本發(fā)明涉及硅膠基質(zhì)分離材料，具體的說是親水性聚合物固定相及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

親水作用色譜法(Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography，HILIC)是一種用于分離極性化合物的色譜技術(shù)，最早是由Alpert于1990年提出的(Alpert,A.J.et al,J.Chromatogr.1990.499,177-196.)。作為RPLC的有效補(bǔ)充，HILIC模式近年來得到廣泛的應(yīng)用，其中親水性固定相種類也越來越豐富[Guo,Y.et al.,J.Chromatogr.A,2005,1074,71-80；Jandera,P.et al.,J.Sep.Sci,2008,31,1421-1437；P.et al.,J.Sep.Sci,2006,29,1784-1821；Buszewski,B.et al.,Anal.Bioanal.Chem,2012,402,231-247.]。盡管如此，小分子親水固定相的開發(fā)逐步遭遇瓶頸。受到硅膠本身比表面積和鍵合效率的制約，小分子鍵合相的官能團(tuán)數(shù)量有限，親水性已經(jīng)很難大幅提升。因此，發(fā)展親水性聚合物鍵合相，通過增加聚合物鏈的長度和改變聚合物鏈的組成，提高分離材料的親水性和分離選擇性，可以突破親水性固定相的發(fā)展瓶頸。

聚合反應(yīng)和聚合物在硅膠表面的固載是發(fā)展親水性聚合物鍵合相的關(guān)鍵和基礎(chǔ)。目前，主要通過兩種方式將聚合物固載到固體表面：“grafting to”技術(shù)和“grafting from”技術(shù)[Barbey,R.et al.,Chem.Rev,2009,109,5437-5527.]。其中“grafting to”技術(shù)由于聚合物鏈預(yù)先在溶液中合成，鍵合到固體表面時(shí)會受到空間位阻的影響，導(dǎo)致聚合物的鍵合密度不高?！癵rafting from”技術(shù)，由于溶液中的單體體積小，易擴(kuò)散到固體表面發(fā)生鏈增長反應(yīng)，得到的聚合物的鍵合密度高，但是固體表面的聚合反應(yīng)不易控制，得到的聚合物的分子量分布較寬。RAFT試劑[Moad,G.et al,Aust.J.Chem,2012,65,985-1076]是一種鏈轉(zhuǎn)移試劑，在聚合反應(yīng)過程中，能夠與鏈增長自由基發(fā)生一系列的可逆加成-斷裂的平衡反應(yīng)，使聚合反應(yīng)變得可控。將巰基通過硅烷化反應(yīng)鍵合到硅膠表面，經(jīng)引發(fā)后發(fā)生表面聚合反應(yīng)，同時(shí)在反應(yīng)液中加入RAFT試劑加以控制，可以得到分子量可控且分布范圍窄，鍵合密度均勻的親水性聚合物固定相。當(dāng)前，尚未出現(xiàn)使用此方法制備親水性聚合物固定相的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種親水性聚合物固定相及其制備方法和應(yīng)用。該固定相中含有特征的硫醚連接基團(tuán)，其結(jié)構(gòu)式如下：

其中Silica為硅膠；n＝1-100的整數(shù)；

-R₁＝-H或-CH₃；

本發(fā)明還提供了上述固定相的制備方法，其特征在于包括如下步驟：

a.硅膠預(yù)處理：硅膠加入質(zhì)量濃度為1％～38％的鹽酸或硝酸溶液中，加熱至回流，攪拌1～48小時(shí)，過濾，水洗至中性，于80～160℃下干燥至恒重；

b.硅膠表面引入巰基：將步驟a所得干燥硅膠置于玻璃或者聚四氟乙烯反應(yīng)容器中，在氮?dú)夥諊录尤胗袡C(jī)溶劑攪拌，滴加硅烷偶聯(lián)劑，保持溫度為60～140℃條件下攪拌2～48小時(shí)。反應(yīng)體系冷卻至室溫，減壓過濾并用甲醇、水、四氫呋喃、甲醇洗滌，固體產(chǎn)品在60～90℃條件下干燥6-24小時(shí)即得3-巰基丙基硅膠；

所述制備方法步驟b所用的有機(jī)溶劑為甲醇、乙醇、乙腈、甲苯、二甲苯、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺中的一種；每克硅膠所需有機(jī)溶劑的量為5-30mL；

所述制備方法步驟b所用硅烷偶聯(lián)劑有如下結(jié)構(gòu)：

其中，X為-OCH₃或-OCH₂CH₃。

所述制備方法步驟b中硅烷偶聯(lián)劑的使用量為每克硅膠使用0.1mL-2mL；

c.巰基-烯烴“可控”聚合反應(yīng)制備聚合物固定相：將步驟b所得的3-巰基丙基硅膠中加入體積比為1/10～10/1的水/有機(jī)溶劑混合溶劑中，每克3-巰基丙基硅膠所需混合溶劑量為5-50mL，再加入引發(fā)劑，RAFT試劑和單體，攪拌使其完全溶解。體系經(jīng)抽真空-通氮?dú)?，循環(huán)三次除氧后在40～70℃條件下反應(yīng)10～100小時(shí)。過濾，依次用水，甲醇洗滌，所得固體于60～90℃條件下干燥6～48小時(shí)，即得聚合物固定相；

所述制備方法步驟c所用有機(jī)溶劑為甲醇、乙醇、乙腈、N,N-二甲基甲酰胺等能與水互溶的有機(jī)溶劑中的一種；

所述制備方法步驟c所用單體為

等中的一種或幾種；

所述步驟c所用單體使用量為每克3-巰基丙基硅膠使用1～100mmol；

所述制備方法步驟c所用的引發(fā)劑為偶氮二異丁腈或偶氮二異庚腈；

所述制備方法步驟c中引發(fā)劑使用量為每克3-巰基丙基硅膠使用0.01～10mmol；

所述制備方法步驟c中RAFT試劑為4-氰基-4-(硫代苯甲酰)戊酸等二硫代酯或者4-氰基-4-[[(十二烷硫基)硫酮甲基]硫基]戊酸等三硫代碳酸酯中的一種，其結(jié)構(gòu)式如下：

RAFT試劑：

其中

優(yōu)選為4-氰基-4-(硫代苯甲酰)戊酸或4-氰基-4-[[(十二烷硫基)硫酮甲基]硫基]戊酸。

所述制備方法步驟c中RAFT試劑使用量為每克3-巰基丙基硅膠使用0.01～20mmol。

使用本發(fā)明提供的方法制得的固定相可作為分離材料，廣泛用于糖類、蛋白質(zhì)、多肽、核苷，氨基糖苷化合物以及堿性化合物萊克多巴胺，石杉堿甲，普萘洛爾，地昔帕明，阿米替林的選擇性富集與分離。

本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：

1.聚合反應(yīng)可控。在自由基聚合中加入RAFT試劑加以控制，得到的聚合物分子量可控，分布范圍窄。

2.固定相結(jié)構(gòu)新穎。該固定相為聚合物固定相，通過增加聚合物鏈的長度和改 變聚合物鏈的組成，能夠提高分離材料的親水性；通過不同官能團(tuán)的單體共聚或者嵌段，能夠得到多功能鍵合相，提高分離選擇性。

3.應(yīng)用范圍廣。本發(fā)明提供的親水性聚合物鍵合固定相適合用于核苷、糖類、多肽、蛋白質(zhì)等的分離分析和分離制備。

4.制備過程簡單可靠，有利于實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。

附圖說明：

圖1為實(shí)施例1中制得的固定相對核苷分離分析結(jié)果圖；

圖2為實(shí)施例1中制得的固定相對多肽分離分析結(jié)果圖；

圖3為實(shí)施例1中制得的固定相對氨基糖苷分離分析結(jié)果圖；

圖4為實(shí)施例6中制得的固定相對糖異構(gòu)體分離分析結(jié)果圖；

圖5為實(shí)施例2中制得的固定相對堿性化合物分離分析結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)例，對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。實(shí)例僅限于說明本發(fā)明，而非對本發(fā)明的限定。

實(shí)施例1

稱取10g球形硅膠(粒徑為5μm，孔徑為20nm，比表面積150m²/g)，置于250mL玻璃燒瓶中，加入150mL體積濃度為5％的鹽酸溶液，加熱回流12小時(shí)，冷卻至室溫，過濾，水洗至中性，150℃干燥24小時(shí)。

將干燥后的硅膠置于100mL三口玻璃瓶中，在通入干燥的氮?dú)獾臈l件下，向硅膠中加入50mL甲苯，攪拌均勻，然后滴加6mL巰丙基三乙氧基硅烷，于115℃條件回流攪拌反應(yīng)16小時(shí)。反應(yīng)體系過濾，依次用甲醇、水、四氫呋喃、甲醇洗滌，產(chǎn)物在80℃條件下干燥12小時(shí)即得巰丙基硅膠。

將干燥后的巰丙基硅膠置于250mL三口玻璃瓶中，加入8.52g丙烯酰胺，0.17g 4-氰基戊酸二硫代苯甲酸和0.66g偶氮二異丁腈，然后加入甲醇和水各40mL。體系除氧后，在65℃條件下攪拌48小時(shí)，減壓過濾并用水、甲醇洗滌，固體產(chǎn)品在80℃條件下干燥12小時(shí)即得聚丙烯酰胺固定相。

實(shí)施例2

使用丙烯酸代替實(shí)施例1中的丙烯酰胺，其他原料和步驟以及反應(yīng)條件均同實(shí)施例1，按實(shí)施例1的合成步驟可得聚丙烯酸固定相。

實(shí)施例3

使用丙烯酸羥乙酯代替實(shí)施例1中的丙烯酰胺，其他原料和步驟以及反應(yīng)條件均同實(shí)施例1，按實(shí)施例1的合成步驟可得聚丙烯酸羥乙酯固定相。

實(shí)施例4

使用乙烯基咪唑代替實(shí)施例1中的丙烯酰胺，其他原料和步驟以及反應(yīng)條件均同實(shí)施例1，按實(shí)施例1的合成步驟可得聚乙烯基咪唑固定相。

實(shí)施例5

使用乙烯基吡咯烷酮代替實(shí)施例1中的丙烯酰胺，其他原料和步驟以及反應(yīng)條件均同實(shí)施例1，按實(shí)施例1的合成步驟可得聚乙烯基吡咯烷酮固定相。

實(shí)施例6

稱取10g球形硅膠(粒徑為5μm，孔徑為20nm，比表面積150m²/g)，置于250mL玻璃燒瓶中，加入150mL體積濃度為5％的鹽酸溶液，加熱回流12小時(shí)，冷卻至室溫，過濾，水洗至中性，150℃干燥24小時(shí)。

將干燥后的硅膠置于100mL三口玻璃瓶中，在通入干燥的氮?dú)獾臈l件下，向硅膠中加入50mL甲苯，攪拌均勻，然后滴加6mL巰丙基三乙氧基硅烷，于115℃條件回流攪拌反應(yīng)16小時(shí)。反應(yīng)體系過濾，依次用甲醇、水、四氫呋喃、甲醇洗滌，產(chǎn)物在80℃條件下干燥12小時(shí)即得巰丙基硅膠。

將干燥后的巰丙基硅膠置于500mL三口玻璃瓶中，加入33.40g丙烯酰胺二甲基丙基磺酸胺乙酯，0.17g 4-氰基戊酸二硫代苯甲酸和0.66g偶氮二異丁腈，然后加入甲醇和水各50mL，抽真空-通氮?dú)?，循環(huán)三次。體系除氧后在70℃條件下攪拌48小時(shí)，減壓過濾并用水、甲醇洗滌，固體產(chǎn)品在80℃條件下干燥12小時(shí)即得聚丙烯酰胺二甲基丙基磺酸胺乙酯固定相。

實(shí)施例7

使用丙烯酰胺二甲基丙基羧酸胺乙酯代替實(shí)施6中的丙烯酰胺二甲基丙基磺酸胺乙酯，其他原料和步驟以及反應(yīng)條件均同實(shí)施例6，按實(shí)施例6的合成步驟可得聚基丙烯酸二甲基丙基羧酸胺乙酯固定相。

實(shí)施例8

使用烯基麥芽糖代替實(shí)施例6中的丙烯酰胺二甲基丙基磺酸胺乙酯，其他原料和步驟以及反應(yīng)條件均同實(shí)施例6，按實(shí)施例6的合成步驟可得聚烯基麥芽糖固定相。

實(shí)施例9

使用烯基環(huán)糊精代替實(shí)施例6中的丙烯酰胺二甲基丙基磺酸胺乙酯，其他原料和步驟以及反應(yīng)條件均同實(shí)施例6，按實(shí)施例6的合成步驟可得聚烯基環(huán)糊精固定相。

實(shí)施例10

使用寡聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯代替實(shí)施例6中的丙烯酰胺二甲基丙基磺酸胺乙酯，其他原料和步驟以及反應(yīng)條件均同實(shí)施例6，按實(shí)施例6的合成步驟可得聚寡聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯固定相。

實(shí)施例11

稱取10g球形硅膠(粒徑為5μm，孔徑為20nm，比表面積150m²/g)，置于250mL玻璃燒瓶中，加入150mL體積濃度為5％的鹽酸溶液，加熱回流12小時(shí)，冷卻至室溫，過濾，水洗至中性，150℃干燥24小時(shí)。

將干燥后的硅膠置于100mL三口玻璃瓶中，在通入干燥的氮?dú)獾臈l件下，向硅膠中加入50mL甲苯，攪拌均勻，然后滴加6mL巰丙基三乙氧基硅烷，于115℃條件回流攪拌反應(yīng)16小時(shí)。反應(yīng)體系過濾，依次用甲醇、水、四氫呋喃、甲醇洗滌，產(chǎn)物在80℃條件下干燥12小時(shí)即得巰丙基硅膠。

將干燥后的巰丙基硅膠置于250mL三口玻璃瓶中，加入8.52g丙烯酰胺，0.34g 4-氰基戊酸二硫代苯甲酸和0.66g偶氮二異丁腈，然后加入經(jīng)脫氧氣處理的甲醇和水各40mL。體系除氧后在60℃條件下攪拌24小時(shí)，減壓過濾并用水、甲醇洗滌，固體產(chǎn)品在80℃條件下干燥12小時(shí)即得聚丙烯酰胺固定相。

實(shí)施例12

稱取10g球形硅膠(粒徑為5μm，孔徑為20nm，比表面積150m²/g)，置于250mL玻璃燒瓶中，加入150mL體積濃度為5％的鹽酸溶液，加熱回流12小時(shí)，冷卻至室溫，過濾，水洗至中性，150℃干燥24小時(shí)。

將干燥后的硅膠置于100mL三口玻璃瓶中，在通入干燥的氮?dú)獾臈l件下，向硅膠中加入50mL甲苯，攪拌均勻，然后滴加6mL巰丙基三乙氧基硅烷，于115℃條件回流攪拌反應(yīng)16小時(shí)。反應(yīng)體系過濾，依次用甲醇、水、四氫呋喃、甲醇洗滌，產(chǎn)物在80℃條件下干燥12小時(shí)即得巰丙基硅膠。

將干燥后的巰丙基硅膠置于250mL三口玻璃瓶中，加入8.52g丙烯酰胺，0.17g 4-氰基戊酸二硫代苯甲酸和0.33g偶氮二異丁腈，然后加入經(jīng)脫氧氣處理的甲醇和水各40mL。體系除氧后在70℃條件下攪拌24小時(shí)，減壓過濾并用水、甲醇洗滌，固體產(chǎn)品在80℃條件下干燥12小時(shí)即得聚丙烯酰胺固定相。

實(shí)施例13

稱取10g球形硅膠(粒徑為5μm，孔徑為10nm，比表面積300m²/g)，置于250mL玻璃燒瓶中，加入150mL體積濃度為5％的鹽酸溶液，加熱回流12小時(shí)，冷卻至室溫，過濾，水洗至中性，150℃干燥24小時(shí)。

將干燥后的硅膠置于100mL三口玻璃瓶中，在通入干燥的氮?dú)獾臈l件下，向硅膠中加入50mL甲苯，攪拌均勻，然后滴加6mL巰丙基三乙氧基硅烷，于115℃條件回流攪拌反應(yīng)16小時(shí)。反應(yīng)體系過濾，依次用甲醇、水、四氫呋喃、甲醇洗滌，產(chǎn)物在80℃條件下干燥12小時(shí)即得巰丙基硅膠。

將干燥后的巰丙基硅膠置于250mL三口玻璃瓶中，加入17.04g丙烯酰胺，0.34g 4-氰基戊酸二硫代苯甲酸和1.32g偶氮二異丁腈，然后加入甲醇和水各80mL，抽真空-通氮?dú)猓h(huán)三次。體系除氧后在65℃條件下攪拌72小時(shí)，減壓過濾并用水、甲醇洗滌，固體產(chǎn)品在80℃條件下干燥12小時(shí)即得聚丙烯酰胺固定相。

實(shí)施例14

稱取10g球形硅膠(粒徑為5μm，孔徑為20nm，比表面積150m²/g)，置于250mL玻璃燒瓶中，加入150mL體積濃度為5％的鹽酸溶液，加熱回流12小時(shí)，冷卻至室溫，過濾，水洗至中性，150℃干燥24小時(shí)。

將干燥后的硅膠置于100mL三口玻璃瓶中，在通入干燥的氮?dú)獾臈l件下， 向硅膠中加入50mL甲苯，攪拌均勻，然后滴加6mL巰丙基三乙氧基硅烷，于115℃條件回流攪拌反應(yīng)16小時(shí)。反應(yīng)體系過濾，依次用甲醇、水、四氫呋喃、甲醇洗滌，產(chǎn)物在80℃條件下干燥12小時(shí)即得巰丙基硅膠。

將干燥后的巰丙基硅膠置于250mL三口玻璃瓶中，加入8.52g丙烯酰胺，0.17g 4-氰基戊酸二硫代苯甲酸和0.66g偶氮二異丁腈，然后加入甲醇20mL和水60mL。體系除氧后在65℃條件下攪拌24小時(shí)，減壓過濾并用水、甲醇洗滌，固體產(chǎn)品在80℃條件下干燥12小時(shí)即得聚丙烯酰胺固定相。

實(shí)施例15

稱取10g球形硅膠(粒徑為5μm，孔徑為20nm，比表面積150m²/g)，置于250mL玻璃燒瓶中，加入150mL體積濃度為5％的鹽酸溶液，加熱回流12小時(shí)，冷卻至室溫，過濾，水洗至中性，150℃干燥24小時(shí)。

將干燥后的硅膠置于100mL三口玻璃瓶中，在通入干燥的氮?dú)獾臈l件下，向硅膠中加入50mL甲苯，攪拌均勻，然后滴加6mL巰丙基三乙氧基硅烷，于115℃條件回流攪拌反應(yīng)16小時(shí)。反應(yīng)體系過濾，依次用甲醇、水、四氫呋喃、甲醇洗滌，產(chǎn)物在80℃條件下干燥12小時(shí)即得巰丙基硅膠。

將干燥后的巰丙基硅膠置于250mL三口玻璃瓶中，加入8.52g丙烯酰胺，0.17g 4-氰基戊酸二硫代苯甲酸和0.66g偶氮二異丁腈，然后加入DMF和水各40mL。體系除氧后在60℃條件下攪拌24小時(shí)，減壓過濾并用水、甲醇洗滌，固體產(chǎn)品在80℃條件下干燥12小時(shí)即得聚丙烯酰胺固定相。

實(shí)施例16

稱取10g球形硅膠(粒徑為5μm，孔徑為20nm，比表面積150m²/g)，置于250mL玻璃燒瓶中，加入150mL體積濃度為5％的鹽酸溶液，加熱回流12小時(shí)，冷卻至室溫，過濾，水洗至中性，150℃干燥24小時(shí)。

將干燥后的硅膠置于100mL三口玻璃瓶中，在通入干燥的氮?dú)獾臈l件下，向硅膠中加入50mL甲苯，攪拌均勻，然后滴加6mL巰丙基三乙氧基硅烷，于115℃條件回流攪拌反應(yīng)16小時(shí)。反應(yīng)體系過濾，依次用甲醇、水、四氫呋喃、甲醇洗滌，產(chǎn)物在80℃條件下干燥12小時(shí)即得巰丙基硅膠。

將干燥后的巰丙基硅膠置于250mL三口玻璃瓶中，加入8.52g丙烯酰胺，0.25g 4-氰基-4-[(十二烷基硫烷基硫代羰基)硫烷基]戊酸和0.66g偶氮二異丁腈，然后加入甲醇和水各40mL。體系除氧后在65℃條件下攪拌24小時(shí)，減壓過濾并用水、甲醇洗滌，固體產(chǎn)品在80℃條件下干燥12小時(shí)即得聚丙烯酰胺固定相。

實(shí)施例17

使用實(shí)施例1所得色譜固定相1裝填4.6×150mm色譜柱，用于核苷分離分析。如圖1所示，核苷得到很好的分離。色譜條件為：

色譜柱：4.6×150mm

流動相：A,100mM甲酸銨(pH＝3.2)；B,乙腈；C,水；梯度條件：0-20min,A/B/C＝10/90/0→A/B/C＝10/75/15

流速：1mL/min

柱溫：30℃

檢測波長：260nm

實(shí)施例18

使用實(shí)施例1所得色譜固定相1裝填4.6×150mm色譜柱，用于多肽分離分析。如圖2所示，多肽得到很好的分離。色譜條件為：

色譜柱：4.6×150mm

流動相：A,100mM磷酸二氫鈉(pH＝3.0)；B,乙腈；C,水；梯度條件：0-5min,A/B/C＝5/75/20→A/B/C＝5/65/30；5-15min,A/B/C＝5/65/30→A/B/C＝5/40/55

流速：1mL/min

柱溫：30℃

檢測波長：210nm

實(shí)施例19

使用實(shí)施例1所得色譜固定相1裝填4.6×150mm色譜柱，用于氨基糖苷分離分析。如圖3所示，氨基糖苷得到很好的分離。色譜條件為：

色譜柱：4.6×150mm

流動相：A,100mM甲酸銨(pH＝3.2)；B,乙腈；C,水；梯度條件：0-20min,A/B/C＝10/70/20→A/B/C＝10/60/30

流速：1mL/min

柱溫：30℃

檢測波長：ELS detector

實(shí)施例20

使用實(shí)施例6所得色譜固定相6裝填4.6×150mm色譜柱，用于糖異構(gòu)體分離分析。如圖4所示，糖異構(gòu)體得到很好的分離。色譜條件為：

色譜柱：4.6×150mm

流動相：80％ACN，20％H₂O

流速：1mL/min

柱溫：30℃

檢測波長：ELS detector

實(shí)施例21

使用實(shí)施例2所得色譜固定相2裝填4.6×150mm色譜柱，用于堿性化合物分離分析。如圖5所示，堿性化合物得到很好的分離。色譜條件為：

色譜柱：4.6×150mm

流動相：A,200mM磷酸二氫鈉(pH＝4.5)；B,乙腈；C,水；梯度條件：0-25min,A/B/C＝20/30/50→A/B/C＝50/30/20

流速：1mL/min

柱溫：30℃

檢測波長：220nm。