本發(fā)明是關于分子生物學領域，具體來說是關于改良包含核酸及蛋白質陣列的樣本到表面上的裝載及保持。

背景技術：

用于分析例如多核苷酸或蛋白質的生物分子的各種技術依賴于沉積各自附著到此類生物分子的顆粒陣列。示范性定序技術依賴于在井陣列中沉積包含多核苷酸或其復制品的顆粒陣列。在特定實例中，顆粒或珠?？沙练e于井內以使顆?；蛑榱Ｅc特定傳感器相關聯(lián)并提供分析生物分子的本地環(huán)境。在其它實例中，有序顆粒陣列沉積于表面上并在并不利用井的情況下進行分析。

技術實現要素：

在一示范性實施例中，在傳感器襯底上裝載珠粒的方法包含將包含珠粒的懸浮液施加到界定于傳感器襯底上方的流槽。所述傳感器襯底包含多個井。所述珠粒至少部分沉積于所述多個井中。所述方法還包含從所述流槽移除液體、從所述流槽蒸發(fā)液體及將水合溶液施加到所述流槽。

附圖說明

通過參考附圖，可以更好地理解本發(fā)明，且使所屬領域的技術人員清楚其眾多特征及優(yōu)勢。

圖1包含用于分析靶多核苷酸的示范性方法的方塊流程圖。

圖2包含用于分析靶多核苷酸的示范性方法的圖畫說明。

圖3包含說明用于裝載的示范性方法的方塊流程圖。

圖4及圖5包含用于裝載的示范性方法的圖畫說明。

圖6包含用于定序的示范性系統(tǒng)的說明。

圖7包含珠粒沉積之后的裝置表面的圖像。

圖8包含說明所沉積珠粒的強度比率的圖表。

在不同圖式中使用相同參考符號指示相似或相同物件。

具體實施方式

在一示范性實施例中，在傳感器襯底上裝載珠粒的方法包含將包含珠粒的懸浮液施加到界定于傳感器襯底上方的流槽。傳感器襯底包含多個反應部位。示范性反應部位包含井、溝道、凹槽、凹點、凹陷、柱組(sets of posts)或其它類似功能結構。珠粒至少部分地沉積到多個反應部位中。所述方法還包含從流槽移除液體、從流槽蒸發(fā)液體及將水合溶液施加到流槽。珠粒可結合到例如核酸或蛋白質的生物分子。珠?？蔀樗z珠粒。在一實例中，傳感器襯底可為半導體定序裝置。

在特定實例中，在珠粒沉積于包含井的傳感器襯底上之前使珠粒與核酸結合。如圖1中所說明，方法100包含將珠?；蝾w粒、擴增反應劑及靶多核苷酸組合到擴增溶液中，如102處所說明。具體來說，珠粒襯底可由親水性聚合物形成。在一實例中，珠?？蓴y載電荷。替代地，珠?？墒侵行缘摹?/p>

舉例來說，珠?？捎蓡误w形成，單體包含可自由基聚合單體，例如乙烯基類單體。在一實例中，單體可包含丙烯酰胺、醋酸乙烯酯、羥烷基甲基丙烯酸酯或其任何組合。在一特定實例中，親水性單體為丙烯酰胺，例如包含羥基、胺基、羧基或其組合的丙烯酰胺。在一實例中，親水性單體為氨基烷基丙烯酰胺、用胺封端的聚丙二醇官能化的丙烯酰胺(D，下文說明)、丙烯哌嗪(acrylopiperazine)(C，下文說明)或其組合。在另一實例中，丙烯酰胺可為羥基烷基丙烯酰胺，例如羥基乙基丙烯酰胺。具體來說，羥基烷基丙烯酰胺可包含N-三(羥基甲基)甲基)丙烯酰胺(A，下文說明)、N-(羥基甲基)丙烯酰胺(B，下文說明)或其組合。在另一實例中，可使用單體的混合物，例如羥基烷基丙烯酰胺與胺官能化丙烯酰胺的混合物或丙烯酰胺與胺官能化丙烯酰胺的混合物。在一實例中，胺官能化丙烯酰胺可按100:1到1:1的范圍，例如100:1到2:1范圍、50:1到3:1范圍、50:1到5:1范圍或甚至50:1到10:1范圍的羥基烷基丙烯酰胺:胺官能化丙烯酰胺或丙烯酰胺:胺官能化丙烯酰胺的比率包含在內。

在特定實例中，珠粒為水凝膠珠粒。

珠粒中的每一者可包含可雜交模板多核苷酸的連接部位。舉例來說，連接部位可各自包含與模板多核苷酸的部分互補的連接寡核苷酸。模板多核苷酸可包含靶多核苷酸或與靶多核苷酸互補的節(jié)段，除此之外還有與連接寡核苷酸互補的節(jié)段。

連接寡核苷酸可結合到珠粒。可活化珠粒的聚合物以促進與例如寡核苷酸或多核苷酸的目標分析物的結合。舉例來說，珠粒上的官能團可被增強以準許與目標分析物或分析物受體鍵結。在特定實例中，可用能夠將親水性聚合物官能團轉化成可經歷親核或親電取代的反應性部分的反應劑改性親水性聚合物的官能團。舉例來說，襯底上的羥基可通過用磺酸酯基或氯置換羥基的至少一部分來活化。示范性磺酸酯基可衍生自三氟乙烷磺酰氯、甲磺酰氯、甲苯磺酰氯或fosyl氯或其任何組合。磺酸酯可用以使親核試劑置換磺酸酯?；撬狨タ蛇M一步與釋放的氯反應以提供氯化基團，其可用于結合珠粒的過程中。在另一實例中，可活化珠粒上的胺基。

舉例來說，目標分析物或分析物受體可通過與磺酸酯基的親核取代鍵結到親水性聚合物。在特定實例中，用例如胺或硫醇的親核試劑封端的目標分析物受體可經歷親核取代以置換珠粒的表面上的磺酸酯基。

在另一實例中，磺化珠?？膳c單官能或多官能單親核或多親核反應劑(例如順丁烯二酰亞胺)進一步反應，所述反應劑可形成與珠粒的附著同時維持針對包含親電子基團的寡核苷酸的親核活性。另外，殘余親核活性可通過附著到包含多親電子基團的反應劑轉化成親電活性，所述多親電子基團隨后附著到包含親核基團的寡核苷酸。

在另一實例中，在聚合期間可添加含有官能團的單體。單體可包含(例如)含有羧酸、酯、鹵素或其它胺反應性基團的丙烯酰胺。酯基可在與胺封端的寡核苷酸反應之前被水解。

其它結合技術包含使用包括胺的單體。胺為可用胺反應性雙官能雙親電反應劑進一步改性的親核性基團，所述胺反應性雙官能雙親電反應劑在附著到珠粒之后產生單官能親電子基團。此類親電子基團可與具有親核性基團(例如胺或硫醇)的寡核苷酸反應，從而導致寡核苷酸通過與空缺親電子試劑反應而附著。

如果珠粒由胺基-丙烯酰胺及羥基-丙烯酰胺的組合制備，則珠?？砂H核胺基及中性羥基的組合。胺基可用二官能雙親電部分(例如二-異氰酸酯或雙-NHS酯)改性，從而產生對親核試劑具有反應性的親水性顆粒。示范性雙-NHS酯包含雙-丁二酰亞胺基C2-C12烷基酯，例如雙-丁二酰亞胺基辛二酸酯或雙-丁二酰亞胺基戊二酸酯。

其它活化化學反應包含摻入轉化指定官能團的多個步驟以容納特定所要鍵。舉例來說，磺酸酯改性的羥基可通過若干方法轉化成親核性基團。在一實例中，磺酸酯與疊氮根陰離子的反應產生疊氮取代的親水性聚合物。疊氮化物可直接用于通過“CLICK”化學反應與乙炔取代的生物分子結合，所述化學反應可使用或不使用銅催化劑執(zhí)行。任選地，疊氮化物可通過(例如)用氫催化還原或用有機磷化氫還原轉化成胺。所得胺接著可用多種反應劑(例如二-異氰酸酯、雙-NHS酯、三聚氯化氰或其組合)轉化成親電子基團。在一實例中，使用二-異氰酸酯在聚合物與連接基團之間產生脲鍵，這產生了殘余異氰酸酯基，其能夠與胺基取代的生物分子反應從而在連接基團與生物分子之間產生脲鍵。在另一實例中，使用雙-NHS酯產生聚合物與連接基團之間的酰胺鍵及殘余NHS酯基，殘余NHS酯基能夠與胺基取代的生物分子反應從而產生連接基團與生物分子之間的酰胺鍵。在另一實例中，使用三聚氯化氰產生聚合物與連接基團之間的胺基-三嗪鍵及兩個殘余氯基-三嗪基團，殘余氯基-三嗪基團中的一者能夠與胺基取代的生物分子反應從而產生連接基團與生物分子之間的胺基-三嗪鍵。其它親核基團可通過磺酸酯活化摻入到顆粒中。舉例來說，磺化顆粒與硫代苯甲酸陰離子的反應及隨后硫代苯甲酸酯的水解向顆粒中摻入硫醇，其隨后可與順丁烯二酰亞胺取代的生物分子反應從而產生與生物分子的硫基-丁二酰亞胺鍵。硫醇還可與溴基-乙?；鶊F反應。

替代地，在聚合以摻入寡核苷酸期間可使用丙烯?；押塑账?。示范性丙烯酰化寡核苷酸可包含離子交換寡核苷酸。

返回到圖1，珠?？蛇B同擴增反應劑摻入到擴增溶液中，所述擴增反應劑例如包含聚合酶或重組酶的酶、核苷酸(例如，A、T、C、G或其類似物)、各種鹽或離子化合物或其組合。具體來說，例如衍生自生物源的多核苷酸的靶多核苷酸包含于擴增溶液中。

形成包含作為分散相的擴增溶液的乳液，如104中所說明。具體來說，擴增溶液為水溶液且可分散于例如油相的疏水相中。疏水相可包含經氟化液體、礦物油、硅酮油或其任何組合。任選地，疏水相可包含表面活性劑，例如非離子表面活性劑，例如下文所描述的非離子表面活性劑。

可利用膜類機制形成乳液，其中含水擴增溶液及連續(xù)相疏水性液體一或多次地穿過膜，從而在連續(xù)相疏水性液體內形成擴增溶液的液滴。替代地，可通過在疏水性液體存在的情況下攪拌擴增溶液形成乳液。在另一實例中，可通過將擴增溶液及疏水性連續(xù)相反復地抽吸及噴射通過滴管尖端形成乳液。在另一實例中，可將含水擴增溶液的液滴注入疏水性液流中。

在乳化擴增溶液之后，形成分散相的擴增溶液的液滴可包含珠粒及靶多核苷酸。液滴的一部分可包含一或多個珠粒及單個靶多核苷酸。其它液滴可包含珠粒但不包含多核苷酸。其它液滴可包含一或多個珠粒及多于一個靶多核苷酸。

舉例來說，如圖2中所說明，含水擴增溶液222包含靶多核苷酸202及珠粒204。乳化之后，乳液224的一些液滴206可包含單個靶多核苷酸及一或多個珠粒。乳液224的其它液滴208可包含珠粒但不包含靶多核苷酸。

返回到圖1，可執(zhí)行擴增反應以提供核酸珠粒，如106處所說明。核酸珠粒包含珠粒及核酸的結合復制品。擴增反應的條件可取決于如下因素，例如用于擴增溶液中的酶的性質、個別核苷酸的濃度、鹽或離子化合物的濃度以及其它因素。在一實例中，擴增反應為聚合酶鏈式反應(PCR)，其中溫度在40℃到100℃的范圍內多次循環(huán)。在另一實例中，擴增反應為重組酶聚合酶擴增(RPA)。此類反應可在40℃到90℃的溫度范圍內等溫地執(zhí)行。可使用其它擴增技術，例如聚合酶循環(huán)組裝(PCA)、不對稱PCR、解旋酶依賴性擴增、連接介導PCR、多重PCR、納米顆粒輔助PCR或其它擴增技術。

在一實例中，在擴增期間，包含所關注靶序列及與連接寡核苷酸互補的節(jié)段的模板多核苷酸與連接寡核苷酸雜交。連接寡核苷酸經擴展，從而形成與模板多核苷酸的互補序列。模板多核苷酸可進一步包含用于與分離襯底鍵結以用于稍后分離經擴增基質與未經擴增基質的捕獲部分。

由于擴增，包含靶多核苷酸及珠粒的分散相液滴產生包含結合到珠粒的靶多核苷酸的一或多個復制品的核酸珠粒。相反地，包含珠粒且不具有靶多核苷酸的液滴并不產生包含靶多核苷酸的復制品且在本文中被稱作未經擴增珠粒的珠粒。

如108處所說明，分解乳液以恢復核酸珠粒，由此分散相的液體與連續(xù)相分離。舉例來說，可將乳液施加到分解溶液上方并任選地進行攪拌或離心。具體來說，通過分解溶液離心乳液將珠粒遠離分解溶液與乳液的連續(xù)相液體之間的界面驅動到分解溶液中。分解溶液可為親水性液體，例如包含表面活性劑以輔助增強表面張力及使分散相與連續(xù)相分離的水溶液。

在一實例中，分解溶液可包含具有處于0.01重量％到20重量％的范圍的總濃度的一或多種表面活性劑。舉例來說，表面活性劑可以0.1重量％到15.0重量％的范圍內的量包含在內，例如0.5重量％到10.0重量％的范圍、0.5重量％到5.0重量％的范圍或甚至0.5重量％到3重量％的范圍。在另一實例中，表面活性劑可以5.0％到20.0％的范圍內的總量包含在內，例如10.0％到20.0％的范圍或12.0％到18.0％的范圍。

表面活性劑可為離子表面活性劑、兩性表面活性劑、非離子表面活性劑或其組合。離子表面活性劑可為陰離子表面活性劑。示范性陰離子表面活性劑包含硫酸鹽表面活性劑、磺酸鹽表面活性劑、磷酸鹽表面活性劑、羧酸鹽表面活性劑或其任何組合。示范性硫酸鹽表面活性劑包含：烷基硫酸鹽，例如月桂基硫酸銨、月桂基硫酸鈉(十二烷基硫酸鈉(SDS))或其組合；烷基醚硫酸酯，例如月桂醇醚硫酸鈉、肉豆蔻醇醚硫酸鈉或其任何組合；或其任何組合。示范性磺酸鹽表面活性劑包含：烷基磺酸鹽，例如十二烷基磺酸鈉；琥珀辛酯，例如磺基琥珀酸酯二辛鈉；烷基苯甲基磺酸鹽(例如，十二烷基苯磺酸或其鹽)；或其任何組合。示范性磷酸鹽表面活性劑包含烷基芳基醚磷酸鹽、烷基醚磷酸鹽或其任何組合。示范性羧酸表面活性劑包含：烷基羧酸鹽，例如脂肪酸鹽或硬脂酸鈉；月桂基肌氨酸鈉；膽酸鹽，例如脫氧膽酸鈉；或其任何組合。

在另一實例中，離子表面活性劑可為陽離子表面活性劑。示范性陽離子表面活性劑包含一級、二級或三級胺、四級銨表面活性劑，或其任何組合。示范性四級銨表面活性劑包含：烷基三甲基銨鹽，例如溴化鯨蠟基三甲基銨(CTAB)或氯化鯨蠟基三甲基銨(CTAC)；氯化十六烷基吡啶(CPC)；聚乙氧基化牛油胺(POEA)；苯扎氯銨(BAC)；芐索氯銨(BZT)；5-溴基-5-硝基-1,3-二烷；二甲基二(十八烷基)氯化銨；二(十八烷基)二甲基溴化銨(DODAB)；或其任何組合。

示范性兩性表面活性劑包含具有磺酸、羧酸或磷酸陰離子的一級、二級或三級胺或四級銨陽離子。示范性磺酸鹽兩性表面活性劑包含：(3-[(3-膽酰胺基丙基)二甲基銨基]-1-丙磺酸鹽)；磺基甜菜堿，例如椰油酰胺丙基羥基磺基甜菜堿；或其任何組合。示范性羧酸兩性表面活性劑包含胺基酸、亞胺基酸、甜菜堿(例如椰油酰胺基丙基甜菜堿)或其任何組合。示范性磷酸鹽兩性表面活性劑包含卵磷脂。

在另一實例中，表面活性劑可為非離子表面活性劑，例如聚乙二醇類表面活性劑、烷基吡咯啶表面活性劑、烷基咪唑啶酮表面活性劑、烷基嗎啉表面活性劑、烷基咪唑表面活性劑、烷基咪唑啉表面活性劑或其組合。在特定實例中，聚乙二醇類表面活性劑包含聚乙二醇醚，例如烷基苯酚聚乙氧基化物。在另一實例中，非離子表面活性劑包含非離子氟表面活性劑，例如乙氧基化碳氟化合物。在又一實例中，表面活性劑溶液可包含辛基吡咯啶。

具體來說，表面活性劑溶液可包含此類表面活性劑的組合。舉例來說，表面活性劑溶液可包含非離子表面活性劑與陰離子表面活性劑的組合。在特定實例中，表面活性劑溶液可包含非離子表面活性劑(例如聚乙二醇醚、烷基吡咯啶或非離子氟表面活性劑)及陰離子表面活性劑(例如硫酸鹽表面活性劑，例如SDS)。具體來說，表面活性劑溶液可包含0.1％到20.0％的范圍，例如1.0％到15.0％的范圍，或5.0％到15.0％的范圍，或8.0％到12.0％的范圍內的量的離子表面活性劑，例如陰離子表面活性劑。另外，表面活性劑溶液可包含0.01％到10.0％的范圍，例如0.05％到8.0％的范圍，或1.0％到6.0％的范圍內的非離子表面活性劑，例如烷基吡咯啶(例如，辛基吡咯啶)。在另一實例中，表面活性劑溶液可包含0.05％到3.0％的范圍內的非離子表面活性劑。

參考圖2，在乳液分解之后，剩余水溶液226包含核酸珠粒210。核酸珠粒210可包含結合到靶多核苷酸214的多個復制品的珠粒212。溶液也可包含并不包含靶多核苷酸的復制品的珠粒212(在本文中被稱作未經擴增珠粒)。

返回到圖1，洗滌并濃縮核酸珠粒，如110處所說明。在一實例中，可使用離心?；榱Ｇ铱蓮慕浟；榱Ｉ戏絻A析或抽拉過量溶液。在另一實例中，可將核酸珠粒附著到用于緊固核酸珠粒的分離襯底同時替換環(huán)繞核酸珠粒的水溶液。

舉例來說，如圖2中所說明，核酸珠粒210可由分離襯底220捕獲。相反地，并不包含多核苷酸的復制品的未經擴增珠粒212并不容易地附著到分離襯底220。因此，當分離襯底220被緊固且所附著核酸珠粒210固持就位時，實質上能從溶液洗滌未經緊固的未經擴增珠粒。在特定實例中，分離襯底214為可使用磁場緊固到容器壁的磁性襯底。核酸珠粒210可接著與分離襯底220分離，從而提供主要具有核酸珠粒及實質上較少未經擴增珠粒的溶液。

在特定實例中，核酸珠粒210可包含與分離襯底220上的部分相互作用的捕獲部分。未經擴增珠粒可實質上不含捕獲部分。舉例來說，模板多核苷酸可用捕獲部分封端。不與模板多核苷酸雜交的未經擴增珠粒沒有捕獲部分，且因此不與分離襯底鍵結。一旦核酸珠粒210與未經擴增珠粒分離，可(例如)通過從結合到核酸珠粒210的經擴展連接寡核苷酸解鏈或拆離模板多核苷酸使核酸珠粒210與分離襯底分離。

返回到圖1，可將經濃縮核酸珠粒裝載到生物傳感器上，如112處所說明。取決于生物傳感器的性質，生物傳感器可提供可附著核酸珠粒的表面。所述表面可是平坦的，且任選地可包含較吸引核酸珠?；蚪浶薷囊跃o固核酸珠粒的區(qū)域。在另一實例中，生物傳感器可包含如下表面：其包含核酸珠粒在其中對準的離散部位或圖案化表面，例如凹陷、凹口、孔、井、隆脊或溝道。在另一實例中，如圖2中所說明，生物傳感器可包含界定其中沉積核酸珠粒210的井218的表面結構216。

在特定實例中，井界定于傳感器上方。井壁或傳感器可具有由金屬、半金屬、其氧化物、其氮化物或其組合形成的表面。在一實例中，井壁可由例如硅的半金屬、例如二氧化硅的其氧化物、例如氮化硅的其氮化物或其組合形成。在另一實例中，井壁可至少部分由金屬或金屬氧化物形成。示范性金屬包含鈦、鎢、鉭、鉿、鋁、鋯、鋅或其組合。井壁的一部分可由此類金屬的氧化物或氮化物形成，例如氧化鈦、氧化鉭、二氧化鉿、氧化鋁、氧化鋯、氮化鈦，以及其它或其組合。另外，形成井的底部的傳感器可具有金屬、金屬氧化物或金屬氮化物表面或其組合。示范性金屬包含鈦、鎢、鉭、鉿、鋁、鋯、鋅或其組合。示范性金屬氧化物或氮化物包含氧化鈦、氧化鉭、二氧化鉿、氧化鋁、氧化鋯、氮化鈦，以及其它或其組合。

在特定實例中，井壁或傳感器的表面可以(例如)8OH/nm²到20OH/nm²的范圍內(例如8OH/nm²與16OH/nm²之間)的濃度具有羥基。任選地，所述表面可用硫酸鹽、磷酸鹽或含有硅烷的化合物處理。所述化合物可鍵結到駐留于井壁或傳感器的表面上的OH基團的至少一部分。在特定實例中，所述化合物包含含有硅烷的化合物，例如丁基銨三甲氧基硅烷(BATS)，或含有膦酸的化合物，例如咪唑烷基膦酸，例如，(1-甲基-3-(十二烷基膦酸)咪唑鎓溴化物)(ImPA)。

如圖1的114處所說明，生物傳感器可感測核酸珠粒的方面。取決于生物傳感器的性質，傳感器可用以檢測靶多核苷酸內的特定序列的存在或可用于定序靶多核苷酸。舉例來說，生物傳感器可利用基于熒光的合成定序法。在另一實例中，生物傳感器可利用包含感測核苷酸摻入的副產物(例如pH)或焦磷酸鹽或磷酸鹽的存在的定序技術。在另一實例中，生物傳感器可利用溫度或熱量檢測。

返回到圖2，在一實例中，井陣列中的井218可以可操作地連接到測量裝置。舉例來說，對于熒光發(fā)射法，井218可以可操作地耦合到光檢測裝置。在離子檢測的情況下，井218的下部表面可安置在離子傳感器(例如場效應晶體管)的傳感器墊上。

一種涉及通過檢測核苷酸摻入的離子副產物定序的示范性系統(tǒng)包含半導體定序平臺，例如通過檢測作為核苷酸摻入的副產物產生的氫離子來定序核酸模板的基于離子的定序系統(tǒng)。通常，氫離子作為使用聚合酶的模板依賴性核酸合成期間發(fā)生的核苷酸摻入的副產物釋放。此定序器通過檢測核苷酸摻入的氫離子副產物來檢測核苷酸摻入。此定序器可包含待定序的多個模板多核苷酸，每一模板安置于陣列中的各別定序反應井內。陣列的井可各自耦合到至少一個離子傳感器，所述傳感器可檢測作為核苷酸摻入的副產物產生的H+離子的釋放或溶液pH的改變。離子傳感器包括耦合到離子敏感性檢測層的場效應晶體管(FET)，所述檢測層可感測H+離子的存在或溶液pH的改變。離子傳感器可提供指示核苷酸摻入的輸出信號，其可表示為量值與各別井或反應室中的H+離子濃度相關的電壓改變。不同核苷酸類型可連續(xù)流入反應室，且可通過聚合酶以由模板序列測定的順序摻入到擴展底涂劑(或聚合部位)中。每一核苷酸摻入可伴隨著反應井中的H+離子釋放，連同局部pH的伴隨改變?？赏ㄟ^感測器的FET登記H+離子的釋放，所述FET產生指示發(fā)生核苷酸摻入的信號。特定核苷酸流動期間未未摻入的核苷酸不產生信號。來自FET的信號的幅值也可與摻入到擴展核酸分子中的特定類型的核苷酸數目相關，由此允許解析均聚物區(qū)域。因此，在定序器運行期間，多個核苷酸流入反應室中，連同多個井或反應室上的摻入監(jiān)測可允許儀器同時解析許多核酸模板的序列。

在特定實例中，生物傳感器包含傳感器襯底及界定于傳感器襯底上方的流槽。核酸珠?？墒┘拥絺鞲衅饕r底以沉積于傳感器襯底的井中。在施加到利用生物傳感器的檢測系統(tǒng)(例如定序系統(tǒng))之前，珠?？杀┞队诹鬟^流槽的氣體，任選地暴露于凝結反應劑并經歷額外處理。舉例來說，如圖3中所說明，方法300包含將珠粒施加到傳感器襯底，如302處所說明?？赏ㄟ^流槽施加包含珠粒及(任選地)鹽、緩沖劑或表面活性劑的懸浮液。任選地，生物傳感器可進行渦旋或離心以進一步促進珠粒沉積于傳感器襯底的井內。在特定實例中，生物傳感器相對于旋轉平面以至少30°的角度(例如30°與90°之間的角度)進行離心，其中井開口大體上朝向旋轉軸向內面向。流槽內包含懸浮液的生物傳感器可歷時在30秒與15分鐘之間變化的周期進行離心，例如在1分鐘與10分鐘之間變化的周期。

如圖3的304處所說明，可對傳感器襯底進行洗滌，從而從流槽沖洗懸浮液并留下沉積于傳感器襯底的井中的珠粒。在一實例中，在洗滌期間，氣體/液體界面可流動于襯底上方。可通過間歇性地使氣體及液體流過流槽來施加氣體/液體界面，從而形成氣泡。在另一實例中，可形成通過流槽施加的泡沫，從而致使多個氣體/液體界面流動于傳感器襯底的井上方。

如圖4中所說明，當包含珠粒的懸浮液被施加于傳感器襯底上方時，珠粒418部分沉積于井416內，如402處所說明。在洗滌及氣體/液體界面的任選施加之后，如404處所說明，珠?？膳菝?，但仍部分嚙合于井416內。

如圖3的306處所說明，可遍及流槽施加氣體，從而將液體蒸發(fā)出流槽。氣體可被推送通過流槽。替代地，可將氣體抽拉通過流槽以蒸發(fā)液體。當將氣體推送通過流槽時，相對于大氣壓力，流槽內的壓力可增加。當將氣體抽拉通過流槽時，相對于大氣壓力，流槽內的壓力可降低。人們相信使氣體流過流槽且特定來說將氣體抽拉通過流槽將珠粒進一步驅動到井中并部分干燥井，從而從井蒸發(fā)液體。替代地，可使用離心使液體自旋出流槽。氣體可為氮氣、例如氦氣或氬氣的惰性氣體或空氣。如圖4中的406處所說明，氣體流過流槽(特定來說將氣體抽拉通過流槽)進一步將珠粒抽拉到井中。

在一實例中，氣體可歷時至少15秒的周期流過流槽(例如抽拉通過流槽)，例如至少30秒、至少45秒、至少一分鐘、至少1.5分鐘、至少2分鐘或甚至至少5分鐘的周期。一般來說，氣體并不長于30分鐘(例如不長于20分鐘)流過流槽。可以100μL/min到100mL/min范圍內的速率施加氣體，例如500μL/min到60mL/min的范圍、500μL/min到40mL/min的范圍，或甚至1mL/min到20mL/min的范圍。

任選地，可在氣體流動之后將凝結劑施加于傳感器襯底上方，如圖3的308處所說明。凝結反應劑可降低珠粒的直徑，從而將珠粒進一步推送于井內。如圖4中的408處所說明，凝結反應劑的施加導致珠粒收縮并將珠粒進一步抽拉于井內。

示范性凝結反應劑包含凝結劑，例如金屬復合物、堿或堿土金屬鹽、非離子聚合物、乙醇或其組合。在一實例中，凝結劑包含(例如)包含鈷的金屬錯合物，從而形成例如鈷-胺錯合物的鈷有機錯合物。

替代地或另外，凝結反應劑可包含影響珠粒的聚合物基質的密度的凝結劑。舉例來說，溶液可包含可影響珠粒的聚合物基質的密度的醇，例如甲醇、乙醇或異丙醇(IPA)。具體來說，溶液可以0.1vol.％到60vol.％的范圍內的濃度包含例如甲醇的醇，例如0.1vol.％到50vol.％的范圍、0.1vol.％到30vol.％的范圍、0.1vol.％到20vol.％的范圍，或甚至0.1vol.％到10vol.％的范圍。舉例來說，溶液內的醇的濃度可在0.1vol.％到5vol.％，例如1vol.％到5vol.％的范圍內。在另一實例中，溶液可以0.1vol.％到60vol.％的范圍內的濃度包含例如乙醇或IPA的醇，例如1.0vol.％到60vol.％的范圍、5.0vol.％到60vol.％的范圍、10vol.％到60vol.％的范圍，或甚至40vol.％到60vol.％的范圍。

在另一實例中，凝結劑包含濃縮的堿或堿土金屬鹽，例如鹵鹽。在另一實例中，凝結劑可以(例如)20mM到1M的范圍內的濃度包含氯化鎂，例如100mM到800mM的范圍，或甚至100mM到500mM的范圍。

凝結劑可進一步為非離子聚合物，例如聚乙二醇類聚合物。在特定實例中，聚乙二醇類聚合物具有在2000與20000之間的范圍內的分子量，例如5000與15000之間或8000與12000之間。非離子聚合物可以0.1wt％到20.0wt％的范圍內的濃度包含，例如0.5wt％到15.0wt％的范圍、0.5wt％到10wt％的范圍或2.5wt％到7.5wt％的范圍。

凝結反應劑的剩余部分可包含緩沖溶液，例如緩沖鹽水溶液。舉例來說，凝結反應劑的剩余部分可包含磷酸鹽緩沖鹽水溶液。具體來說，溶液可包含鹵化鈉或鹵化鉀鹽、磷酸鈉或磷酸鉀鹽或聚山梨醇酯。此類鹽可以(例如)1mM到500mM的范圍內的量包含在內，例如50mM到350mM的范圍或150mM到250mM的范圍。在一實例中，氯化鉀可以0.5M到2M的范圍內的濃度包含在內，例如0.8M到1.5M的范圍或甚至0.8M到1.2M的范圍。另外或替代地，可使用其它緩沖劑，例如胺類緩沖劑，例如三(羥基甲基)胺基甲烷。此胺緩沖劑可以10mM到1M的范圍內的濃度使用，例如100mM到1M的范圍、100mM到800mM的范圍，或甚至150mM到500mM的范圍。任選地，凝結反應劑可包含其它離子組分，例如衍生自鹽的鈣或鎂。另外，溶液可具有6與9之間的pH，例如6.5與8.5之間或7與8.5之間。

凝結反應劑可包含表面活性劑。舉例來說，表面活性劑可為非離子聚合物表面活性劑，例如聚乙二醇的醚，例如聚乙二醇的辛基苯基醚。非離子聚合物表面活性劑可以0.01％到1.0％的范圍包含在內，例如0.05％到0.8％的范圍、0.05％到0.5％的范圍或甚至0.08％到0.15％的范圍。示范性表面活性劑為TritonX-100。

在一實例中，凝結反應劑包含凝結劑，例如在20mM到500mM范圍內的MgCl₂；鹽，例如在0.8M到1M范圍內的KCl；緩沖劑，例如在150mM到500mM范圍內的三(羥基甲基)胺基甲烷；及表面活性劑，例如在0.05％到0.5％范圍內的TritonX-100。pH處于7到9的范圍。

在另一實例中，凝結反應劑包含凝結劑(例如在20mM到500mM的范圍內的MgCl₂)與在0.5wt％到10.0wt％的范圍內的聚乙二醇的組合。聚乙二醇可具有在1000到15000的范圍內的分子量。凝結反應劑還可包含鹽，例如在0.8M到1M的范圍內的KCl；緩沖劑，例如在10mM到500mM的范圍內的三(羥基甲基)胺基甲烷；或表面活性劑，例如在0.05％到0.5％的范圍內的TritonX-100。pH處于7到9的范圍。

響應于暴露于凝結反應劑，包含核酸鏈的核酸珠粒的直徑可降低。舉例來說，響應于暴露于溶液，珠?；蝾w粒直徑可降低至少1％。在一實例中，直徑降低至少5％，例如至少10％、至少15％或甚至至少19％。在特定實例中，直徑降低不超過75％。另外，響應于暴露于凝結劑，珠?；蝾w粒的密度可增加。舉例來說，密度可增加至少2％，例如至少8％、至少14％、至少21％、至少25％、至少50％、至少65％或甚至至少80％。具體來說，密度增加不超過7500％。

任選地，可一或多次全部重復洗滌傳感器襯底的過程(如圖3的304處所說明)，使氣體流過流槽(如306處所說明)或施加凝結反應劑(如308處所說明)，或部分重復上述過程。

在定序應用或涉及使用酶的其它生物分子應用的情況下，可將酶裝載到沉積于傳感器襯底上的珠粒上，如310處所說明。具體來說，可遍及流槽施加包含酶的溶液并使其與沉積于井內的珠粒接觸。一般來說，與酶的此接觸導致珠粒的動態(tài)直徑或大小增加。

任選地，在裝載酶之后，可再次使用如上文所描述的流動速率及周期執(zhí)行使氣體流過流槽的過程(如312處所說明)，(例如)以從流槽蒸發(fā)液體。由于裝載了酶，珠粒大小增加。舉例來說，如圖4中的410處所說明，裝載酶可帶來珠粒的初始溶脹，且在酶存在情況下的進一步培養(yǎng)可帶來珠粒的進一步溶脹，如412處所說明。在珠粒響應于酶存在情況下的培養(yǎng)溶脹之后將氣體進一步抽拉通過流槽可將珠粒部分抽拉回到井中，如圖4的414處所說明。

如圖3的314處所說明，額外反應劑或其它溶液可流過流槽以制備傳感器襯底用于進一步處理或作為測試例程的部分。舉例來說，包含核苷酸的反應劑溶液可在定序反應期間流動于傳感器襯底上方。

在圖5中所說明的又一示范性方法中，珠粒520可最初自旋于傳感器襯底上的井518中，如502處所說明。可對珠粒520進行洗滌，如504處所說明，且任選地可將氣體/液體界面(例如，呈泡沫形式)施加到傳感器襯底，從而最初增加珠粒520的大小。可如506處所說明地施加凝結劑，且可移除液體且接著可蒸發(fā)液體(如508處所說明)以收縮珠粒520并將其更深地驅動到井518中。移除液體可包含施加空氣氣泡以從流槽驅動液體或使流槽自旋以將液體迫出并將空氣抽入?？赏ㄟ^將空氣或干燥氮氣抽拉通過傳感器襯底的流槽或將空氣或氮氣推送通過流槽來實現從流槽蒸發(fā)液體。

在移除液體之后，可對珠粒520進行洗滌，如510處所說明?？稍俅问┘幽Y劑并蒸發(fā)液體(例如，施加氣體)，如512處所說明?？梢?次與2次之間的次數重復洗滌、凝結及蒸發(fā)(522)。

如514處所說明，可將酶裝載到珠粒520中，且任選地可對珠粒進行洗滌并施加氣體，如516處所說明。

用于將珠粒裝載到包含井的傳感器襯底上的上文所描述方法的實施例提供將珠粒(特定來說結合到核酸或蛋白質的珠粒)抽拉到傳感器襯底的井中的技術優(yōu)勢。將此類珠粒較好安放并沉積于井中增加關鍵信號或降低信噪比。另外，此過程尤其適于摻入水凝膠珠粒的系統(tǒng)及利用表面上展現OH基團的井壁或傳感器表面的系統(tǒng)。即使在此類OH基團由表面涂層部分阻擋的情況下，上文所描述方法的實施例仍提供經改良裝載、較高關鍵信號或較高信噪比。

如上文所描述，可將核酸珠粒裝載到用于測定核酸珠粒的特性的生物傳感器中。具體來說，核酸珠?？捎糜诙ㄐ蚪Y合到核酸珠粒的靶序列。舉例來說，定序可包含免標記DNA定序，且具體來說，基于pH的DNA定序。將包含DNA模板且具有底涂劑及可操作地鍵結的聚合酶的襯底裝載到反應室(例如微孔)中，之后進行去氧核苷三磷酸(dNTP)添加及洗滌的重復循環(huán)。此類模板通常作為克隆種群附著到襯底，例如，微粒、珠?；蚱漕愃普?，且將此類克隆種群裝載到反應室中。在所述循環(huán)的每一添加步驟中，當模板中的下一堿基為所添加dNTP的互補序列時，聚合酶通過摻入所添加dNTP來擴展底涂劑。當存在一個互補堿基時，存在一次摻入，當存在兩個互補堿基時，存在兩次摻入，當存在三個互補堿基時，存在三次摻入，以此類推。伴隨著每一次此摻入，存在釋放的氫離子，且總體來說釋放氫離子的模板種群使反應室的局部pH發(fā)生非常輕微的改變，這由電子傳感器檢測到。

圖6圖解說明用于進行基于pH的核酸定序的設備。設備的每一電子傳感器產生取決于參考電壓的值的輸出信號。在圖6中，含有流體回路(602)的外殼(600)由入口連接到反應劑儲槽(604、606、608、610及612)、到廢料儲槽(620)并由通路(632)連接到流槽(634)，所述通路將流體節(jié)點(630)連接到流槽(634)的入口(638)。來自儲槽(604、606、608、610及612)的反應劑可由多種方法(包含壓力、例如注射泵的泵、重力供給及其類似者)驅動到流體回路(602)并通過閥(614)的控制來選擇。控制系統(tǒng)(618)包含用于閥(614)的控制器，其產生用于通過電連接(616)打開及閉合的信號。控制系統(tǒng)(618)還包含用于系統(tǒng)的其它組件的控制器，所述組件例如由(622)連接到其上的洗滌溶液閥(624)及參比電極(628)?？刂葡到y(tǒng)(618)還可包含用于流槽(634)的控制及數據獲取功能。在一個操作模式中，流體回路(602)在控制系統(tǒng)(618)的編程控制下將一序列選定反應劑(1、2、3、4或5)輸送到流槽(634)，使得在選定反應劑流動之間，流體回路(602)被底涂及洗滌，且洗滌流槽(634)。進入流槽(634)的流體通過出口(640)離開并沉積于廢料容器(636)中。在此操作過程中，發(fā)生于流槽(634)中的反應或測量具有穩(wěn)定參考電壓，這是因為參比電極(628)具有與流槽(634)的連續(xù)(亦即不間斷)電解質路徑，但僅與洗滌溶液物理接觸。

實例

將結合到核酸的水凝膠聚丙烯酰胺珠粒沉積于具有0.7μm的井直徑的傳感器襯底上。井由氮化硅壁形成。底層傳感器墊及所述壁的一部分由用ImPA表面處理的鈦形成。珠粒具有大約0.68μm的平均直徑且染色有可從生命技術公司獲得的SYBR金熒光染料。

將包含珠粒的懸浮液施加于襯底表面上方以將珠粒至少部分沉積于井內，如圖7中的圖像1所說明。圖像包含不含井且表示沉積于填隙式表面上的珠粒的較亮中心條帶。具有較低強度的沉積于中心條帶的兩側上的珠粒至少部分沉積于井內。井內的珠粒的平均強度與填隙式中心條帶上的珠粒的平均強度的比率指示珠粒沉積的井內的深度。如圖8中的條柱1所說明，平均珠粒具有0.3與0.35之間的強度比率(平均沉積珠粒強度與填隙式表面上的珠粒的平均強度的比率)。在將氣體抽拉通過流槽以從井蒸發(fā)液體之后，井內沉積的平均珠粒展現較低強度比率，如圖7中的圖像2及圖8中的條柱2所說明。強度比率的此減少表示珠粒被又一次抽拉到井中。

用包含100mmol的氯化鎂及具有大約10,000的分子量的5wt％聚乙二醇的凝結反應劑進一步處理珠粒。如圖7的圖像3及圖8的條柱3處所說明，在用凝結劑處理之后，強度比率明顯下降。

可在凝結反應劑存在情況下通過離心使珠粒進一步自旋，如圖7的圖像4或圖8的條柱4處所說明。在凝結劑存在情況下的此自旋對強度比率具有受限的影響且可實際上增加強度比率。

可在酶存在情況下培養(yǎng)珠粒。如圖7的圖像5及圖8的條柱5處所說明，在酶存在情況下的此培養(yǎng)導致珠粒溶脹且因此增加強度比率。在裝載酶之后可進一步將氣體抽拉通過流槽以從井蒸發(fā)液體，從而導致珠粒具有略微較低的強度比率，如圖7的圖像6及圖8的條柱6處所說明。

在第一方面中，一種將珠粒裝載到傳感器襯底上的方法包含：將包含珠粒的懸浮液施加到界定于傳感器襯底上方的流槽，傳感器襯底包括多個井，珠粒至少部分沉積于多個井中；從流槽移除液體；從流槽蒸發(fā)液體；及將水合溶液施加到流槽。

在第一方面的一實例中，施加懸浮液包含在珠粒存在情況下離心傳感器襯底。

在第一方面的另一實例及上文實例中，所述方法進一步包含在從流槽蒸發(fā)液體之前，使一或多個氣泡流過流槽并在傳感器襯底上方流動。

在第一方面的另一實例及上文實例中，從流槽蒸發(fā)液體包含歷時至少15秒且不長于30分鐘的周期將氣體抽拉通過流槽。

在第一方面的額外實例及上文實例中，從流槽蒸發(fā)液體包含以100μL/min到100mL/min的范圍內的速率將氣體抽拉通過流槽。

在第一方面的另一實例及上文實例中，所述方法進一步包含將凝結溶液施加于傳感器襯底上方。舉例來說，施加凝結溶液包含在從流槽蒸發(fā)液體之后施加凝結溶液。在一實例中，施加凝結溶液包含在從流槽蒸發(fā)液體之前施加凝結溶液。在另一實例中，凝結溶液包含凝結劑。舉例來說，凝結劑包含鎂、聚乙二醇聚合物或其組合。

在第一方面的另一實例及上文實例中，所述方法進一步包含遍及流槽施加酶溶液并在傳感器襯底上方施加酶溶液。舉例來說，所述方法進一步包含在施加酶溶液之后從流槽移除液體及從流槽蒸發(fā)液體。

在第一方面的額外實例及上文實例中，傳感器襯底包含半導體定序裝置。在一實例中，半導體定序裝置包含pH傳感器的陣列。舉例來說，所述方法進一步包含使用半導體定序裝置進行定序。

在第一方面的另一實例及上文實例中，珠粒包含水凝膠珠粒。

在第二方面中，一種將珠粒裝載到傳感器襯底上的方法包含：將包含核酸珠粒的懸浮液施加到界定于傳感器襯底上方的流槽，傳感器襯底包括多個井，珠粒至少部分沉積于多個井中；使氣體/液體界面流動通過流槽及傳感器襯底上方；歷時至少15秒且不長于30分鐘的周期以100μL/min到100mL/min的范圍內的速率從流槽蒸發(fā)液體；及遍及流槽施加凝結溶液。

在第二方面的一實例中，凝結溶液包含鎂鹽及聚乙二醇聚合物。

在第二方面的另一實例及上文實例中，使氣體/液體界面流動包含使泡沫流過流槽。

在第二方面的另一實例及上文實例中，所述方法進一步包含在施加凝結溶液之后遍及流槽施加酶溶液。

應注意，并不要求上文在一般描述或實例中所描述的所有活動，可能不要求特定活動的一部分且除所描述內容之外可執(zhí)行一或多個其它活動。再者，活動所列的順序未必是執(zhí)行順序。

在前文說明書中，所述概念已經參考特定實施例來描述。然而，所屬領域的一般技術人員了解，可在不脫離如下文權利要求書中所闡述的本發(fā)明范圍的情況下進行各種修改及改變。因此，本說明書及圖式應該以說明性而非限制性意義來看待，且所有此類修改意圖包含在本發(fā)明的范圍內。

如本文中所使用，術語“包括(comprises、comprising)”、“包含(includes、including)”、“具有(has、having)”或其任何其它變化旨在涵蓋非排它性的包含。舉例來說，包括一列特征的過程、方法、制品或設備未必僅限于那些特征，俄式可包含沒有明確列出或此類過程、方法、制品或設備所固有的其它特征。另外，除非明確陳述為相反，否則“或”是指包含性的或而不是排它性的或。舉例來說，通過以下中的任一者來滿足條件A或B：A為真(或存在)且B為假(或不存在)，A為假(或不存在)且B為真(或存在)，及A及B都為真(或存在)。

同樣，使用“一(a/an)”是用來描述本文中描述的要素及組分。這樣做只是為方便起見且給出本發(fā)明范圍的一般性意義。除非顯而易見指的是其它情況，否則此描述應該理解為包含一個或至少一個，且單數也包含多個。

上文已關于特定實施例描述了益處、其它優(yōu)勢及對問題的解決方案。然而，所述益處、優(yōu)勢、對問題的解決方案及任何特征(它們可能引起任何益處、優(yōu)勢或解決方案出現或變得更突出)不應該被理解為任何或所有權利要求的一關鍵、所要求或必需特征。

在閱讀本說明書之后，本領域技術人員將了解，為了清楚起見，在單獨實施例的情況下描述的本文中的某些特征也可在單個實施例中以組合形式提供。相反地，為了簡潔起見，在單個實施例的情況下所描述的各種特征也可單獨地或以任何次組合形式提供。另外，對以范圍陳述的值的參考包含在那個范圍內的每一個值。