器430，例如延伸的魯爾鎖母連接器，其遠(yuǎn)離提取器主體延伸。所述提取器主體500，如圖11a-11c所示，是管狀容器。當(dāng)提取器芯300牢固地附接到頂蓋900的內(nèi)部910時(shí)，其中適配器410連接到提取器300的下游連接器320，組裝的組件被配置成插入提取器主體500并與提取器主體500配合，如圖7b所示，適配器延伸的下游連接器430(即魯爾鎖母端)延伸穿過(guò)提取器主體的底孔530，使得連接器430延伸到提取器主體500的外部。所述提取器主體的內(nèi)底部具有圓形脊540，其與所述適配器底部上的圓形脊440配合。

替代地，通過(guò)較小的修改，魯爾鎖公連接器可以代替適配器410的母魯爾鎖端。本發(fā)明不限于魯爾鎖連接器，也不限于所指示的位置中的公或母連接器。在每種情況下，可以使用其他類型的連接器，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，可以以較小的修改將公連接器和母連接器彼此替代。在一些實(shí)施方式中，提取器主體底部的內(nèi)部圓形脊和適配器底部的圓形脊可以具有一個(gè)或多個(gè)構(gòu)件，例如配合凸緣，凹部和/或突片，彼此相對(duì)，防止當(dāng)接合時(shí)適配器相對(duì)于提取器主體的旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)(圖10a-10c或11a-11c中未示出)。在提取器主體的外壁上，如下面進(jìn)一步描述的，圓形脊部550可用作接合提取器主體與頂蓋和底蓋環(huán)的止擋件。所述底蓋環(huán)，如圖12a-12c所示，包括在其內(nèi)壁上的內(nèi)螺紋接頭，并且適于從底部通過(guò)提取器主體，以使提取器主體的外壁上的脊部550與所述蓋環(huán)800的內(nèi)表面850接合，并且使頂蓋的陽(yáng)螺桿螺紋960與其陰螺紋配件860接合，以便當(dāng)如本文所述的整個(gè)組件牢固地連接在一起并且正在進(jìn)行時(shí)，最小化或消除液體泄漏。

如圖7c和7d所示，可以進(jìn)一步提供一組樣本處理容器/試劑容器/廢物收集容器。所述袋子包含不同的試劑，例如裂解緩沖液(lb)、結(jié)合緩沖液(bb)、洗滌緩沖液(wb)、清潔緩沖液(cb)、洗脫緩沖液(eb)和本文進(jìn)一步描述的驅(qū)避液(rf)。所述容器的容量可以從50ml到2ml變化，這取決于操作所需的試劑的量。所述容器通常是柔性的，例如由聚乙烯(pe)、聚丙烯(pp)、聚氯乙烯(pvc)和/或乙酸乙烯酯(eva)制成的袋。代表性的試劑/樣本處理容器由lb袋(圖7c和7d)舉例說(shuō)明。所述lb袋具有約50ml容量并且具有圓柱形形狀。所述袋的內(nèi)壁包含四個(gè)剛性脊706，這有助于提供更多的結(jié)構(gòu)來(lái)使得柔性袋能夠在處理樣本時(shí)保持在直立位置。該示例性袋具有圓形密封蓋702以及所述蓋上的管道溝704，使得管道708可以插入以與所述袋的內(nèi)部流體連通。所述管道的另一端可以包括可直接連接到注射器(例如魯爾鎖注射器)的接頭(未示出)，例如魯爾鎖母連接器，以通過(guò)注射器注射接收液體樣本，例如血漿、血清、或其他生物流體。所述lb袋包含預(yù)加載的裂解緩沖液。所述生物流體與袋中的裂解緩沖液混合，并且還可以在水浴或加熱塊中孵育以加速?gòu)钠渌飶?fù)合物釋放核酸。所述lb袋的圓環(huán)形狀適于裝配在通常使用的50ml離心管架或加熱塊中。完成裂解處理后，將結(jié)合緩沖液從bb袋轉(zhuǎn)移至lb袋，通過(guò)用注射器從bb袋中抽出并注射到lb袋中。在通過(guò)重復(fù)注射器從lb袋抽出再注射入lb袋的混合后，將裂解物和結(jié)合緩沖液的混合物吸入注射器中，然后將注射器連接到提取器組件10的頂蓋900頂部的(例如魯爾鎖母)連接器970上，然后提取器組件底部的魯爾鎖母連接器(即，適配器410的下游連接器470)，例如通過(guò)魯爾鎖公-公適配器(未顯示)，被連接到lb袋。通過(guò)按壓注射器柱塞，將混合物注入提取器中，穿過(guò)固體吸收性基質(zhì)，任何未被捕獲的液體流回lb袋中。在這些情況下，目標(biāo)分子片段短的dna或rna被吸收在固體基質(zhì)的表面上。

使用袋子或其他柔性容積的容器作為收集容器具有一些優(yōu)點(diǎn)，包括在收集系統(tǒng)上使用非通氣蓋的能力。由于袋具有柔性容積，因此可以在袋中保留足夠的容積以容納有意引入注射器中的少量空氣(例如1-5ml)，以跟隨通過(guò)提取器的每一液體體積。這種少量的空氣有助于在注射器中的液體首次排出之后從多孔基質(zhì)中的殘余液體中驅(qū)除空氣。因此，所述收集袋或其他柔性容積的容器可以被設(shè)計(jì)成具有足夠量的保留容積，以適應(yīng)不僅在處理期間要添加到袋中的任何預(yù)期量的液體，而且還可以在整體處理過(guò)程中預(yù)期的注射器引導(dǎo)步驟期間引入任何預(yù)期量的額外空氣數(shù)量。此外，柔性容積的容器使連接的注射器-提取器-容器系統(tǒng)成為可能，其中的三部分(注射器、提取器和柔性容積的容器)形成封閉連接，而不與周圍環(huán)境相通。當(dāng)注射器將液體推入或從柔性容器中吸入液體時(shí)，柔性容器的體積被改變，而不需要分配封閉系統(tǒng)外部的液體或空氣或?qū)⑼獠靠諝馕敕忾]系統(tǒng)。因此，與開(kāi)放系統(tǒng)相比，該封閉系統(tǒng)布置更好地最小化或防止了污染。該系統(tǒng)還允許液體雙向流動(dòng)，因此提取過(guò)程可以重復(fù)多次以實(shí)現(xiàn)最大效率。

通過(guò)流速的控制以及通過(guò)反復(fù)抽吸和注射幾次(2-10次)，所述目標(biāo)分子有多次機(jī)會(huì)與吸收性基質(zhì)相互作用，從而將短核酸從大體積的裂解物中的回收最大化。在完成提取過(guò)程之后，將lb袋從提取器組件(例如從可選的魯爾鎖公-公適配器)上分離出來(lái)。所述提取器組件上的適配器依次連接到洗滌緩沖液袋和清潔緩沖液袋，重復(fù)用較小的新的注射器抽吸和注射(洗滌和清潔緩沖液的體積比樣本和結(jié)合-裂解緩沖液混合物的體積小很多，大約幾毫升)。再次，重復(fù)地抽吸和注入洗滌緩沖液和清潔緩沖液使其通過(guò)提取器可以幫助更有效地從吸收性基質(zhì)中去除污染物，以使這些各種污染物顯著影響下游應(yīng)用的可能性最小化。

在完成提取、洗滌和清潔之后，可以通過(guò)以下步驟從提取器組件移除提取器芯：(1)使魯爾鎖公-公適配器與從提取器組件10突起的擴(kuò)展連接器470分離；(2)擰下底蓋環(huán)800；(3)從提取器主體500上取下頂蓋900；(4a)利用保護(hù)容器600將提取器芯300從頂蓋900的接收構(gòu)件910上分離，并用蓋610密封所述保護(hù)容器(如在原始申請(qǐng)中更詳細(xì)地描述的)；(4b)替代地，通過(guò)吸移加入洗脫緩沖液，然后通過(guò)頂蓋900的入口注射驅(qū)避液(rf)以立即洗脫。因此，提取器芯(其吸收性基質(zhì)上有經(jīng)提取的核酸)已準(zhǔn)備好在下游設(shè)施中立即進(jìn)行洗脫步驟，或者被儲(chǔ)存或在周圍環(huán)境下運(yùn)輸。

如本文所述的包括用驅(qū)避劑處理的方法可以用于從任何類型的過(guò)濾或收集系統(tǒng)中的任何類型的基底中回收生物分子，不限于本文所述的系統(tǒng)，盡管應(yīng)該理解該方法可以特別適用于本文描述的任何系統(tǒng)，包括在原始申請(qǐng)以及新實(shí)施方式中公開(kāi)的系統(tǒng)。

所述提取器芯可以優(yōu)選地配置成適應(yīng)常用的96孔形式，使得洗脫步驟可以在高通量處理中完成。

所述提取器芯包含塑料的多孔玻璃料、吸收性基質(zhì)層和塑料的支撐環(huán)，或另一塑料多孔玻璃料。塑料玻璃料和塑料支撐環(huán)用于將吸收性基質(zhì)固定到其提取器芯中的位置，并允許液體流過(guò)吸收性基質(zhì)，如關(guān)于在原始申請(qǐng)中公開(kāi)的系統(tǒng)所進(jìn)一步描述的。

此外，對(duì)于過(guò)濾部件和與容器蓋101/頂蓋900接合的上部，提取器芯300與過(guò)濾柱200基本上相同，但是提取器芯具有下游連接器320，下游連接器320比過(guò)濾柱200的開(kāi)口端204長(zhǎng)，并且提取器芯300整體尺寸設(shè)置成適于裝配在提取器組件主體500內(nèi)并與適配器410相接合。而內(nèi)部過(guò)濾器部件位于過(guò)濾柱200的下游端附近，內(nèi)部過(guò)濾器部件沿縱向大致位于提取器芯300的中間位置，以便為細(xì)長(zhǎng)的下游連接器提供空間，用于與適配器410和適配器410的下游端430相接觸以突起而穿過(guò)提取器主體500中的開(kāi)口530。但是，所述提取器芯和過(guò)濾柱不限于任何特定的尺寸、形狀或其他幾何形狀。

對(duì)于本文所描述的所有部件，應(yīng)當(dāng)理解，為了強(qiáng)調(diào)，僅在某些圖中僅描繪了諸如鎖定配件或螺紋之類的接口特征，為了簡(jiǎn)單起見(jiàn)，可以不在其他部分中描述。此外，盡管這里相對(duì)于某些組件描述了某些示例性的接口特征，但是應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明不限于所討論的特定接口特征類型，也不限于相對(duì)于接口特征的存在或不存在具體組件。因此，具有所描繪的特定接口特征的部件可以被提供有其他類型的接口特征或根本沒(méi)有接口特征，而沒(méi)有接口特征的其它部件可以具有本領(lǐng)域已知的任何類型的接口特征。

附加特點(diǎn)

吸收性基質(zhì)

已經(jīng)考慮并測(cè)試了吸收性材料和孔徑對(duì)流速的影響。有幾種吸收性基質(zhì)可用，包括二氧化硅膜、玻璃纖維紙和燒結(jié)多孔玻璃料。通常，這些二氧化硅材料的較大表面積提供足夠的結(jié)合(吸收)位點(diǎn)(高達(dá)100μgna)。少量的cfna(通常小于100μg)不太可能使結(jié)合表面飽和；然而，結(jié)合表面可能對(duì)cfna的吸收速率有影響，導(dǎo)致未完全提取或不允許的流速或甚至高壓。吸收性基質(zhì)的孔徑增加與表面積呈負(fù)相關(guān)，與流速呈正相關(guān)。具有10-50μm孔徑的多孔玻璃料提供良好的流體流動(dòng)以及與短核酸的牢固結(jié)合。它的快速流速允許樣本重復(fù)通過(guò)，從而顯著提高提取效率。此外，吸附劑表面的預(yù)處理可以增強(qiáng)cfna的提取。

尺寸選擇性提取

眾所周知，來(lái)源于腫瘤或起源于胎兒的cfdna通常比來(lái)自正常組織和母體起源的cfdna更加碎片化，即更短。在樣本收集、儲(chǔ)存/運(yùn)輸和處理過(guò)程中從血細(xì)胞釋放的基因組dna顯著影響cfdna群體，從而影響目標(biāo)cfna的檢測(cè)靈敏度。然而，在進(jìn)行cfna提取之前，從體液中選擇性去除長(zhǎng)的dna也是可能的。通過(guò)使用弱陰離子交換磁珠，成功從尿液中除去長(zhǎng)的dna(>1000bp)，這顯著增加了最終提取物中片段化的cfdna部分。其他人也報(bào)告了用陰離子交換基質(zhì)從血液中提取gdna。因此，本文所述的含有陰離子交換基質(zhì)的另外的提取器可用于在某些相容條件下在提取cfna之前去除大部分長(zhǎng)的dna。功能性陰離子交換基質(zhì)，例如在市場(chǎng)上有羧化或deae綴合的珠粒、樹(shù)脂和/或?yàn)V紙可用于進(jìn)行該步驟。

因此，額外的提取器可以由不同的基質(zhì)和不同的試劑系統(tǒng)制成。例如，為了從體液中除去大尺寸的細(xì)胞dna，可以參照?qǐng)D9a-9c按照如下步驟來(lái)構(gòu)建陰離子交換提取器：將塑料多孔玻璃料350放入提取器芯300中后，將200μl緩沖液懸浮液(50％)中的deaesephadexa-50珠(gehealthcarelifescience)裝載在第一玻璃料上代替吸收性基質(zhì)340，并且將第二玻璃料放置在deaesephadex珠層的頂部以代替環(huán)330，從而將所述珠固定在兩個(gè)玻璃料之間。如前所述組裝提取系統(tǒng)的其余部件。優(yōu)選地，首先將ph緩沖液和鹽加入到體液裂解物中，以建立所需的ph和鹽條件(本領(lǐng)域已知)，在該條件下，裂解物中的大dna將緊密結(jié)合所述珠，但小dna不會(huì)。因此，通過(guò)如上所述提取器并且被收集到收集袋中的流體將比在這種提取之前具有更少的大尺寸細(xì)胞dna分子。在收集袋中，然后將流體與另外的結(jié)合緩沖液混合，并通過(guò)如上所述具有二氧化硅基質(zhì)的第二提取器?，F(xiàn)在結(jié)合緩沖液為小dna提供了條件。因此，用于這種方法的合適的試劑盒可以包括第一提取器和第二提取器，所述第一提取器配置有用于去除大尺寸細(xì)胞dna的第一基質(zhì)，所述第二提取器配置有用于保留運(yùn)輸和分析所需的生物分子樣本的第二基質(zhì)。

樣本收集

與原始申請(qǐng)中描述的裂解容器一致，通常，lb袋可以含有預(yù)先配制的裂解試劑，其可以包括例如至少：非離子洗滌劑(例如，tritonx-100或bj58)、或非離子洗滌劑與陰離子洗滌劑的組合物(例如，月桂酰肌氨酸鈉)、蛋白酶(例如，蛋白酶k)、鹽或離液劑(例如，氯化鋰、胍、胍氰胺、尿素)、還原劑(例如，二硫蘇糖醇(dtt))、螯合劑(例如，乙二胺四乙酸(edta))、以及緩沖劑(例如，三(羥甲基)氨基甲烷(tris))。眾所周知，胍和硫氰酸胍在摩爾濃度下具有較強(qiáng)的dnase和rnase抑制活性。所述裂解試劑可以在溶液中，或以干燥形式(脫水的)存在，例如通過(guò)在裂解容器內(nèi)使用凍干法(冷凍干燥)或噴涂。

以水性流體形式存在的樣本，例如血液、血漿、血清、痰液、唾液、尿液、腦脊液(csf)、胸腔積液、腹膜液、滑膜液等，可直接或與額外的水一起添加到所述lb中。當(dāng)將水性流體加入到lb中時(shí)，所述樣本流體與裂解溶液混合，或再水合干燥的裂解試劑，以形成完整的樣本裂解緩沖液混合物。優(yōu)選的樣本是血漿或血清，并且所收集的血漿或血清的優(yōu)選體積在1-20ml的范圍內(nèi)，更優(yōu)選至少2ml，甚至更優(yōu)選2-10ml，最優(yōu)選2-5ml。

高粘度形式或半固體和固體形式的其它樣本，例如膿液、細(xì)胞懸浮液和組織，可以與額外的水一起加入到lb中，所述水的量是再次水合干燥的溶解試劑需要的量，以保持所述樣本體積與裂解溶液的最佳比例。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，在提取之后，可以用本領(lǐng)域已知的任何方法，如上文和原始申請(qǐng)所述，通過(guò)洗滌和漂洗進(jìn)一步處理收集的樣本。

雖然在過(guò)濾柱上示出了具有一個(gè)突片和在該運(yùn)輸容器上的配合槽，但是也可以提供布置在過(guò)濾柱上的任何構(gòu)件，所述構(gòu)件適合于通過(guò)配置在運(yùn)輸容器上的配合的第二構(gòu)件可釋放地接合，并且能夠傳遞足夠的力至過(guò)濾柱以將其從與容器蓋的螺紋連接中擰開(kāi)。類似地，盡管示出了在過(guò)濾柱和容器蓋之間的螺紋連接，但是可以使用任何類型的互鎖連接，并且這種系統(tǒng)的各個(gè)元件可以利用運(yùn)輸容器和過(guò)濾柱之間的任何類型的配合，優(yōu)選地，以無(wú)菌的方式，來(lái)將過(guò)濾柱從所述蓋中取出。

所述過(guò)濾柱的尺寸可以設(shè)置成適合于用于接收多個(gè)過(guò)濾柱的樣本保持器(未示出)，并且適于安裝在離心機(jī)中以一次將多個(gè)過(guò)濾柱一起離心，例如但不限于達(dá)到適合半自動(dòng)或全自動(dòng)處理和操作的96孔形式的尺寸。

所述收集系統(tǒng)可以作為試劑盒的一部分出售，所述試劑盒包括進(jìn)行特定類型的測(cè)試所需的一種或多種材料，例如但不限于以下：用于從患者中提取流體樣本的裝置(例如，用于抽取血液、血清、血漿或其他體液的針和注射器)，樣本處理容器/試劑容器/廢物收集容器，包括如本文進(jìn)一步描述的含有試劑的容器(例如，裂解緩沖液(lb)、結(jié)合緩沖液(bb)、洗滌緩沖液(wb)、清潔緩沖液(cb)、洗脫緩沖液(eb)和驅(qū)避液(rf))，樣本轉(zhuǎn)移裝置(例如，注射器)，如本文所述的提取器組件和運(yùn)輸容器。

在其它實(shí)施方式中，上述各種部件可以單獨(dú)出售。理想情況下，對(duì)于大多數(shù)類型的測(cè)試，特別是對(duì)于本文所述的結(jié)核病檢測(cè)方法，在從患者身上提取核酸直到所述核酸沉積在所述過(guò)濾柱中的基底上的時(shí)間內(nèi)，所有接觸樣本或者接觸含樣本的液體的部分應(yīng)該是無(wú)菌的或不被任何其他來(lái)源(例如來(lái)自操作員或來(lái)自周圍環(huán)境)的核酸污染，并且不被普遍存在的迅速降解核酸的dnase和rnase污染。本文所討論的各種容器、注射器和容器可以是實(shí)驗(yàn)室/保健領(lǐng)域中公知的標(biāo)準(zhǔn)組件。然而，具有連接的過(guò)濾柱的創(chuàng)新的容器蓋，是專門用于所述特定的收集系統(tǒng)的。

因此，所述改進(jìn)的另一方面可以包括用于容器的無(wú)菌可移除蓋，所述蓋具有面向容器的內(nèi)部容積的內(nèi)側(cè)和與內(nèi)側(cè)相對(duì)的外側(cè)，所述蓋不包括連通內(nèi)側(cè)和外側(cè)之間的通氣端口，包括連接在內(nèi)側(cè)和外側(cè)之間的樣本連接端口，所述樣本連接端口包括第一互鎖部件，用于將所述樣本連接端口與相配合的第二互鎖部件可拆卸地鎖定，所述蓋的內(nèi)部包括與所述樣本連接端口流體連通的連接接口。所述可移除蓋可以單獨(dú)出售，或者在另一個(gè)實(shí)施方式中，與本文所討論的無(wú)菌過(guò)濾柱一起可移除地附接到所述容器蓋的連接接口。

本文描述的系統(tǒng)的所有部分可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法制造，例如通過(guò)熱塑性注射成型。優(yōu)選的熱塑性塑料包括聚乙烯(pe)、聚丙烯(pp)和聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯(pet)，但是本發(fā)明不限于任何特定的材料或構(gòu)造方法。

一種用于使用本文討論的系統(tǒng)的示例性方法可以按如下執(zhí)行。

(a)收集一定體積的含樣本的液體，所述液體可以在lb袋中用裂解緩沖液和具有離液劑、鹽、沉淀劑(例如醇)的結(jié)合緩沖液進(jìn)行處理和孵育，以從生物樣本中的復(fù)合物、細(xì)胞或其它顆粒中釋放核酸，并使用注射器從所述lb袋中提取粗裂解物；

(b)將含有粗裂解物的注射器連接到提取器組件的上游端，并將lb袋連接到提取器組件的下游端；

(c)使所述注射器中的含樣本的液體穿過(guò)所述提取器組件，從而從基底上的粗裂解物樣本中收集核酸并在所述lb袋中收集提示物；

(d)用洗滌緩沖液洗滌所述柱中的與核酸結(jié)合的過(guò)濾基質(zhì)；

(e)使一定體積的溶劑穿過(guò)所述柱，使與核酸結(jié)合的基質(zhì)脫水(并且同時(shí)進(jìn)一步洗滌和脫鹽)，優(yōu)選同時(shí)使用100％乙醇或丙酮；

(f)將運(yùn)輸容器底部部分放置在過(guò)濾柱上方，使過(guò)濾柱與運(yùn)輸容器接合，并且將過(guò)濾柱與容器蓋分離；

(g)通過(guò)配合所述運(yùn)輸容器頂部和運(yùn)輸容器底部部分來(lái)臨時(shí)密封所述運(yùn)輸容器，所述密封的運(yùn)輸容器優(yōu)選地包含一袋吸濕劑(干燥劑)，例如，顆?；蛑榱９枘z。

(h)或者，不操作步驟(f)和(g)，不分離所述過(guò)濾柱，而是直接添加eb，然后用注射器通過(guò)頂蓋200上的入口注射rf，以立即在另一個(gè)容器中收集洗脫液；

(i)運(yùn)輸洗脫液的容器進(jìn)行處理，或立即進(jìn)行處理。

與相對(duì)穩(wěn)定的dna分子不同，rna分子更易于降解，因?yàn)閞na中鄰近磷酸二酯鍵的2'羥基而使得rna可以在堿和酶催化的水解中作為分子內(nèi)親核試劑。

洗滌步驟(d)可以包括通過(guò)使一個(gè)或多個(gè)體積的處理流體流過(guò)所述過(guò)濾柱來(lái)處理基底上收集的樣本。例如，所述處理可以包括使用于運(yùn)輸?shù)暮怂針颖痉€(wěn)定，例如用洗滌液(例如包含乙醇的流體)洗滌所述樣本。在一個(gè)實(shí)施方式中，其中所述樣本轉(zhuǎn)移容器包括注射器，使所述液體通過(guò)所述過(guò)濾柱的方法包括手動(dòng)地向注射器的柱塞施加壓力。當(dāng)準(zhǔn)備下游核酸測(cè)定時(shí)，結(jié)合在所述過(guò)濾柱中的基底上的核酸被釋放出來(lái)并從所述過(guò)濾柱中洗出，例如通過(guò)向所述過(guò)濾器(固體基質(zhì))中加入少量洗脫緩沖液或純水而釋放結(jié)合的核酸，并通過(guò)如本領(lǐng)域已知的施加空氣壓力或離心而將洗脫液收集在另一小容器中，或者更優(yōu)選地通過(guò)向如本文所述的柱施加流體壓力(注射rf)。在使用本文所述的流體壓力技術(shù)之后，如果需要，所述過(guò)濾柱仍然可以進(jìn)行空氣吹掃或離心，以便進(jìn)一步收集。

盡管不限于任何特定用途，但是上述收集系統(tǒng)可以特別適用于與如下文所述的感染性病原體如結(jié)核病的檢測(cè)方法一起使用。然而，所述系統(tǒng)和方法可能特別適用于與使用cfna收集進(jìn)行診斷的任何方法一起使用，例如，用于胎兒遺傳疾病的早期診斷、腫瘤診斷和深部組織感染(如ltbi)的方法?？偟膩?lái)說(shuō)，該系統(tǒng)和方法可以特別適用于基于na物質(zhì)評(píng)估的任何方法，所述na物質(zhì)包含與主體不同的na信息的改變。本文所述的系統(tǒng)和方法在提取和保存具有重要地位的領(lǐng)域中特別有用。檢測(cè)血液中低濃度的cfna需要相當(dāng)大的體積樣本(2-5-10ml)，因?yàn)楫?dāng)加入試劑時(shí)，總體積容易達(dá)到20-50ml，這是先前存在的方法難以處理或難以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化的。rna由于其穩(wěn)定性而呈現(xiàn)出問(wèn)題。因此，該方法和系統(tǒng)特別適用于依賴于體液中低濃度cfna(尤其是rna)的檢測(cè)的處理。

實(shí)施例

實(shí)施例1-moe設(shè)備的構(gòu)造

構(gòu)建了如圖2-4所示的過(guò)濾柱200的原型。從gf/d玻璃纖維濾紙(whatman，nj)沖壓合適尺寸的吸收性基質(zhì)圓盤212，并插入到惰性pp多孔過(guò)濾器214的頂部，然后將pp支撐環(huán)216緊緊地放置在吸收性基質(zhì)盤212的頂部，以固定所述組件。將頂部具有魯爾鎖連接的蓋101旋擰并密封在過(guò)濾柱上。然后將帶有組裝有過(guò)濾柱的蓋子旋擰并密封成空的50ml塑料一次性離心管。如上所述的整個(gè)設(shè)備在本文中進(jìn)一步被稱為moe(手動(dòng)操作提取)設(shè)備400?？梢砸韵嗤姆绞綐?gòu)造以下實(shí)施例中使用的多個(gè)moe過(guò)濾設(shè)備。

實(shí)施例2

人類合并血漿的制備：將來(lái)自10個(gè)健康捐獻(xiàn)者的新鮮抽取的血液在4000g下離心20分鐘。從每個(gè)采血管中取出血漿部分，并將其匯集在50ml離心管中。將合并的血漿渦旋并在-20℃冷凍。

實(shí)施例3

從合并的血漿中提取cfdna：在該實(shí)施例中，僅使用所述moe過(guò)濾柱及以下緩沖液和方案：

緩沖液：裂解緩沖液(lb)：含有硫氰酸胍(gitc)、洗滌劑tritonx-100、蛋白酶k和edta。

結(jié)合緩沖液(bb)：含有g(shù)itc和異丙醇(ipa)，充分混合。

洗滌緩沖液(wb)：含有tris、edta、鹽、乙醇，ph7.0。

洗脫緩沖液(eb)：含有tris和edta，ph7.5。

方案：

1.裂解：用具有長(zhǎng)針頭的10ml注射器將2ml解凍的合并血漿抽入含有2mllb的50ml塑料離心管中，通過(guò)渦旋充分混合，在60℃的加熱塊中孵育30分鐘。在室溫下冷卻。

2.結(jié)合：將16mlbb抽入樣本裂解液管中，通過(guò)渦旋混合，將其在室溫下保持10分鐘。

3.結(jié)合和提?。簩?0ml裂解管中的所有內(nèi)容物用長(zhǎng)針頭抽入30ml的魯爾鎖注射器中，直到將約5ml的空氣抽入所述注射器中，將所述魯爾鎖注射器擰到組裝的moe設(shè)備400的所述蓋上的母魯爾鎖連接器上，所述moe設(shè)備牢固地安置在機(jī)架中。將所述注射器柱塞向下壓，直到所述注射器中的所有液體和空氣穿過(guò)所述過(guò)濾柱。將廢物收集在所述moe裝置的50ml管中。此過(guò)程可能需要1-2分鐘。擰下所述30毫升注射器。

4.將4mlwb抽入10ml魯爾鎖注射器中，按壓所述柱塞以允許wb穿過(guò)所述柱。擰下10ml注射器。

5.將4ml100％乙醇抽入10ml注射器中，按壓所述柱塞使乙醇穿過(guò)所述柱。

6.從所述50ml離心管中擰下所述moe裝置的蓋子，放在新的50ml管上。使所述柱中的乙醇?xì)埩粑锿耆栏伞?/p>

實(shí)施例4.用3種方法洗脫提取的cfdna

在該實(shí)驗(yàn)中，比較3種洗脫方法。將裝有從合并血漿中提取的cfdna的12個(gè)moe裝置分成3組(n＝4)：a)通過(guò)高速離心(hc)洗脫；b)通過(guò)空氣吹掃(ap)洗脫；c)通過(guò)驅(qū)避液(rf)洗脫。

通過(guò)qpcr測(cè)定比較管家基因b2m的片段cfdna的回收效率與洗脫體積和洗脫液中的cfdna濃度。

提取方案hc：將所述過(guò)濾柱從moe裝置的蓋上分離，并將所述柱放入1.5ml收集離心管中，在所述基質(zhì)上加入100μleb，在頂部用螺帽密封所述柱，等待10分鐘以釋放。然后將收集管以12,000g離心3分鐘。

提取方案ap：通過(guò)移液器在所述moe裝置中通過(guò)入口端口在所述基質(zhì)上加入100μleb，并等待10分鐘。將10毫升注射器連接到所述蓋的端口上，將帶有所述蓋的過(guò)濾柱放在1.5毫升收集管上，并反復(fù)推動(dòng)和拉出所述注射器柱塞以吹掃所述柱。將所述收集管離心以將吹掃的eb收集到所述管的底部。

提取方案rf：如方案ap中所述添加eb。10分鐘后，將具有0.5mlrf(psf-10cstpuresiliconefluid，clearcoproducts，pa)的5ml注射器連接到所述蓋的端口上，并將所述柱放置在所述收集管上。緩慢壓下所述柱塞以吹掃eb和rf。未經(jīng)離心就在eb(底層)和rf層之間快速地形成清晰的界面。

所述洗脫液中cfdna的定量。除掉10μl洗脫液作為qpcr測(cè)定(siboqpcrmix，occambiolabs，inc.，de)的模板。從收集管中小心地取出殘留物洗脫液并用0.1mg級(jí)數(shù)字天平稱重。其結(jié)果示于表1中。

表1

盡管本文參考具體實(shí)施方式來(lái)說(shuō)明和描述了本發(fā)明，但本發(fā)明并不限于所示的細(xì)節(jié)。相反，可以在權(quán)利要求的等同的范圍和區(qū)域內(nèi)且不脫離本發(fā)明的基礎(chǔ)上，對(duì)細(xì)節(jié)進(jìn)行各種修改。