專利名稱：磁響應(yīng)性極高吸附容量溶菌酶分子印跡納米粒子制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)和新材料領(lǐng)域，涉及溶菌酶分子印跡納米粒子的制備，具體 涉及具有磁響應(yīng)性和極高吸附容量的溶菌酶分子印跡納米粒子的制備方法，此納米粒子既 具有對(duì)溶菌酶的特異性吸附，又具有超順磁性，可實(shí)現(xiàn)外界磁性作用下的快速分離，避免了 傳統(tǒng)的復(fù)雜前處理程序。
背景技術(shù)：
溶菌酶(Iysozyme)又稱胞壁質(zhì)酶(muramidase)或N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶 (N-acetylmuramide glycanohydrlase)，是一種能水解致病菌中黏多糖的堿性酶。主要通 過(guò)破壞細(xì)胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之間的β -1，4糖苷鍵，使細(xì)胞壁不溶 性黏多糖分解成可溶性糖肽，導(dǎo)致細(xì)胞壁破裂內(nèi)容物逸出而使細(xì)菌溶解。溶菌酶還可與帶 負(fù)電荷的病毒蛋白直接結(jié)合，與DNA、RNA、脫輔基蛋白形成復(fù)鹽，使病毒失活。因此，該酶具 有抗菌、消炎、抗病毒等作用。目前，溶菌酶已成為當(dāng)前各領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域， 胃組織中溶菌酶的表達(dá)與胃癌的預(yù)后有十分密切的關(guān)系，血清中的溶菌酶與黑色素腫瘤免 疫、白血病分型有關(guān)；在生物醫(yī)藥領(lǐng)域，溶菌酶可用于抗菌消炎、增強(qiáng)免疫劑；在食品安全 領(lǐng)域，溶菌酶是一種抗菌保鮮的食品添加劑；因此，開(kāi)展溶菌酶的提純和檢測(cè)具有十分重要 的現(xiàn)實(shí)意義。分子印跡技術(shù)，就是以目標(biāo)分子為模板分子，將結(jié)構(gòu)上具有互補(bǔ)的功能化聚合物 單體通過(guò)共價(jià)或非共價(jià)鍵與模板分子結(jié)合，并加入交聯(lián)劑進(jìn)行聚合反應(yīng)，反應(yīng)完成后通過(guò) 物理或化學(xué)方法將模板分子洗脫出來(lái)，形成的一種具有固定空穴大小和形狀及有確定排列 功能團(tuán)的交聯(lián)高聚物。此類聚合物既保持了高聚物操作較簡(jiǎn)單，產(chǎn)率高，物理和化學(xué)穩(wěn)定性 強(qiáng)，保存方便的優(yōu)良特性，又具有生物抗體特有的親和力和選擇性，已成為當(dāng)前目標(biāo)物提純 和凈化的首先方法。此外，磁性材料的引入可以賦予仿生人工抗體以磁性，實(shí)現(xiàn)在保持其特 異性識(shí)別和專一性吸附特性的同時(shí)實(shí)現(xiàn)快速的磁分離，為分子印跡納米粒子的應(yīng)用提供一 個(gè)廣闊的發(fā)展空間。目前，小分子的印記技術(shù)已趨于完善，而大生物大分子諸如蛋白、基因、細(xì)胞等的 分子印記技術(shù)處于起步階段，依然面臨極大的挑戰(zhàn)。最大的難題是由于生物蛋白分子龐大， 構(gòu)建的吸附位點(diǎn)較少，蛋白印跡的選擇性不高。本發(fā)明擬利用納米粒子比表面積大的特性， 將分子印跡薄膜緊密生長(zhǎng)其上，并利用多種作用力構(gòu)建出對(duì)溶菌酶特異性吸附的三維孔穴 結(jié)構(gòu)，提高分子印跡聚合物的吸附容量，為大分子印記技術(shù)的發(fā)展提供一種思路，不僅具有 較高的學(xué)術(shù)價(jià)值，也具有很好的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的任務(wù)是提供一種具有磁響應(yīng)性和極高吸附容量的溶菌酶分子印跡納米 粒子的制備方法，使其具有制備簡(jiǎn)單、成本低廉，制備出的溶菌酶分子印跡納米粒子集特異 性吸附強(qiáng)、物理和化學(xué)穩(wěn)定性高、可實(shí)現(xiàn)快速磁分離和反復(fù)回收利用等特點(diǎn)。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案是本發(fā)明提供的具有磁響應(yīng)性和極高吸附容量的溶菌酶分子印跡納米粒子的制備 方法，包括以下步驟步驟一采用表面活性劑對(duì)磁性納米粒子進(jìn)行分散處理，防止磁性納米粒子相互 聚集；步驟二 在磁性納米粒子表面包被二氧化硅SiO2薄膜；以提供活性基團(tuán)(-0H)和 防止狗304磁性納米粒子的氧化；步驟三對(duì)表面包被有二氧化硅SiA薄膜的磁性納米粒子同時(shí)進(jìn)行巰基和丙烯酰 氧基修飾；磁性納米粒子需要在其表面進(jìn)行功能化修飾，以保證分子印跡膜的緊密生長(zhǎng)；步驟四在包被有二氧化硅SiA薄膜并經(jīng)巰基和丙烯酰氧基修飾的磁性納米粒子 表面生成溶菌酶分子印跡聚合物薄膜。上述步驟(一)所述的所述的采用表面活性劑對(duì)磁性納米粒子進(jìn)行分散處理的方 法是將磁性納米粒子分散到0. 7 lmol/L的表面活性劑溶液中，所述的表面活性劑為檸 檬酸鈉或油酸，使磁性納米粒子的最終濃度為0. 01g/mL 0. lg/mL，40 60°C條件下，反 應(yīng)12 M小時(shí)后，采用純水洗滌以去除表面活性劑，并重新分散到乙醇溶液中，使磁性納 米粒子的最終濃度達(dá)到lg/mL。本發(fā)明實(shí)施例使用的磁性納米粒子是!^e3O4磁性納米粒子， 購(gòu)于南京工業(yè)大學(xué)納米應(yīng)用研究中心，磁性粒子的粒徑為10-20nm，且具有超順磁性。上述步驟(二 )所述的在磁性納米粒子表面包被二氧化硅SiA薄膜的方法是按 乙醇與水的體積比為5 1 3 2的比例配制乙醇和水的混合溶液，將磁性納米粒子、氨 水和四乙氧基硅烷按照5 5 10 0.6 3的質(zhì)量比加入到所配制的乙醇和水的混合 溶液中，使磁性納米粒子的最終濃度為0. 01g/mL 0. lg/mL,40 60°C條件下，反應(yīng)12 24小時(shí)后，真空干燥，得到褐色粉末；上述步驟(三)所述的對(duì)表面包被有二氧化硅SiO2薄膜的磁性納米粒子同時(shí)進(jìn)行 巰基和丙烯酰氧基修飾的方法是；將等體積的Y-巰基丙基三甲氧基硅烷和Y-甲基丙烯 酰氧基丙基三甲氧基硅烷加入到純水中，使得每毫升純水中含有5 μ L 10 μ L的Y -甲基 丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷，常溫?cái)嚢? 10小時(shí)后，在將此溶液滴加到相同體積的含 有20 40mg/mL SiO2薄膜包被的磁性粒子的純水中，60 100°C條件下，反應(yīng)12 M小 時(shí)后，真空干燥，得到褐色粉末。上述步驟(四)所述的在包被有二氧化硅SiA薄膜并經(jīng)巰基和丙烯酰氧基修飾 的磁性納米粒子表面生成溶菌酶分子印跡聚合物薄膜的方法是以溶菌酶為模板分子，在 適合的功能單體、交聯(lián)劑、引發(fā)劑和表面包被了 SiO2并進(jìn)行了巰基和丙烯酰氧基修飾的磁 性納米粒子存在的條件下進(jìn)行模板聚合反應(yīng)，在洗去模板分子后即得到具有磁響應(yīng)性和極 高吸附容量的溶菌酶分子印跡納米粒子；所述的適合的功能單體是能夠與磁性納米粒子表 面修飾的丙烯酰氧基結(jié)合而固定在磁性納米粒子表面的堿性功能單體丙烯酰胺或/和酸 性功能單體甲基丙烯酸；所述的交聯(lián)劑是甲叉丙烯酰胺；所述的引發(fā)劑是過(guò)硫酸銨；其具 體操作方法是(1)將溶菌酶和堿性功能單體丙烯酰胺按摩爾比1000 1 3000 1的量加入到 0. 2 0. 5mol/L磷酸緩沖鹽溶液(pH 5. 0 7. 0)中，使得溶菌酶的最終濃度為2mg/mL 6mg/mL,超聲 5-lOmin ；
(2)在上述溶菌酶溶液中依次加入交聯(lián)劑甲叉丙烯酰胺、引發(fā)劑過(guò)硫酸銨、酸性功 能單體甲基丙烯酸和包被有二氧化硅S^2薄膜并經(jīng)巰基和丙烯酰氧基修飾的磁性納米粒 子，加入的量為交聯(lián)劑甲叉丙烯酰胺與引發(fā)劑過(guò)硫酸銨、酸性功能單體甲基丙烯酸和包被 有二氧化硅SiO2薄膜并經(jīng)巰基和丙烯酰氧基修飾的磁性納米粒子的質(zhì)量比依次為20 60 1 4 6 10 80，并使得交聯(lián)劑甲叉丙烯酰胺與堿性功能單體丙烯酰胺的質(zhì)量 比為1 6 1 10，制備成懸浮液，通氮?dú)?0 30min以除去氧氣；(3)向制備成的懸浮液中加入四甲基乙二胺，使四甲基乙二胺在懸浮液中的濃度 為0. 5 2 μ L/mL,密封后，在常溫條件下機(jī)械攪拌12 M小時(shí)后，依次采用0. 5 lmol/ L的氯化鈉溶液、純水洗滌以去除模板分子，真空干燥至衡重，即得具有磁響應(yīng)性和極高吸 附容量的溶菌酶分子印跡納米粒子。本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)單，成本低廉，本發(fā)明方法制備的具有磁響應(yīng)性和極高吸附容 量的溶菌酶分子印跡納米粒子用于溶菌酶的提純和檢測(cè)，具有特異性吸附強(qiáng)、物理和化學(xué) 穩(wěn)定性高、可反復(fù)回收利用等特點(diǎn)，大大提高對(duì)溶菌酶的吸附容量，并可實(shí)現(xiàn)快速的磁分 離，避免了傳統(tǒng)方法前處理操作繁瑣、步驟復(fù)雜的不足，可節(jié)約成本，降低蛋白的污染，為生 物大分子的凈化和檢測(cè)提供一種新方法。實(shí)驗(yàn)資料(1)磁性納米粒子的分散及效果檢測(cè)具體的制備步驟將!^e3O4磁性納米粒子分散到0. 7 lmol/L的表面活性劑溶液 中(檸檬酸鈉或油酸)，使磁性納米粒子的最終濃度為0. 01g/mL 0. lg/mL,40 60°C條 件下，反應(yīng)12 M小時(shí)后，采用純水洗滌以去除表面活性劑，并重新分散到乙醇溶液中，使 磁性納米粒子的最終濃度達(dá)到lg/mL。由圖I(A)顯示磁性納米粒子在常規(guī)條件下相互聚集。如果能對(duì)磁性納米粒子進(jìn) 行分散，就可以獲得粒徑較小、比表面積更大的磁性納米粒子，最終提高印跡粒子的吸附容 量。圖I(B)顯示分散后的磁性納米粒子粒徑較小、分布均一。(2)磁性粒子表面SW2薄膜的包被及驗(yàn)證具體的制備步驟將!^e3O4磁性納米粒子、氨水和四乙氧基硅烷按照5 5 10 0. 6 3的質(zhì)量比加入到含有乙醇/水(5/1 3/2，V/V)的混合溶液中，使磁性納米 粒子的最終濃度為0. 01g/mL 0. lg/mL,40 60°C條件下，反應(yīng)12 M小時(shí)后，真空干 燥，得到褐色粉末；紅外譜圖顯示(圖2)在1105. 1和952. 8波長(zhǎng)處可見(jiàn)Si_0_Si的偏振峰，同時(shí)在 468. 7波長(zhǎng)處可見(jiàn) ^-0偏振峰，證明SW2薄膜已經(jīng)包被在磁性顆粒表面。由于!^e3O4磁性納米粒子極不穩(wěn)定，容易被氧化而喪失超順磁性。因此，SiO2薄膜 的包被，一方面可以保護(hù)狗304，另一方面可以提供活性基團(tuán)-0H，為以后磁性粒子表面基團(tuán) 修飾提供了可能。(3)磁性粒子表面巰基和丙烯酰氧基的同時(shí)修飾及檢驗(yàn)具體的制備步驟首先將等體積的、-巰基丙基三甲氧基硅烷和、-甲基丙烯酰 氧基丙基三甲氧基硅烷加入到純水中，使得每毫升水中含有5μ L IOyL的γ -甲基丙 烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷，常溫?cái)嚢? 10小時(shí)后，在將此溶液滴加到相同體積的含有 20 40mg/mL SiO2薄膜包被的磁性粒子的純水中，60 100°C條件下，反應(yīng)12 M小時(shí)后，真空干燥，得到褐色粉末；紅外譜圖顯示(圖2)在1105. 1和952. 8波長(zhǎng)處Si_0_Si的偏振峰的增寬， 1720. 4波長(zhǎng)處C = 0偏振峰的出現(xiàn)，證明丙烯酰氧基已經(jīng)修飾在磁性納米粒子表面。同時(shí)，通過(guò)巰基特征性顯色反應(yīng)(Ellman反應(yīng)，反應(yīng)方程式如下)和圖3(A)證明 巰基已經(jīng)結(jié)合在磁性納米粒子表面；
權(quán)利要求
1.一種具有磁響應(yīng)性和極高吸附容量的溶菌酶分子印跡納米粒子的制備方法，其特征 在于，包括以下步驟步驟一采用表面活性劑對(duì)磁性納米粒子進(jìn)行分散處理；步驟二 在磁性納米粒子表面包被二氧化硅S^2薄膜；步驟三對(duì)表面包被有二氧化硅S^2薄膜的磁性納米粒子同時(shí)進(jìn)行巰基和丙烯酰氧基 修飾；步驟四在包被有二氧化硅S^2薄膜并經(jīng)巰基和丙烯酰氧基修飾的磁性納米粒子表面 生成溶菌酶分子印跡聚合物薄膜。
2.根據(jù)權(quán)利要求ι所述的具有磁響應(yīng)性和極高吸附容量的溶菌酶分子印跡納米粒子 的制備方法，其特性在于，所述的磁性納米粒子是!^3O4磁性納米粒子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的具有磁響應(yīng)性和極高吸附容量的溶菌酶分子印跡納米 粒子的制備方法，其特性在于，采用表面活性劑對(duì)磁性納米粒子進(jìn)行分散處理的方法是將 磁性納米粒子分散到0. 7 lmol/L的表面活性劑溶液中，所述的表面活性劑為檸檬酸鈉或 油酸，使磁性納米粒子的最終濃度為0. 01g/mL 0. lg/mL，40 60°C條件下，反應(yīng)12 M 小時(shí)后，采用純水洗滌以去除表面活性劑，并重新分散到乙醇溶液中，使磁性納米粒子的最 終濃度達(dá)到lg/mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的具有磁響應(yīng)性和極高吸附容量的溶菌酶分子印跡納米 粒子的制備方法，其特性在于，在磁性納米粒子表面包被二氧化硅SiO2薄膜的方法是將磁 性納米粒子、氨水和四乙氧基硅烷按照5 5 10 0.6 3的質(zhì)量比加入到含有乙醇/ 水(5/1 3/2，V/V)的混合溶液中，使磁性納米粒子的最終濃度為0. 01g/mL 0. lg/mL, 40 60°C條件下，反應(yīng)12 M小時(shí)后，真空干燥，得到褐色粉末。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的具有磁響應(yīng)性和極高吸附容量的溶菌酶分子印跡納米粒 子的制備方法，其特性在于，對(duì)表面包被有二氧化硅SiO2薄膜的磁性納米粒子同時(shí)進(jìn)行巰 基和丙烯酰氧基修飾的方法是；首先將等體積的Y-巰基丙基三甲氧基硅烷和Y-甲基丙 烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷加入到純水中，使得每毫升水中含有5 μ L 10 μ L的Y -甲基 丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷，常溫?cái)嚢? 10小時(shí)后，在將此溶液滴加到相同體積的含 有20 40mg/mL SiO2薄膜包被的磁性納米粒子的純水中，60 100°C條件下，反應(yīng)12 24小時(shí)后，真空干燥，得到褐色粉末。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的具有磁響應(yīng)性和極高吸附容量的溶菌酶分子印跡納米粒 子的制備方法，其特性在于，在包被有二氧化硅SiO2薄膜并經(jīng)巰基和丙烯酰氧基修飾的磁 性納米粒子表面生成溶菌酶分子印跡聚合物薄膜的方法是以溶菌酶為模板分子，在適合 的功能單體、交聯(lián)劑、引發(fā)劑和表面包被了 SiA并進(jìn)行了巰基和丙烯酰氧基修飾的磁性納 米粒子存在的條件下進(jìn)行模板聚合反應(yīng)，在洗去模板分子后即得到具有磁響應(yīng)性和極高吸 附容量的溶菌酶分子印跡納米粒子。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的具有磁響應(yīng)性和極高吸附容量的溶菌酶分子印跡納米粒子 的制備方法，其特性在于，所述的適合的功能單體是能夠與磁性納米粒子表面修飾的丙烯 酰氧基結(jié)合而固定在磁性納米粒子表面的堿性功能單體丙烯酰胺或/和酸性功能單體甲 基丙烯酸，所述的交聯(lián)劑是甲叉丙烯酰胺，所述的引發(fā)劑是過(guò)硫酸銨。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的具有磁響應(yīng)性和極高吸附容量的溶菌酶分子印跡納米粒子的制備方法，其特性在于，所述的以溶菌酶為模板分子，在適合的功能單體、交聯(lián)劑、引發(fā)劑 和表面包被了 S^2并進(jìn)行了巰基和丙烯酰氧基修飾的磁性納米粒子存在的條件下進(jìn)行模 板聚合反應(yīng)，在洗去模板分子后即得到具有磁響應(yīng)性和極高吸附容量的溶菌酶分子印跡納 米粒子的具體方法是(1)將溶菌酶和堿性功能單體丙烯酰胺按摩爾比1000 1 3000 1的量加入到 0. 2 0. 5mol/L磷酸緩沖鹽溶液(pH 5. 0 7. 0)中，使得溶菌酶的最終濃度為2mg/mL 6mg/mL,超聲 5-lOmin ；(2)在上述溶菌酶溶液中依次加入交聯(lián)劑甲叉丙烯酰胺、引發(fā)劑過(guò)硫酸銨、酸性功能 單體甲基丙烯酸和包被有二氧化硅SiO2薄膜并經(jīng)巰基和丙烯酰氧基修飾的磁性納米粒 子，加入的量為交聯(lián)劑甲叉丙烯酰胺與引發(fā)劑過(guò)硫酸銨、酸性功能單體甲基丙烯酸和包被 有二氧化硅SiO2薄膜并經(jīng)巰基和丙烯酰氧基修飾的磁性納米粒子的質(zhì)量比依次為20 60 1 4 6 10 80，并使得交聯(lián)劑甲叉丙烯酰胺與堿性功能單體丙烯酰胺的質(zhì)量 比為1 6 1 10，制備成懸浮液，通氮?dú)?0 30min以除去氧氣；(3)向制備成的懸浮液中加入四甲基乙二胺，使四甲基乙二胺在懸浮液中的濃度為 0. 5 2 μ L/mL,密封后，在常溫條件下機(jī)械攪拌12 M小時(shí)后，依次采用0. 5 lmol/L 的氯化鈉溶液、純水洗滌以去除模板分子，真空干燥至衡重，即得具有磁響應(yīng)性和極高吸附 容量的溶菌酶分子印跡納米粒子。
9.權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述方法制備的具有磁響應(yīng)性和極高吸附容量的溶菌酶分 子印跡納米粒子。
10.權(quán)利要求9所述的具有磁響應(yīng)性和極高吸附容量的溶菌酶分子印跡納米粒子在溶 菌酶的提純或檢測(cè)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種具有磁響應(yīng)性和極高吸附容量的溶菌酶分子印跡納米粒子的制備方法，它是以溶菌酶為模板分子，在適合的功能單體、交聯(lián)劑、引發(fā)劑和其表面包被了SiO2并進(jìn)行了巰基和丙烯酰氧基修飾的磁性納米粒子存在的條件下進(jìn)行模板聚合反應(yīng)，在洗去模板分子后即得到具有磁響應(yīng)性和極高吸附容量的溶菌酶分子印跡納米粒子，本發(fā)明還提供了該納米粒子的制備方法。本發(fā)明制備的溶菌酶分子印跡納米粒子具有吸附容量高、制備簡(jiǎn)單、成本低廉、特異性吸附強(qiáng)、物理和化學(xué)穩(wěn)定性高、可反復(fù)回收利用等特點(diǎn)。
文檔編號(hào)B01J20/286GK102145279SQ20101011123
公開(kāi)日2011年8月10日 申請(qǐng)日期2010年2月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月5日
發(fā)明者周宜開(kāi), 戴晴, 梅素容, 荊濤, 郝巧玲 申請(qǐng)人:華中科技大學(xué)