專利名稱：：設(shè)計(jì)用于以高靈敏度檢測(cè)擴(kuò)增子的捕獲分子的制作方法設(shè)計(jì)用于以高靈敏度檢測(cè)擴(kuò)增子的捕獲分子
背景技術(shù)：
：1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明屬診斷領(lǐng)域，涉及設(shè)計(jì)和/或制備捕獲分子的方法，所述捕獲分子被用于檢測(cè)和/或定量樣品中由引物對(duì)擴(kuò)增所產(chǎn)生的潛在的核苷酸序列。通過(guò)本發(fā)明的方法設(shè)計(jì)出的捕獲分子尤其適用于鑒定和/或定量同一屬或科的微生物或鑒定和/或定量存在于生物樣品中的特定生物體中的相關(guān)基因。2.
背景技術(shù)：
：生物芯片技術(shù)的發(fā)展使可在給定實(shí)驗(yàn)中同時(shí)檢測(cè)多個(gè)核苷酸序列，從而使可鑒定相應(yīng)生物體或部分生物體。陣列是在表面含有一系列栽有捕獲分子(或探針)的離散區(qū)域的固體支持物，可結(jié)合(通過(guò)雜交)可能存在于待分析樣品中的相應(yīng)靶核苷酸序列。如果靶序列在反轉(zhuǎn)錄過(guò)程中或在所述序列的擴(kuò)增過(guò)程中被經(jīng)修飾的核苷酸標(biāo)記，便可在結(jié)合位置檢測(cè)和測(cè)量到信號(hào)?？赏ㄟ^(guò)所述信號(hào)強(qiáng)度估計(jì)樣品中靶序列的存在量。此技術(shù)使得可診斷或篩選目的鑒定和/或定量物種或基因。AffymetrixInc.公司已開(kāi)發(fā)出一種在固體支持物的特定位置直接合成寡核苷酸的方法，此過(guò)程的每一步都使用罩子。所述方法包括，向延伸中的寡核苷酸加入新核苷酸，以在所需位置得到所需序列。此方法源自光刻技術(shù)，并結(jié)合使用了于新核苷酸加入前釋放的光保護(hù)基團(tuán)(EP-Al-0476014，美國(guó)專利No.5,445,934、美國(guó)專利No.5，143，854和美國(guó)專利No.5,510,270)。然而，只有小的寡核苷酸存在于表面上，所述方法主要被應(yīng)用于測(cè)序或鑒定陽(yáng)性樣點(diǎn)圖譜，所述陽(yáng)性樣點(diǎn)圖譜對(duì)應(yīng)于結(jié)合于陣列上的每個(gè)特定寡核苷酸?？赏ㄟ^(guò)比較所述圖譜與參照而鑒定靶序列。所述技術(shù)被應(yīng)用于鑒定結(jié)核分枝桿菌r戸5基因(wo97/29212和W098/28444)，其中所述捕獲分子含有少于30個(gè)核苷酸，且可分析兩個(gè)相差一個(gè)核苷酸的不同序列(SNP或基因型的鑒定)。優(yōu)選小捕獲分子(長(zhǎng)度10-20核苷酸之間)，因?yàn)殚L(zhǎng)度越短，相差一個(gè)堿基的兩個(gè)寡核苷酸之間的差別越大。所述方法的局限性在于無(wú)法直接檢測(cè)由基因擴(kuò)增(PCR)產(chǎn)生的擴(kuò)增子。在使用具有T3或T7序列的引物進(jìn)行雙擴(kuò)增后，使用RNA聚合酶反轉(zhuǎn)錄至單鏈RNA后方可進(jìn)行檢測(cè)。在陣列上檢測(cè)前，將所述RNA序列切成約40個(gè)堿基的片段(WO97/29212的實(shí)施例1)。長(zhǎng)DNA或RNA片段與表面上的捕獲分子雜交甚慢，或根本不雜交。因此，使用所述方法檢測(cè)同源序列較復(fù)雜，因?yàn)橥葱噪S序列而變，使得部分所述片段可雜交至同一捕獲分子。所以所述方法需要有復(fù)合的計(jì)算機(jī)軟件以重建序列及解析結(jié)果。當(dāng)使用小捕獲分子陣列時(shí)，基于mRNA的cDNA拷貝的基因表達(dá)陣列也遇到了同樣的問(wèn)題雜交速度低。因此，片段被切成更小的片段庫(kù)，且所述方法要求使用幾個(gè)捕獲分子，以得到證實(shí)給定基因存在的信號(hào)圖鐠(WO97/10364和W097/27317)。所述切割也降低經(jīng)標(biāo)記的核苷酸數(shù)，從而降低所得信號(hào)。在這種情況下，使用長(zhǎng)捕獲分子可提供更好的檢測(cè)靈敏度。在多基因表達(dá)應(yīng)用中，當(dāng)待檢測(cè)的cDNA源自序列不同的基因時(shí)，由于相互之間無(wú)交叉反應(yīng)，所以使用長(zhǎng)捕獲分子不是個(gè)問(wèn)題。雖然長(zhǎng)捕獲分子可提供所需靈敏度，但當(dāng)存在同源序列存在的可能性時(shí)，它們不能被使用，因?yàn)樗鼈儠?huì)雜交至同一捕獲分子而使檢測(cè)非特異，已有人建議使用膜和尼龍支持物，通過(guò)在支持物和捕獲分子間摻入間隔區(qū)，以提高固體支持物上檢測(cè)的靈敏度。VanNess等人(NucleicAcidsResearch,Vol.19，p.3345，1991)描述了用于結(jié)合DNA與尼龍膜的聚(乙撐亞胺)臂。歐洲專利申請(qǐng)EP-0511559描述了用于結(jié)合小寡核苷酸與膜的作為間隔區(qū)的六乙二醇衍生物。當(dāng)將膜(如尼龍)用作支持物時(shí)，無(wú)法控制固體支持物和寡核苷酸間的結(jié)合位點(diǎn)。已觀察到polydT尾增加固定產(chǎn)率，所得雜交產(chǎn)率也增加(WO089/11548)。使用存在于多聚物中的重復(fù)捕獲序列也可得到相似結(jié)果(美國(guó)專利No.5，683，872)。Guo等人(NucleicAcidsResearch,Vol.22，p.5456，1994)教導(dǎo)了以更高雜交靈敏度將寡核苷酸結(jié)合至玻璃的15個(gè)堿基的polydT作為間隔區(qū)的用途。PCT申請(qǐng)WO99/16780描述了尼龍載波片上基因Fe附J的4個(gè)同源序列的檢測(cè)。但沒(méi)有提供有關(guān)方法和檢測(cè)的靈敏度的數(shù)據(jù)。在所述文件中，捕獲分子含有15-350個(gè)堿基，與共有序列的同源性小于50%。Anthony等人的文章(Journalofclinicalmicrobiology,Vol.38，p.7817,2000)描述了膜陣列在以低靈敏度分辨源自幾種相關(guān)生物體的同源序列中的用途。待檢測(cè)的靶是通過(guò)共有PCR從細(xì)菌擴(kuò)增出的rDNA，可在含有用于所述細(xì)菌的捕獲分子的尼龍陣列上檢測(cè)到，其中使所述捕獲分子長(zhǎng)20-30個(gè)堿基，并共價(jià)連接到尼龍上。無(wú)法控制可雜交的序列部分。Peytavi等人的文章(BioTechniques,Vol.39，p.89,2005)討論了有關(guān)402和432bpermB產(chǎn)物與20-mer寡核苷酸捕獲分子的雜交效率的實(shí)驗(yàn)。報(bào)道的結(jié)果表明，由于游離的5'突出端與第二條擴(kuò)增子鏈復(fù)性，導(dǎo)致被捕獲的鏈不穩(wěn)定。因此，仍然需要設(shè)計(jì)捕獲分子的方法，所述方法需要在保持檢測(cè)特異性的同時(shí)，以高產(chǎn)量高速度地在被固定的捕獲分子上檢測(cè)存在于溶液中的雙鏈擴(kuò)增序列。所述設(shè)計(jì)方法同時(shí)應(yīng)該考慮由于引物對(duì)的選擇對(duì)其造成的限制。本發(fā)明通過(guò)提供簡(jiǎn)單有效的設(shè)計(jì)捕獲分子的方法應(yīng)對(duì)所有所述限制，所述捕獲分子被用于檢測(cè)經(jīng)固定的捕獲分子上的PCR擴(kuò)增序列。發(fā)明目的本發(fā)明旨在提供設(shè)計(jì)和/或制備捕獲分子的新方法，所述捕獲分子被用于通過(guò)引物對(duì)擴(kuò)增后或過(guò)程中的大量(微)生物體或部分(微)生物體的簡(jiǎn)便鑒定(檢測(cè)和/或定量)。本發(fā)明還旨在提供允許要求在擴(kuò)增步驟中使用單個(gè)引物的簡(jiǎn)化的技術(shù)，允許通過(guò)在所述微陣列上鑒定和/或記錄單個(gè)點(diǎn)信號(hào)鑒定(檢測(cè)和/或定量)特異的靶序列，所述信號(hào)只來(lái)自靶序列與它對(duì)應(yīng)的捕獲分子的特異結(jié)合。發(fā)明概述本發(fā)明在一個(gè)實(shí)施方案中涉及設(shè)計(jì)多核苷酸捕獲分子的方法，所述捕獲分子被用于檢測(cè)與之雜交的擴(kuò)增子，所述擴(kuò)增子的一條鏈作為待檢測(cè)和/或定量的靶，所述方法包括以下步驟a)選擇引物對(duì)定義擴(kuò)增子；b)在擴(kuò)增子內(nèi)選擇10-100個(gè)核苷酸的特異序列，使所述特異序列定義擴(kuò)增子的兩個(gè)非互補(bǔ)末端；c)定義具有捕獲部分和間隔區(qū)部分的捕獲分子，所述捕獲部分與步驟b)中選擇的特異序列互補(bǔ)，所述間隔區(qū)部分含有至少20個(gè)核苷酸；d)在擴(kuò)增子的兩個(gè)非互補(bǔ)末端中分別鑒定出間隔區(qū)末端和非間隔區(qū)末端，使所述間隔區(qū)末端不與所述捕獲分子的所述間隔區(qū)部分互補(bǔ)，且所述間隔區(qū)末端比所述非間隔區(qū)末端多出至少50個(gè)堿基。本發(fā)明在另一個(gè)實(shí)施方案中設(shè)計(jì)制備多核苷酸捕獲分子的方法，所述捕獲分子被用于檢測(cè)與之雜交的擴(kuò)增子，所述擴(kuò)增子的一條鏈作為待檢測(cè)和/或定量的靶，所述方法包括以下步驟a)選擇引物對(duì)定義擴(kuò)增子；b)在擴(kuò)增子內(nèi)選擇10-100個(gè)核苷酸的特異序列，^使所述特異序列定義擴(kuò)增子的兩個(gè)非互補(bǔ)末端；c)定義具有捕獲部分和間隔區(qū)部分的捕獲分子，所述捕獲部分與步驟b)中選擇的特異序列互補(bǔ)，所述間隔區(qū)部分含有至少20個(gè)核苷d)在擴(kuò)增子的兩個(gè)非互補(bǔ)末端中分別鑒定出間隔區(qū)末端和非間隔區(qū)末端，使所述間隔區(qū)末端不與所述捕獲分子的所述間隔區(qū)部分互補(bǔ)，且所述間隔區(qū)末端比所述非間隔區(qū)末端多出至少50個(gè)堿基；e)合成所述捕獲分子。本發(fā)明還在另一個(gè)實(shí)施方案中涉及可通過(guò)上述方法得到的捕獲分子。本發(fā)明在第4個(gè)實(shí)施方案中涉及在檢測(cè)擴(kuò)增子的方法中使用的試劑盒，所述試劑盒包含通過(guò)本發(fā)明的方法設(shè)計(jì)的捕獲分子。附圖簡(jiǎn)述可參照下列附圖更好地理解本發(fā)明的特征和優(yōu)點(diǎn)，其中圖1示在實(shí)施例1的實(shí)驗(yàn)中使用的靶擴(kuò)增子鏈中的不同捕獲分子的位置。圖示具有互補(bǔ)的反義特異捕獲部分(CAS)的捕獲分子上的正義靼鏈(S)的位置和具有互補(bǔ)的正義特異捕獲部分(CS)的捕獲分子上的反義乾(AS)的位置。指示了每個(gè)構(gòu)型的游離非間隔區(qū)末端和游離間隔區(qū)末端的長(zhǎng)度(核苷酸)。所有已描述的相互作用的擴(kuò)增子和捕獲分子鏈的5，-3，方向都相同。不同的捕獲分子的間隔區(qū)部分(90個(gè)核苷酸)和捕獲部分(27個(gè)核苷酸)長(zhǎng)度相同。圖2示熒光強(qiáng)度與正義靶鏈(圖2A)和反義鏈(圖2B)在各自捕獲分子(la，2a，3a)和(ls，2s，3s)上的游離間隔區(qū)末端(核苷酸)長(zhǎng)度間的相關(guān)性。所述實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)顯示于圖1。圖3示間隔區(qū)部分長(zhǎng)度(核苷酸)對(duì)如實(shí)施例2中提供的雜交產(chǎn)率(熒光強(qiáng)度)的影響。使用本發(fā)明的間隔區(qū)部分長(zhǎng)度不同的捕獲分子進(jìn)行所述實(shí)驗(yàn)。間隔區(qū)部分長(zhǎng)度為20-95個(gè)核苷酸及特異于靶分子的27個(gè)堿基的恒定捕獲部分。實(shí)施方案詳述以下結(jié)合實(shí)施例(僅用作實(shí)施例)與附圖描述本發(fā)明的某些實(shí)施方案。術(shù)語(yǔ)"核酸"、"寡核苷酸"、"陣列"、"探針"、"靶核酸"、"基本結(jié)合"、"特異雜交"、"背景"和"定量"如通過(guò)引用并入本文的國(guó)際專利申請(qǐng)W097/27317中所述。術(shù)語(yǔ)"核苷三磷酸"、"核苷酸"和"引物序列，，如通過(guò)引用并入本文的文獻(xiàn)WO00/72018中所述。術(shù)語(yǔ)"同源序列"和"共有序列，，如通過(guò)引用并入本文的歐洲專利申請(qǐng)W001/77372中所述。術(shù)語(yǔ)"同源性"指一個(gè)多核普酸序列與另一個(gè)多核苷酸序列間的同一性程度。兩個(gè)或多個(gè)多核苷酸之間可完全同源(即，100%的同一性)?？稍谛蛄斜葘?duì)后通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任何方法測(cè)定而計(jì)算同源性程度。本文所述"捕獲分子"指能夠特異性結(jié)合一個(gè)靶分子或一個(gè)家族的靶分子或多個(gè)靶分子中的一個(gè)或多個(gè)成員或其部分的分子、或分子的復(fù)合體或組合體。捕獲分子優(yōu)選是核酸，既可在支持物表面原位化學(xué)合成，也可易位合成后隨即固定在支持物上。核酸結(jié)合是通過(guò)兩個(gè)多核苷酸間的堿基配對(duì)實(shí)現(xiàn)的，其中一個(gè)是經(jīng)固定的捕獲分子，另一個(gè)是待檢測(cè)的靶。捕獲分子也包括核酸的衍生物，如PNA或LNA，只要其可特異性結(jié)合靶多核苷酸分子。術(shù)語(yǔ)"單個(gè)捕獲分子種(siglecapturemoleculespecies)，，是用于通過(guò)堿基配對(duì)雜交或通過(guò)多肽或蛋白質(zhì)之間的分子識(shí)別檢測(cè)給定序列的相關(guān)多核苷酸的組合物。多核苷酸可化學(xué)合成或酶學(xué)合成，或從樣品中分離，但合成或分離并不總是完美的，捕獲分子會(huì)被其他相關(guān)分子，如較短的多核苷酸污染。本發(fā)明的捕獲庫(kù)的基本特征是整個(gè)庫(kù)都可用于捕獲給定靶核苷酸分子。本文描述的術(shù)語(yǔ)"與一個(gè)或多個(gè)基因或基因組序列互補(bǔ)的多核苷酸序列，，指在嚴(yán)格條件下可與所述基因或基因組或其拷貝的至少部分核普酸序列雜交的多核苷酸。多核苷酸也包括可用于特定的條件的寡核苷酸(含有2個(gè)以上，100個(gè)以下的堿基)。所述可雜交多核苷酸一般在核苷酸水平表現(xiàn)出與所述基因或基因組至少約75%的序列同一性，優(yōu)選與所述基因或基因組約80%或95%的序列同一性或優(yōu)選95%以上的核苷酸序列同一性。根據(jù)實(shí)驗(yàn)的特異性和敏感性要求，它們一般由15-30個(gè)堿基，或更長(zhǎng)的30-100個(gè)堿基，或再長(zhǎng)的100-800個(gè)堿基長(zhǎng)的小序列構(gòu)成。"微陣列"指固定有多個(gè)捕獲分子以可結(jié)合給定的特定靶分子的支持物。微陣列優(yōu)選由存在于支持物表面或內(nèi)部或覆蓋支持物的基質(zhì)上特異定位區(qū)域中的捕獲分子構(gòu)成。特異定位區(qū)域是含有特異于已確定的靶分子的結(jié)合有捕獲分子的表面上的區(qū)域。特異定位區(qū)域是通過(guò)建立微陣列的方法知曉的，或在檢測(cè)過(guò)程中或檢測(cè)后確定的。樣點(diǎn)是有特異靶分子固定于其捕獲分子上的，可通過(guò)檢測(cè)器觀察到的區(qū)域。樣點(diǎn)是有特異靶分子固定于其捕獲分子上的，可通過(guò)檢測(cè)器觀察到的區(qū)域。在本發(fā)明的特別的申請(qǐng)中，只要不同的支持物含有特定的捕獲分子并可相互區(qū)分，以可定量特定靶分子，捕獲分子的微陣列也可提供在不同的支持物上。這可通過(guò)使用具有特別特征和能相互識(shí)別以定量結(jié)合的分子的珠混合物來(lái)實(shí)現(xiàn)。然后可將一個(gè)珠或一群珠作為具有特異于靶分子的捕獲分子的樣點(diǎn)。本發(fā)明的"擴(kuò)增子，，指由存在于生物材料中的核苷酸分子的PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的靶核苷酸分子。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)大幅度地簡(jiǎn)化在許多其他具有同源序列的(微)生物體中鑒定一個(gè)和幾個(gè)(微)生物體的過(guò)程是可能的，方法是通過(guò)將使用通用引物對(duì)進(jìn)行單一擴(kuò)增與通過(guò)檢測(cè)和可能記錄陣列上只來(lái)自捕獲序列及其相應(yīng)靶序列間的結(jié)合的單個(gè)信號(hào)的存在而進(jìn)行的可能的(微)生物體的鑒定結(jié)合，并將所檢測(cè)的把序列的存在與特異于所述(微)生物體的遺傳序列的鑒定相關(guān)聯(lián)。本發(fā)明的方法和裝置尤其允許容易地在同源序列中鑒定/檢測(cè)特定序列，及可能定量(鑒定許多拷貝或在生物樣品中所述生物體的存在)把序列，所述乾序列具有特異于所述(微)生物體的核苷酸序列?？赏ㄟ^(guò)檢測(cè)或可能記錄特定位置處(有捕獲分子預(yù)先結(jié)合)的單個(gè)樣點(diǎn)信號(hào)直接或在洗掉可能的污染物(未結(jié)合序列)后得到所述鑒定結(jié)果。特定序列的鑒定結(jié)果不是通過(guò)進(jìn)行本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)推薦的微陣列分析特定圖鐠得到的。因此，所述方法和裝置無(wú)需通過(guò)圖像處理和軟件分析對(duì)所述圖傳進(jìn)行詳細(xì)分析。如果捕獲分子具有本發(fā)明公開(kāi)的特別的特征，可通過(guò)使用結(jié)合的所述捕獲分子以高靈敏度陣列區(qū)分靶序列與其它同源序列，所述捕獲分子由至少兩部分構(gòu)成，一部分是通過(guò)單個(gè)且優(yōu)選預(yù)定(定義的)的連接子結(jié)合至支持物(優(yōu)選非多孔支持物)上的間隔區(qū)部分，其他部分是可與核苷酸靶序列雜交的特異性核苷酸序列(捕獲部分)，以上發(fā)現(xiàn)使得所述檢測(cè)成為可能。本發(fā)明公開(kāi)經(jīng)特定設(shè)計(jì)的捕獲分子的特別的特征，有助于以高靈敏度并快速檢測(cè)存在于溶液中的擴(kuò)增子。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，欲使用固定的捕獲分子以高靈敏度、高速檢測(cè)包括PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在內(nèi)的擴(kuò)增子，需特定設(shè)計(jì)捕獲分子。本發(fā)明涉及設(shè)計(jì)和/或制備多核苷酸捕獲分子的方法，所述捕獲分子被用于檢測(cè)與之雜交的擴(kuò)增子，所述擴(kuò)增子的一條鏈作為待檢測(cè)和/或定量的靶。所述方法包括以下步驟a)選擇引物對(duì)定義擴(kuò)增子；b)在擴(kuò)增子內(nèi)選擇10-100個(gè)核苷酸的特異序列，使所述特異序列定義擴(kuò)增子的兩個(gè)非互補(bǔ)末端；c)定義具有捕獲部分和間隔區(qū)部分的捕獲分子，所述捕獲部分與步驟b)中選擇的特異序列互補(bǔ)，所述間隔區(qū)部分含有至少20個(gè)核苷酸；d)在擴(kuò)增子的兩個(gè)非互補(bǔ)末端中分別鑒定出間隔區(qū)末端和非間隔區(qū)末端，使所述間隔區(qū)末端不與所述捕獲分子的所述間隔區(qū)部分互補(bǔ)，且所述間隔區(qū)末端比所述非間隔區(qū)末端多出至少50個(gè)堿基。本發(fā)明在第二個(gè)實(shí)施方案中涉及制備捕獲分子的方法。本發(fā)明在第三個(gè)實(shí)施方案中涉及可通過(guò)上述方法得到的捕獲分子。本發(fā)明在第四個(gè)實(shí)施方案中涉及使用所述捕獲分子檢測(cè)擴(kuò)增子的方法。本發(fā)明在第五個(gè)實(shí)施方案中涉及檢測(cè)擴(kuò)增子的試劑盒，所述試劑盒包含捕獲分子。應(yīng)理解，在許多情況下，引物對(duì)的選擇很大程度受到期望的反應(yīng)條件和對(duì)共有引物的需要的影響。引物的選擇反過(guò)來(lái)限定了待產(chǎn)生的擴(kuò)增子。接下來(lái)，在擴(kuò)增子上鑒定用于與捕獲分子的選擇性雜交的序列。需要在擴(kuò)增子上選擇可能與同源擴(kuò)增子的對(duì)應(yīng)區(qū)域不同的區(qū)域。為達(dá)本發(fā)明的目的，有必要將選定的序列定位在與擴(kuò)增子末端確定的距離處。選定的序列確定了擴(kuò)增子的兩個(gè)末端，一個(gè)末端比另一個(gè)長(zhǎng)。較長(zhǎng)的末端將成為間隔區(qū)末端；較短的末端將成為非間隔區(qū)末端。間隔區(qū)末端比非間隔區(qū)末端長(zhǎng)至少50個(gè)堿基。捕獲分子包含捕獲部分和間隔區(qū)部分。捕獲部分一般與所述擴(kuò)增子的選定序列互補(bǔ)，以保證擴(kuò)增子與捕獲分子的最佳雜交。間隔區(qū)部分也是多核苷酸，但不與擴(kuò)增子的間隔區(qū)末端互補(bǔ)(當(dāng)然也不與非間隔區(qū)末端互補(bǔ))。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，捕獲分子固定在固體支持物上，其間隔區(qū)部分定位于支持物一側(cè)，而特異于擴(kuò)增子的捕獲分子的序列(即，捕獲部分)定位于游離末端。換言之，間隔區(qū)部分定位于固體支持物和捕獲部分之間?？赏ㄟ^(guò)任何本領(lǐng)域已知方法附著于固體支持物上。應(yīng)理解，捕獲分子的間隔區(qū)部分可從捕獲部分的5，末端或其3，末端延伸。這是由需要擴(kuò)增子的間隔區(qū)末端比其非間隔區(qū)末端更長(zhǎng)(至少長(zhǎng)50個(gè)堿基)決定的。如果捕獲分子的間隔區(qū)部分在捕獲部分的5，末端，則捕獲分子附著于固體表面是在捕獲分子的5，末端或附近。相反，如果間隔區(qū)部分在捕獲部分的3，末端，則捕獲分子通過(guò)其3，末端或附近附著于固體支持物上。在另一個(gè)實(shí)施方案中，捕獲分子的間隔區(qū)部分的遠(yuǎn)端具有含有游離氨基的核苷酸，待用于在優(yōu)選含有胺可在其上反應(yīng)的醛或環(huán)氧化合物官能團(tuán)或其他化學(xué)基團(tuán)的活化的支持物上反應(yīng)，以能在捕獲分子和支持物之間或在覆蓋支持物的材料上形成共價(jià)鍵。本發(fā)明的方法給出的最佳結(jié)果是檢測(cè)長(zhǎng)度至少200個(gè)核苷酸，優(yōu)選至少300個(gè)，更優(yōu)選多于400個(gè)核苷酸的擴(kuò)增子。所以優(yōu)選所述長(zhǎng)度的擴(kuò)增子。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)使用長(zhǎng)間隔區(qū)部分可顯著提高檢測(cè)速度和產(chǎn)率。捕獲分子的捕獲部分與固體支持物表面優(yōu)選被至少約6.8nm(相當(dāng)于在雙螺旋形式的至少20個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)的核苷酸的距離)的間隔區(qū)部分隔開(kāi)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，捕獲分子的間隔區(qū)部分是由至少20個(gè)核苷酸，優(yōu)選40個(gè)以上，更優(yōu)選60個(gè)以上和最優(yōu)選90個(gè)核苷酸以上的核苷酸序列構(gòu)成的多核苷酸鏈。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，捕獲分子具有與如下序列具有至少60%同源性的間隔區(qū)部分5，GAATTCAAAGTTGCTGAGAATAGTTCAATGGAAGGAAGCG3'(SEQIDNO:l)(40個(gè)堿基)。所述同源性更優(yōu)選至少80%，最優(yōu)選至少90%。在另一個(gè)實(shí)施方案中，捕獲分子具有與如下序列具有至少60%的同源性的間隔區(qū)部分5，AAAGTTGAGTCCATTTGTGATGCTAGAAAAGTTGGAACTTTCTTGAACGTCTCCTATATGTCATACATGAATAGGTTGATTTTACTGTAC3，(SEQIDNO:2)(90個(gè)堿基)。所述同源性更優(yōu)選至少80%，最優(yōu)選至少90%。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，捕獲分子具有與如下序列具有至少60%的同源性的間隔區(qū)部分5，ATAAAAAAGTGGGTCTTAGAAATAAATTTCGAAGTGCAATAATTATTAT丁CACAACATTTCGATTTTTGCAACTACTTCAGTTCACTCCAAATTA3'(SEQIDNO:3)(95個(gè)堿基)。所述同源性更優(yōu)選至少80%，最優(yōu)選至少90%。本發(fā)明的另一個(gè)重要方面是使用固體支持物的表面上的特定濃度的捕獲分子。如果這一濃度太低，結(jié)合產(chǎn)率就低，還可能檢測(cè)不到。將捕獲分子固定到固體支持物的過(guò)程中，點(diǎn)樣溶液中捕獲分子的濃度優(yōu)選約600-約3000nM。但在有利的情況(當(dāng)共價(jià)固定的產(chǎn)率高；或當(dāng)待檢測(cè)的靶是單鏈，并以高濃度存在時(shí))下，低如約100nM濃度仍可給出陽(yáng)性結(jié)果。所述低點(diǎn)樣濃度給出的捕獲分子的密度低如20fmoles/cm2。另一方面，更高密度在測(cè)定中只受到捕獲溶液濃度的限制，但高于3000nM的濃度仍可給出好結(jié)果。表面密度通常不超過(guò)2000fmoles/cm2。如本發(fā)明所述使用所述非常高的濃度、長(zhǎng)間隔區(qū)部分和特別設(shè)計(jì)的捕獲分子是本發(fā)明出乎意料的特征。DNA雜交理論提示，溶液中兩個(gè)DNA互補(bǔ)序列之間的雜交速度與DNA長(zhǎng)度的平方根成正比，較小的是限制因素(WetmurandDavidson,J.Mol.Biol，Vol.3，p.584，1968)。為達(dá)到所需檢測(cè)特異性，捕獲分子的特定序列(捕獲部分)不得不短于靶，因?yàn)檩^長(zhǎng)的序列有更多機(jī)會(huì)與非特異序列發(fā)生交叉反應(yīng)。因?yàn)樗鼈冃?，所以其與互補(bǔ)序列的反應(yīng)速度低。另外，捕獲分子還在支持物上，由于擴(kuò)散限制，固體表面的存在甚至更加降低了反應(yīng)速度。由于靶是PCR擴(kuò)增得到的，并是雙鏈，所以它們?cè)谌芤褐袕?fù)性比它們與固定于固體支持物上的小序列雜交快得多，在固體支持物上的擴(kuò)散較小，從而甚至更加減低了反應(yīng)速度。本發(fā)明出乎意料地觀察到擴(kuò)增子在如此短的特異序列上有如此大的雜交產(chǎn)率。這樣出乎意料的效果的原因還不清楚?？赡艿慕忉屩皇且韵铝蟹绞接伤鲩g隔區(qū)部分的核苷酸序列的擴(kuò)增子鏈穩(wěn)定化的出乎意料的效果，DNA雜交過(guò)程分為兩步成核和扣緊。在成核步驟中，靶的約5個(gè)堿基的短序列伸展沿著捕獲分子序列相互作用，直到發(fā)現(xiàn)完美的匹配。這一步驟是雜交的限制步驟。多核苷酸間隔區(qū)部分的存在可在成核過(guò)程中起穩(wěn)定因子的作用。即便間隔區(qū)部分不與靶互補(bǔ)，它也將與在鄰近定位并將導(dǎo)致一些相互作用的穩(wěn)定化的靶的一些堿基相互作用。一旦完成成核，鄰近堿基的雜交就非常快(zippering，扣緊)，且雙螺旋的增殖穩(wěn)定雜交。本發(fā)明的方法可通過(guò)提供包含實(shí)施本方法所必需的特定成分的試劑盒來(lái)實(shí)施。所述試劑盒特別包含通過(guò)本發(fā)明的方法設(shè)計(jì)的捕獲分子。所述試劑盒還可包含固體支持物。所述固體支持物可經(jīng)預(yù)處理，以與捕獲分子的間隔區(qū)部分反應(yīng)，或者所述固體支持物可有捕獲分子固定于其上。另外，所述試劑盒還可含有用于進(jìn)行擴(kuò)增子與捕獲分子的雜交的工具和/或用于進(jìn)行PCR的引物和標(biāo)記工具和/或洗滌溶液。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述試劑盒至少含有不可溶的固體支持物，面)，其中所述微陣列為至少4個(gè)捕獲分子/cm2，優(yōu)選至少10，16，20，50,100，1000，4000，10000或更多不同捕獲分子/em2固體支持物表面o捕獲分子長(zhǎng)度優(yōu)為約30-約600個(gè)堿基，優(yōu)選30-300個(gè)堿基，更優(yōu)選40-150個(gè)堿基(包括間隔區(qū)部分)，并含有約10-約100個(gè)堿基的捕獲部分，所述捕獲部分特異于靶(這意味著所述序列的所述堿基可通過(guò)互補(bǔ)雜交與其靶序列上的互補(bǔ)堿基結(jié)合)。所述雜交優(yōu)選在嚴(yán)格條件下(在本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的條件下)進(jìn)行。在本發(fā)明的方法中，與所述靶互補(bǔ)的捕獲分子的所述部分(或其部分)含有10-100個(gè)核苷酸，優(yōu)選15-40個(gè)核苷酸，更優(yōu)選20-30個(gè)核苷酸。所述核苷酸優(yōu)選為位于或靠近捕獲分子末端的連續(xù)序列。這一序列被認(rèn)為是用于檢測(cè)的特異序列(捕獲部分)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，捕獲部分可區(qū)分靶序列與至少與所述靶的同源性不到85%的另一個(gè)序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，用于檢測(cè)兩個(gè)不同的擴(kuò)增子的兩個(gè)捕獲分子的所述捕獲部分相差10%以上，甚至優(yōu)選20%以上。本發(fā)明設(shè)計(jì)的捕獲分子可使鑒定從(微)生物體或其部分得到的靶序列，尤其是可能存在于來(lái)自至少4個(gè)其他同源(微)生物體或其部分的生物樣品中的基因，所述其他(微)生物體可能存在于所述相同的生物樣品中并具有與靶同源的核苷酸序列。通過(guò)首先使用通用引物對(duì)所述核苷酸序列(乾及其同源序列)進(jìn)行基因擴(kuò)增，然后再(洗滌后)區(qū)分所述經(jīng)擴(kuò)增的可能不同的把而進(jìn)行所述鑒定?？蓛?yōu)選通過(guò)在給定位置含有特異于靶(特異于每個(gè)可能存在于生物樣品中的(微)生物體)的捕獲分子的陣列表面進(jìn)行雜交，再通過(guò)鑒定和可能的記錄來(lái)自所述靶與其對(duì)應(yīng)的捕獲分子在預(yù)期位置上的特異性結(jié)合的信號(hào)(特異于靶的單個(gè)定位信號(hào))鑒定所述特異靶而進(jìn)行所述區(qū)分。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的基因擴(kuò)增的方法是使用可識(shí)別所有所述靶同源核苷酸序列的兩個(gè)反向共有引物的PCR。選擇所述引物，從而使得到的擴(kuò)增子至少含有200bp，優(yōu)選至少300bp，更優(yōu)選至少400bp;所述擴(kuò)增子優(yōu)選不超過(guò)2000bp。本發(fā)明的方法還包括將所述檢測(cè)信號(hào)(可能記錄)與下列的存在相關(guān)聯(lián)的步驟特定(微)生物體、序列的遺傳特征、序列多態(tài)性、遺傳疾病的診斷誘因或演化(檢測(cè))，所述遺傳疾病包括已從中得到生物樣品的患者(包括人)的癌癥。(微)生物體可存在于任何得到遺傳物質(zhì)的生物物質(zhì)(病毒，真菌，細(xì)菌，植物，或動(dòng)物細(xì)胞，包括人)中。生物樣品也可為任何培養(yǎng)基質(zhì)，其中存在微生物、異生素，污染物，以及從植物或動(dòng)物(包括人)器官、組織、細(xì)胞或生物液體(血液，血清，尿等)得到的提取物。本發(fā)明的方法尤其適用于鑒定可能存在于至少存在4，l2，15或甚至更多的同源序列的生物樣品中的靶，所述靶優(yōu)選是(微)生物體或其部分。由于高度同源，可使用通用引物擴(kuò)增所述序列，從而可通過(guò)乾與相應(yīng)的捕獲分子結(jié)合后的所述區(qū)分特異性地鑒定所述靶，其中所述捕獲分子預(yù)先結(jié)合于所述微陣列的給定位置上。若將捕獲分子通過(guò)機(jī)器手高密度陣列點(diǎn)樣于固體支持物表面，也可大大提高靈敏度。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案在于將可至約0.01-5pmole序列等同物/cm2固體支持物表面的捕獲分子點(diǎn)樣到陣列上。本發(fā)明的試劑盒也可摻入各種用于實(shí)施本發(fā)明的方法的介質(zhì)或裝置。所述試劑盒(或裝置)也可包含于用于檢測(cè)和/或定量存在于待分析的生物樣品中的多個(gè)核苷酸序列的自動(dòng)儀器(如高通量篩選儀器)中?？墒顾鲈噭┖谢騼x器適用于實(shí)施本發(fā)明的方法的所有步驟或僅幾個(gè)特定步驟。如果待檢測(cè)的序列之間同源性低(30-60%)，可將每個(gè)序列中均分。但i難尋找足夠保守至可設(shè)計(jì)可、:^增或拷貝所有所需序列的"共有，，序列的部分序列。如果一對(duì)共有引物不足以擴(kuò)增所有同源序列，則為了完成所需擴(kuò)增，可加入兩個(gè)或多個(gè)引物對(duì)的混合物。在共有擴(kuò)增中，通過(guò)所述相同共有引物擴(kuò)增的同源序列的最小數(shù)是2，但此數(shù)無(wú)上限。如果所述序列顯示出高度同源性(大于60%,甚至大于90%)，則容易尋找共有引物的通用序列，但選擇捕獲部分將變得更難。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于共有擴(kuò)增的引物對(duì)可擴(kuò)增至少同源性達(dá)60%以上，甚至90%以上的兩個(gè)乾同源序列，且所述捕獲分子可特異性檢測(cè)兩個(gè)同源的靶。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述捕獲分子是化學(xué)合成的寡核苷酸序列(易于在程序化的自動(dòng)合成儀上合成)。所述序列可帶有用于以高濃度共價(jià)附著于支持物上的官能團(tuán)，且通常短于200個(gè)堿基。優(yōu)選通過(guò)PCR擴(kuò)增(對(duì)摻入含有捕獲分子的特異部分(捕獲部分)和非特異部分(間隔區(qū)部分)的質(zhì)粒中的序列)合成更長(zhǎng)的捕獲分子。本發(fā)明的方法適用于檢測(cè)和/或定量由DNA或RNA(包括在總長(zhǎng)度上部分或完全同源的序列)構(gòu)成的靶。甚至當(dāng)靶與其他分子間的同源性(或序列同一性)大于30%，大于60%，甚至大于80%時(shí)，仍可實(shí)施本發(fā)明的方法。在本發(fā)明的方法中，所述捕獲分子益如下文所述優(yōu)選通過(guò)其末端共價(jià)結(jié)合(或固定)至不溶的固體支持物上。本發(fā)明的方法給出了顯著的結(jié)果，允許鑒定(檢測(cè)和定量)溶液中濃度低于約10nM，低于約lnM，優(yōu)選低于O.lnM及更優(yōu)選低于約O.OlnM(=1fmole/100nl)的擴(kuò)增子。"結(jié)合"至樣點(diǎn)的靶量相比存在的捕獲分子量是非常小的。因此捕獲分子大大過(guò)量，甚至如果捕獲分子量更大，也沒(méi)有理由得到結(jié)合。可于擴(kuò)增或拷貝后檢測(cè)全長(zhǎng)序列，且當(dāng)通過(guò)摻入標(biāo)記核苷酸進(jìn)行標(biāo)記時(shí)，已雜交的把上存在的更多標(biāo)記，使檢測(cè)變得更加靈敏?；驒z測(cè)也是本發(fā)明優(yōu)選的應(yīng)用?？赏ㄟ^(guò)先反轉(zhuǎn)錄mRNA，再使用如本發(fā)明所述的共有引物進(jìn)行擴(kuò)增來(lái)檢測(cè)同源基因。本發(fā)明給出的雜交速度及產(chǎn)量的提高尤其適用于檢測(cè)存在于溶液中的單鏈DNA或RNA;本發(fā)明益應(yīng)用于檢測(cè)來(lái)自mRNA的cDNA轉(zhuǎn)錄物，用于檢測(cè)使用T7聚合酶測(cè)定進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)生的RNA。在微生物領(lǐng)域，可使用特異于微生物各科或?qū)俚墓灿幸?，再使用本發(fā)明的捕獲分子鑒定陣列中的所述各科的一些或所有種。益于同一陣列上檢測(cè)其他序列(即，通過(guò)使與用于定量的標(biāo)準(zhǔn)核苷酸序列、與用于相同或不同的微生物菌林的共有捕獲分子、與可通過(guò)微生物檢測(cè)可能的抗生素抗性基因或或用于雜交的陽(yáng)性或陰性對(duì)照序列雜交)。陣列上也可存在用于與來(lái)自相同科或?qū)俚奈⑸锏乃行蛄须s交的作為共有捕獲分子的長(zhǎng)捕獲分子，從而給出生物樣品中是否存在所述科、屬的微生物的信息。所述陣列也可載有特異于細(xì)菌組(革蘭氏陽(yáng)性或革蘭氏陰性菌林或甚至所有細(xì)菌)的捕獲分子。另一應(yīng)用是使用特定捕獲分子(含或不含用于可能存在于生物樣品中的所有細(xì)胞色素的共有捕獲分子)檢測(cè)來(lái)自同種共有蛋白(如各種細(xì)胞色素P450)的同源基因。通過(guò)反轉(zhuǎn)錄成cDNA而在基因水平進(jìn)行所述檢測(cè)。本發(fā)明的固體支持物可為選自下列的材料，或可由選自下列的材料制成凝膠層、玻璃、電子裝置、硅或塑料支持物、多聚物、致密圓盤(pán)、金屬支持物或其混合物(參見(jiàn)EP0535242，美國(guó)專利No.5，736，257、W099/35499、美國(guó)專利No.5，552，270等)。所述固體支持物益為可包括其他配置(條碼，標(biāo)記等)或用于改進(jìn)本發(fā)明的方法的介質(zhì)的單個(gè)栽波片。所述固體支持物優(yōu)選珠形式。用于本發(fā)明的方法的擴(kuò)增步驟益使用本領(lǐng)域熟知的擴(kuò)增方法，優(yōu)選選自PCR、RT-PCR、LCR、CPT、NASBA、ICR或雪崩DNA(AvalancheDNA)技術(shù)。在特定實(shí)施方案中，所述捕獲分子檢測(cè)PCR擴(kuò)增過(guò)程中的擴(kuò)增子。在另一個(gè)特定實(shí)施方案中，使所述捕獲分子跟蹤PCR循環(huán)過(guò)程中產(chǎn)生的擴(kuò)增子。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述捕獲分子被用于實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)擴(kuò)增子。實(shí)時(shí)檢測(cè)在連續(xù)PCR循環(huán)過(guò)程中產(chǎn)生的擴(kuò)增子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所迷捕獲分子被用于陣列上的實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)。在PCR擴(kuò)增過(guò)程中檢測(cè)擴(kuò)增子是本發(fā)明的主要特征之一。通過(guò)設(shè)計(jì)所述捕獲分子可使其結(jié)合在不同擴(kuò)增循環(huán)中形成的擴(kuò)增子。所述結(jié)合除需要在PCR循環(huán)過(guò)程中以任何方式進(jìn)行的兩條鏈的解離及為得到特異和快速雜交的正確條件(溫度和鹽濃度)外，無(wú)需對(duì)所述擴(kuò)增子進(jìn)行任何特殊處理。本領(lǐng)域技術(shù)人員可易于確定所述條件。由于本發(fā)明避免了為在捕獲分子上檢測(cè)而切割擴(kuò)增子的可能性，使所述實(shí)施方案成為可能。可以與單鏈捕獲分子雜交前，標(biāo)記所述待鑒定的靶。優(yōu)選于變性(如果本方法包括擴(kuò)增步驟)前在所述擴(kuò)增序列上進(jìn)行所述標(biāo)記(用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù))。根據(jù)本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明的方法益被用于鑒定一起或分別生物樣品的同源器官的不同的葡萄球菌種或變體，優(yōu)選為金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、人葡萄球菌或溶血性葡萄球菌，通過(guò)優(yōu)選使用FemA基因序列中的通用位置來(lái)檢測(cè)所述不同種中的FemA基因的遺傳變體而進(jìn)行所述檢測(cè)。所述用于得到擴(kuò)增產(chǎn)物的引物和FemA序列的特異部分優(yōu)選為下文實(shí)施例l和2中描述的引物和FemA序列的特異部分。已將所述引物選為用于擴(kuò)增所有15個(gè)被測(cè)試的葡萄球菌的FemA基因的共有引物，所述引物可能會(huì)擴(kuò)增所有其它可能的葡萄球菌種的FemA(實(shí)施例3)。實(shí)施例4中描述了根據(jù)本發(fā)明檢測(cè)12個(gè)MAGE-A。所述陣列允許通過(guò)觀察栽有特定捕獲分子信號(hào)的陽(yáng)性線讀取MAGE數(shù)量。本發(fā)明另一方面涉及含有本發(fā)明的捕獲分子的生物芯片或微陣列的任何部分。再一方面是用于鑒定特異于科型微生物的靶序列(通過(guò)列)的通用篩選方法?？稍陉嚵猩想s交后，通過(guò)現(xiàn)有技術(shù)檢測(cè)所述乾序列。無(wú)需標(biāo)記，優(yōu)選的方法是通過(guò)已適用于陣列的質(zhì)讒分析法(美國(guó)專利No.5，821，060)，或通過(guò)嵌入劑，隨即用熒光檢測(cè)(W097/27329或Fodoretal，Nature,Vol.364，p.555，1993)來(lái)鑒定所述乾。有許多基于標(biāo)記的檢測(cè)方法。有關(guān)不同標(biāo)記分子的綜述見(jiàn)W097/27317。它們是使用經(jīng)標(biāo)記的引物或在拷貝或擴(kuò)增過(guò)程中摻入經(jīng)標(biāo)記的核苷酸而得到的。也可通過(guò)將可檢測(cè)的部分連至待測(cè)RNA或DNA(通過(guò)連接酶連于序列末端的經(jīng)標(biāo)記的寡核苷酸)而進(jìn)行標(biāo)記。也可使用激酶、轉(zhuǎn)移酶或類(lèi)似酶將經(jīng)標(biāo)記的核苷酸摻于RNA或DNA片段的5，OH或3'OH末端。最常用的標(biāo)記是適用于在商品化的陣列掃描儀(GeneralScanning,GeneticMicrosystem)上分析陣列的熒光染料，如Cy3、Cy5和Cy7。常用方法為放射性標(biāo)記、冷標(biāo)記或使用小分子間接標(biāo)記后使用特定配體(鏈霉抗生物素或抗體)識(shí)別。所得固定于陣列上的靶信號(hào)是擴(kuò)散得到的熒光或色度、電子發(fā)光、生物或化學(xué)發(fā)光、磁、電(如阻抗或電壓電流)(美國(guó)專利No.5，312，527)。優(yōu)選的方法使用金標(biāo)記結(jié)合的靶以得到沉淀或易于隨后用掃描儀檢測(cè)和定量的銀染。定量需考慮的不僅是陣列上的雜交產(chǎn)率和檢測(cè)規(guī)模(對(duì)靶和參比序列是相同的)，而且還要考慮提取、擴(kuò)增(或拷貝)及標(biāo)記步驟。本發(fā)明的方法還可包括通過(guò)使用以已知濃度加入的標(biāo)準(zhǔn)核苷酸序列(外部或內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物)定量靶核苷酸序列的工具。陣列上也可存在捕獲分子，以在與所述靶相同的條件下固定所述標(biāo)準(zhǔn)物(可能在擴(kuò)增或拷貝后)；為定量生物樣品中待檢測(cè)和/或定量的原核苷酸序列的存在，所述方法包括定量來(lái)自通過(guò)捕獲分子和所述標(biāo)準(zhǔn)物之間的互補(bǔ)堿基配對(duì)形成的雙鏈核苷酸序列形成所得信號(hào)的步驟，和對(duì)所述雙鏈核苷酸序列形成所得信號(hào)與來(lái)自通過(guò)捕獲分子和靶之間的互補(bǔ)堿基配對(duì)形成的雙鏈核苷酸序列所得信號(hào)進(jìn)行相關(guān)性分析的步驟?？梢詫⑺鰳?biāo)準(zhǔn)物加入初始生物樣品中，或在提取步驟后加入所述初始生物樣品中，并使用相同的引物進(jìn)行擴(kuò)增或拷貝，和/或所述標(biāo)準(zhǔn)物與所述靶的長(zhǎng)度和GC含量相同，或相差不超過(guò)20%?？筛鼉?yōu)選竟?fàn)幮詢?nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物。所述內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物，其部分序列與靶相同，特異部分與耙不同。其兩端或靠近兩端的序列與用于擴(kuò)增或拷貝靶的兩個(gè)引物互補(bǔ)，且GC含量相似(WO98/11253)。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述標(biāo)準(zhǔn)物和靶的共同部分指與使用相同引物擴(kuò)增的所有靶同源的核苷酸序列(即屬于待定量的相同科或生物體)。所述標(biāo)準(zhǔn)物通過(guò)所述特異序列的雜交產(chǎn)率優(yōu)選與靶序列的雜交產(chǎn)率相同或相差不超過(guò)20%，并如W098/11253所述進(jìn)行雜交。也可以將所述標(biāo)準(zhǔn)核苷酸序列、外部和/或內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物包含于本發(fā)明的試劑盒中，可能含有實(shí)施本發(fā)明的不同步驟必需的所有介質(zhì)和工具(雜交和培養(yǎng)介質(zhì)、聚合酶及其他酶、標(biāo)準(zhǔn)序列、標(biāo)記分子等)。生物芯片也可以載有含有各種濃度(實(shí)施例4)經(jīng)標(biāo)記的捕獲分子的樣點(diǎn)。用已知濃度的溶液點(diǎn)樣所述經(jīng)標(biāo)記的捕獲分子?？赏ㄟ^(guò)其信號(hào)將雜交結(jié)果轉(zhuǎn)化為絕對(duì)量。也可評(píng)估所述檢測(cè)的再現(xiàn)性?？蓪⑺龉腆w支持物(生物芯片)通過(guò)基于顯微流技術(shù)的溶液控制插入與另一個(gè)室和自動(dòng)機(jī)器連接的支持物中。由于被插入所述微型實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)中，因此可對(duì)其進(jìn)行自動(dòng)化的溫浴、加熱、洗滌和標(biāo)記，甚至可以及之前的步驟(如DNA提取，PCR擴(kuò)增)或之后的步驟(標(biāo)記和檢測(cè))。所有這些步驟均可在相同的固體支持物上進(jìn)行。以下將參考附圖與下列非限制性實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。實(shí)施例實(shí)施例1.捕獲分子在擴(kuò)增子鏈內(nèi)的位置對(duì)其在微陣列上的雜交效率的影響在此實(shí)施例中，我們檢測(cè)了捕獲分子相比擴(kuò)增子序列的位置對(duì)本發(fā)明所述的雜交效率的影響。將促旋酶基因用作基因靶。我們制備了定位于擴(kuò)增子的不同區(qū)域的捕獲分子的捕獲部分(27個(gè)核苷酸)靶定的915bp的促旋酶擴(kuò)增子(圖1)。這些捕獲分子也包括90bp的間隔區(qū)部分。將所述捕獲分子陣列固定于固體支持物上。將所述捕獲分子中的3個(gè)(la、2a、3a)設(shè)計(jì)為與正義鏈互補(bǔ)，而使3個(gè)其他的捕獲分子(ls，2s，3s)靶定同一區(qū)域，但與反義鏈雜交(圖1)。細(xì)菌菌林參比窗林金黃色葡萄球菌ATCC25923得自DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH(DSMZ，德國(guó))。DNA純化在需氧條件下，37'C，于LB培養(yǎng)基(10g蛋白胨，5g酵母提取物，和5gNaC1/1)中，從單菌落過(guò)夜生長(zhǎng)細(xì)菌菌林。通過(guò)離心(5000g,5min)沉淀過(guò)夜培養(yǎng)物的等分試樣(O.lml)。將細(xì)菌沉淀重懸于300jd的含有100ng的溶葡萄球菌素(Sigma，Mo，USA)和100jig的RNase的溶菌緩沖液(50mMTrisHClpH8.0、100nMEDTA、150mMNaCl、1%SDS)中，并在37'C溫浴30分鐘。在200ng蛋白酶K(Boehringer，Mannheim，德國(guó))存在下，于37'C，溫浴30分鐘及煮沸5分鐘完成溶菌。于4000g離心溶菌物5分鐘，根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)，通過(guò)吸附于NucleospinC+T柱(Macherey-Nagel，Duren，德國(guó))上，從200^1上清液提取DNA。用200jU的無(wú)菌水洗脫DNA，并保存于-20'C。PCR擴(kuò)增使用下列共有引物PCR擴(kuò)增部分^v""w爿(GYR)基因gyrl5，GCNGCDGCRATGCGTTATAC3，gyr35，GAACCHYKACCTGTTTCATA3'N-A、G、T、CD=G、A、TR=A、GH=A、T、CY=C、TK=G、T所述引物是為擴(kuò)增來(lái)自不同細(xì)菌的多個(gè)促旋酶而設(shè)計(jì)的共有引物。用于檢測(cè)促旋酶擴(kuò)增子的捕獲分子的捕獲部分的序列如下捕獲分子名促旋酶A基因的捕獲部分(5，->3，)laTTCTTGTCACGAACGAGCT2aGAAAGTTTGAAGCGTTGTTG3aTCCTCTAAGTCTTCAAATCCIsAGCTCGTTCGTGACAAGAA2sCAACAACGCTTCAAACTTTC3sGGATTTGAAGACTTAGAGGA微陣列裝配于捕獲部分的5'末端延伸如下序列的90bp的間隔區(qū)部分:5，胺-TATGTCATACATGAATAGGTTGATTTTACTGTAC3，(SEQIDNO:2)間隔區(qū)的最后一個(gè)核苷酸在其5，末端被胺化。所述陣列也含有雜交陽(yáng)性對(duì)照和雜交陰性對(duì)照，前者是雜交至其對(duì)應(yīng)的捕獲分子上的CYP2B2擴(kuò)增子，后者是CYP2B2不能結(jié)合于其上的NFKB序列的捕獲分子。在所述陣列上還有對(duì)應(yīng)于生物素化的CMVDNA的檢測(cè)對(duì)照捕獲分子。捕獲分子的固定根據(jù)Schena等人(Pro"Natl.Acad.Sci.USA,Vol.93，p.10614,1996)所述方案，將胺化的DNA接合到醛化玻璃(aldehydederivatizedglass)上。用濃度為3000nM的溶液中的于5，末端被胺化的捕獲分子進(jìn)行點(diǎn)樣。使用自制的機(jī)器手裝置(250jimpin，Genetix(英國(guó)))將捕獲分子印到微型載波片上。所述微型栽波片是如申請(qǐng)WO02/18288所述帶有醛基的載波片。樣點(diǎn)直徑為400nm，分配的體積約0.5nl。在室溫下干燥載波片，于4'C保存，待用。PCR擴(kuò)增在含有4mMMgCh、10mMTrispH8.4、50mMKCl、0.5nM每種引物、50nM每種dNTP、10nM生物素-16-dATP和生物素-16-dCTP、1.5U的TaqDNA聚合酶超級(jí)工具、lOjd提取的DNA的50^1體系中，對(duì)從參比菌林提取的DNA進(jìn)行PCR。樣品首先于94。C變性3分鐘。然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增，所述擴(kuò)增由94BC30秒，55'C30秒，72。Cl分鐘構(gòu)成，最后于72。C延伸10分鐘。將水對(duì)照用作擴(kuò)增的陰性對(duì)照。靼擴(kuò)增子的大小是915bp。雜交向35jd的雜交溶液(Eppendorf，Hamburg,德國(guó))中加入20^1的擴(kuò)增子，并在雜交室框定的陣列上加栽所述溶液。對(duì)于陽(yáng)性對(duì)照，向所述溶液中加入50nM的375bp的生物素化的CYP2B2擴(kuò)增子；將其對(duì)應(yīng)的捕獲分子點(diǎn)樣于陣列。用蓋子蓋住所述室，并于95'C變性栽波片5分鐘。于65。C雜交2小時(shí)。用洗滌緩沖液洗滌樣品4次。焚光檢測(cè)于室溫下用經(jīng)綴合Cy3的IgG抗生物素(JacksonImmunoResearchLaboratories,Inc#200-162-096)稀釋1/1000X的綴合物-Cy3，于阻斷緩沖液中避光溫浴玻璃樣品45分鐘。將栽波片經(jīng)洗滌后干燥，并于室溫下保存。用激光共聚焦掃描儀"ScanArray"(Packard,美國(guó))進(jìn)行檢測(cè)。然后，使用特定的定量軟件定量每個(gè)載波片。經(jīng)洗滌和分析后觀察到每個(gè)捕獲分子的熒光信號(hào)都不相同。繪出雜交熒光強(qiáng)度對(duì)被捕獲分子識(shí)別的擴(kuò)增子區(qū)域的關(guān)系曲線，發(fā)現(xiàn)在熒光強(qiáng)度和擴(kuò)增子游離間隔區(qū)末端長(zhǎng)度之間具有相關(guān)性(圖2)。最強(qiáng)的雜交信號(hào)總是與靶定在間隔區(qū)部分側(cè)具有非常長(zhǎng)的游離末端的擴(kuò)增子鏈的捕獲分子(捕獲分子la和3s)相關(guān)。在捕獲分子3a和lS的情況中，乾的游離末端非常短，幾乎不與間隔區(qū)部分接觸。在捕獲分子2a和2s的情況中，乾的游離末端是中間體，間隔區(qū)部分的穩(wěn)定子效果是可變的。如下表格概括了捕獲分子的捕獲部分與正義或反義擴(kuò)增子鏈的間隔區(qū)末端(3，末端)和非間隔區(qū)末端(5，末端)的距離。也顯示了熒光信號(hào)強(qiáng)度。<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>實(shí)施例2:間隔區(qū)部分的長(zhǎng)度對(duì)在陣列上檢測(cè)同源FemA序列的靈敏度的影響在這一實(shí)施例中，我們檢測(cè)了在根據(jù)本發(fā)明的捕獲分子的設(shè)計(jì)中，間隔區(qū)部分的長(zhǎng)度對(duì)雜交效率的影響。將Fe附^基因用作基因靼。我們制備了定位于距離正義擴(kuò)增子鏈的游離3，末端(間隔區(qū)末端)415bp處的27個(gè)堿基的捕獲分子的互補(bǔ)捕獲部分乾定的585bp的表皮葡萄球菌擴(kuò)增子。27個(gè)堿基的捕獲部分于其5，末端含有不同長(zhǎng)度(20、40、85和95個(gè)堿基)的間隔區(qū)部分。PCR擴(kuò)增所述靶是使用如下共有引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的表皮葡萄球菌的Fem^基因序列的片段AP畫(huà)3-1:5'TAAYAAARTCACCAACATAYTC3'AP函3-2:5'TYMGNTCATTTATGGAAGATAC3'Y=C、TR=A、GM=A、CN-A、G、T、C在含有3mMMgCl2、lmMTrispH8、lnM每種引物、200nMdATP、dCTP和dGTP、150jiMdTTP、50fiM生物素-16-dUTP、2.5U的TaqDNA聚合酶(BoehringerMannheim,德國(guó))、1U的不耐熱的尿嘧啶-DNA-糖基化酶(BoehringerMannheim，德國(guó))、lng含有/^w^基因的質(zhì)粒的100nl體系中進(jìn)行所述PCR。樣品首先在94'C變性5分鐘。然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增，所述循環(huán)由94aC1分鐘、50。C1分鐘、72°C1分鐘構(gòu)成，最后于72'C延伸10分鐘。將水對(duì)照用作擴(kuò)增的陰性對(duì)照。當(dāng)捕獲分子是47，67，112或122個(gè)堿基的含有27個(gè)堿基的捕獲部分和長(zhǎng)度可變(20，40，85或95個(gè)堿基)的間隔區(qū)部分的單鏈DNA時(shí)，把擴(kuò)增子長(zhǎng)585bp。微陣列裝配所用捕獲分子序列如下命名序列(5，->3，)捕獲分子ATepi03GAATTCAAAGTTGCTGAGAAATTAAGCACATTTCTTTCATTATTTAGATepi04GAATTCAAAGTTGCTGAGAATAGTTCAATGGAAGGAAGCGATTAAGCACATTTCTTTCATTATTTAGATepi06CATTTCGATTTTTGCAACTACTTCAGTTCAATTAAGCACATTTCTTTCATTATTTAGAtepi08ATAAAAAAGTGGGTCTTAGAAATAAATTTCGAAGTGCAATAATTATTATTCACAACATTTCGATTTTTGCAACTACTTCAGTTCACTCCAAATTAATTAAGCACATTTCTTTCATTATTTAG間隔區(qū)部分的序列有下劃線。生物芯片也含有陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，前者是與其對(duì)應(yīng)的捕獲分子雜交的CMV擴(kuò)增子，后者是CMV不能結(jié)合于其上的HIV-I序列的捕獲分子。如實(shí)施例1所述固定所迷捕獲分子。雜交向65jil的雜交溶液(Eppendorf，Hamburg,德國(guó))中加入5^1的擴(kuò)增子，向雜交室框定的陣列上加載所述溶液。對(duì)于陽(yáng)性對(duì)照，向溶液中加入2nM的437bp的生物素化的CMV擴(kuò)增子；將其對(duì)應(yīng)的捕獲分子點(diǎn)樣于陣列。用蓋子蓋住所述室，于95"變性所述栽波片5分鐘。于60'C雜交2小時(shí)。用洗滌緩沖液洗滌樣品4次。熒光檢測(cè)于室溫下將所述玻璃樣品與800jU經(jīng)花青苷3或花青苷5標(biāo)記的鏈霉抗生物素溫浴45分鐘。將所述載波片經(jīng)洗滌后干燥，再于室溫下保存。用陣列掃描儀GSM418(GeneticMicrosystem,Woburn，Mass"美國(guó))進(jìn)行檢測(cè)。然后使用特定的定量軟件定量每個(gè)載波片。如圖3所示，當(dāng)相對(duì)擴(kuò)增子的捕獲部分的設(shè)計(jì)保持不變時(shí)，95個(gè)核苷酸的間隔區(qū)部分的雜交速度比20個(gè)核苷酸的間隔區(qū)部分高5倍。實(shí)施例3:設(shè)計(jì)用于在陣列上檢測(cè)15個(gè)同源FemA序列的捕獲分子我們制備了定位于距離正義擴(kuò)增子鏈的游離的3'末端415bp的27個(gè)堿基的捕獲分子的互補(bǔ)捕獲部分靶定的585bp的葡萄球菌擴(kuò)增子。其構(gòu)型與圖1的捕獲分子la相似。如實(shí)施例2所述進(jìn)行擴(kuò)增、雜交和檢測(cè)。捕獲分子的捕獲部分如下<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>松鼠葡萄球菌(S.sciuri)GTTGTATTGTTCATGTTCTTTTTCTAA模仿葡萄球菌(S.siinulans)TTCTAAATTCTTTTGTTCAGCGTTCAA瓦氏葡萄球菌(S.warneri)AGTTAAGGTTTCTTTTTCATTATTGAG木糖葡萄球菌(S.xylosus)GCTTAACACCTCACGTTGAGCTTCCAA捕獲分子含有于5，末端固定于支持物上的40個(gè)堿基的間隔區(qū)部分(5，胺-GAATTCAAAGTTGC丁GAGAATAGTTCAATGGAAGGAAGCG-3，)(SEQIDNO:1)，及隨后的特異于來(lái)自不同葡萄球菌的各基因的捕獲部分。下表概括了捕獲分子的捕獲部分與擴(kuò)增子鏈的間隔區(qū)末端(3，末端)和非間隔區(qū)末端(5，末端)之間的距離。同時(shí)顯示了與圖1關(guān)聯(lián)的捕獲分子構(gòu)型。<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>用比色法進(jìn)行檢測(cè)。比色法檢測(cè)于室溫下使所述玻璃樣品與800nl用阻斷緩沖液(馬來(lái)酸緩沖液lOOmMpH7.5、NaCl150mM、Gloria奶粉0.1%)稀釋1000倍的膠態(tài)金標(biāo)記的鏈霉抗生物素溫浴45分鐘。在用洗滌緩沖液洗滌5次后，將金的存在用于使用染色顯示溶液(Eppendorf，漢堡，德國(guó))催化銀還原作用。使載波片與800nl的顯示混合物溫浴3次，IO分鐘，然后用水漂洗，干燥并用微陣列讀數(shù)儀分析。然后使用特定的定量軟件定量每個(gè)栽波片。結(jié)果顯示清楚地鑒定了15個(gè)葡萄球菌序列。實(shí)施例4:設(shè)計(jì)用于在微陣列上檢測(cè)同源MAGE-A序列的捕獲分子cDNA克隆MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE畫(huà)A5、A8、A9、AIO、All、MAGE-A6和A12的cDNA克隆得自Ludwig研究院的布魯塞爾分院。PCR擴(kuò)增使用如下共有引物對(duì)含有MAGE-A1、A2、A3、A4、A5、A6、A8、A9、A10、All或A12的cDNA的重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增。正義引物DPSCONS25'GGGCTCCAGCAGCCAAGAAGAGGA3'Tm=78°C，定位于每個(gè)MAGE-A基因的起始于ATC密碼子的位置234-321的核普酸，。為了提高一些MAGE的PCR效率，加入其他引物作為正義引物。DPSMAGE15'GGGTTCCAGCAGCCGTGAAGAGGA3，Tm=78。CDPSMAGE85'GGGTTCCAGCAGCAATGAAGAGGA3'Tm=740CDPSMAGE125'GGGCTCCAGCAACGAAGAACAGGA3'Tm=76。C反義引物DPASCONB45'CGGTACTCCAGGTAGTTTTCCTGC3'Tm=74°C,，定位于每個(gè)MAGE-A基因的起始于ATG密碼子的核苷酸位置734-838。根據(jù)MAGE序列，擴(kuò)增產(chǎn)物的大小約530bp。在含有2.5nL的cDNA、IXPCR緩沖液(75mmol/LTrispH9、50mmol/LKC1、20mmol/L(NH4)2S04、2.5mmol/LMgCl2)、200nmol/L每種dATP、dCTP、和dGTP、150nmol/LdTTP、50nmol/L生物素陽(yáng)16-dUTP(羅氏)、lnmol/L反義共有引物、0.25阿ol/L包括共有正義引物DPSCONS2(Eurogentec，Seraing，比利時(shí))的每種正義引物、0.625U的DNA聚合酶(Biotools，Madrid,西班牙)，和為防止前面留下的污染而加入的0.2U的尿嘧咬-DNAGlysosylase(羅氏)的25jiL反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增。用PTC-200熱循環(huán)儀(Biozym,Landgraaf，荷蘭)進(jìn)行循環(huán)。PCR反應(yīng)物加熱到95'C5分鐘，然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增(94°C30秒，55'C30秒，72'C30秒)，最后于72°C延伸10分鐘。微陣列裝配選擇以下27個(gè)核苷酸的捕獲部分用于特異捕獲MAGE序列。<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>a使用。/。GC方法，通過(guò)01igo-4軟件(NationalBiosciences,Inc.)計(jì)算。b相對(duì)每個(gè)MAGE-A基因的ATG密碼子給核苷酸編號(hào)。如實(shí)施例3中提供，捕獲分子含有40個(gè)堿基的間隔區(qū)部分。雜交將15nl完全PCR反應(yīng)物與55jil含有5nmol/L的生物素化的DNA對(duì)照的雜交溶液(AAT)混合，將所述混合物加載到雜交室(MJResearchInc.，Watertown,MA，USA)框定的陣列上。用蓋玻片蓋住所述室。于65'C溫浴所述載波片2小時(shí)，然后用洗滌緩沖液(AAT)洗滌4次，每次2分鐘。如實(shí)施例2所述進(jìn)行熒光檢測(cè)。下表概括了捕獲分子的捕獲部分與擴(kuò)增子鏈的間隔區(qū)末端(3，末端)和非間隔區(qū)末端(5，末端)的距離。同時(shí)顯示了與圖1關(guān)聯(lián)的捕獲分子的構(gòu)型。捕獲分子名稱把鏈與靶的間隔區(qū)末端的距離(核苷酸)與把的非間隔區(qū)末端的距離(核苷酸)圖l的捕獲分子構(gòu)型DTAS01(MAGE-A1)正義47132laDTAS02(MAGE-A2)正義47132laDTS0306(MAGE-A3)反以449543sDTAS04(MAGE-A4)正義44063laDTAS05(MAGE-A5)正義44162laDTS06(MAGE-A6)反以3361673sDTAS07(MAGE-A7)正義46538laDTAS08(MAGE-A8)正義46538laDTAS09(MAGE國(guó)A9)正義46538laDTAS10(MAGE-A10)正義45944laDTAS11(MAGE-A11)正義46142laDTAS12(MAGE-A12)正義45944除MJ(^-A6擴(kuò)增子稍交叉雜交至MAGE-A3捕獲部分上外，雜交是特異性的。所述交叉雜交的原因是由于這些序列享有96%的同一性。參考如上討論的一些實(shí)施方案描述了本發(fā)明。需知可對(duì)所述實(shí)施方案施以本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的各種修改或替代形式。只要不脫離本發(fā)明的精神和范圍，還可對(duì)本文所述結(jié)構(gòu)和技術(shù)作除上所述之外的諸多修改。因此，盡管描述了特定實(shí)施方案，但僅用于示例，非為限制本發(fā)明的范圍。3權(quán)利要求1.設(shè)計(jì)多核苷酸捕獲分子的方法，所述捕獲分子被用于檢測(cè)與之雜交的擴(kuò)增子，所述擴(kuò)增子的一條鏈作為待檢測(cè)和/或定量的靶，所述方法包括以下步驟a)選擇定義擴(kuò)增子的引物對(duì)；b)在擴(kuò)增子內(nèi)選擇10-100個(gè)核苷酸的特異序列，使所述特異序列定義擴(kuò)增子的兩個(gè)非互補(bǔ)末端；c)定義具有捕獲部分和間隔區(qū)部分的捕獲分子，所述捕獲部分與步驟b)中選擇的特異序列互補(bǔ)，所述間隔區(qū)部分含有至少20個(gè)核苷酸；d)在擴(kuò)增子的兩個(gè)非互補(bǔ)末端中分別鑒定出間隔區(qū)末端和非間隔區(qū)末端，使所述間隔區(qū)末端不與所述捕獲分子的所述間隔區(qū)部分互補(bǔ)，且所述間隔區(qū)末端比所述非間隔區(qū)末端多出至少50個(gè)堿基。2.制備多核苷酸捕獲分子的方法，所述捕獲分子被用于檢測(cè)與之雜交的擴(kuò)增子，所述擴(kuò)增子的一條鏈作為待檢測(cè)和/或定量的靶，所述方法包括以下步驟a)選擇定義擴(kuò)增子的引物對(duì)；b)在擴(kuò)增子內(nèi)選擇10-100個(gè)核苷酸的特異序列，使所述特異序列定義擴(kuò)增子的兩個(gè)非互補(bǔ)末端；c)定義具有捕獲部分和間隔區(qū)部分的捕獲分子，所述捕獲部分與步驟b)中選擇的特異序列互補(bǔ)，所述間隔區(qū)部分含有至少20個(gè)核苷酸；d)在擴(kuò)增子的兩個(gè)非互補(bǔ)末端中分別鑒定出間隔區(qū)末端和非間隔區(qū)末端，使所述間隔區(qū)末端不與所述捕獲分子的所述間隔區(qū)部分互補(bǔ)，且所述間隔區(qū)末端比所述非間隔區(qū)末端多出至少50個(gè)堿基。3.可通過(guò)權(quán)利要求2的方法得到的捕獲分子。4.檢測(cè)擴(kuò)增子的方法，包括使擴(kuò)增子與權(quán)利要求3的捕獲分子雜交的步驟。5.權(quán)利要求4的方法，其中所述捕獲分子被固定在固體支持物上，從而使間隔區(qū)部分定位于固體支持物與捕獲部分之間。6.權(quán)利要求5的方法，其中所述捕獲分子的5，末端被固定。7.權(quán)利要求5的方法，其中所述捕獲分子的3，末端被固定。8.權(quán)利要求5-7中任一項(xiàng)的方法，其中所述捕獲分子的間隔區(qū)部分的遠(yuǎn)端具有含有游離氨基的核苷酸。9.權(quán)利要求4-8中任一項(xiàng)的方法，其中所述擴(kuò)增子長(zhǎng)度至少為200bp，優(yōu)選至少為300bp、更優(yōu)選至少為400bp。10.權(quán)利要求4-9中任一項(xiàng)的方法，其中所述擴(kuò)增子長(zhǎng)度不超過(guò)2000bp。11.權(quán)利要求4-10中任一項(xiàng)的方法，其中所述間隔區(qū)部分是多核普酸鏈，長(zhǎng)度至少為40個(gè)核苷酸、優(yōu)選至少為卯個(gè)核苷酸。12.權(quán)利要求4-11中任一項(xiàng)的方法，其中所述捕獲分子包含間隔區(qū)，所述間隔區(qū)與如下序列具有至少60%同源性，優(yōu)選具有至少80%同源性，更優(yōu)選具有至少90%同源性，5'AAAGTTGAGTCCATTTGTGATGCTAGAAAAGTTGGAACTTTCTTGAACGTCTCCTATATGTCATACATGAATAGGTTGATTTTACTGTAC3，(SEQIDNO:2)(卯個(gè)堿基)。13.權(quán)利要求4-12中任一項(xiàng)的方法，其中所述捕獲分子包含間隔區(qū)，所述間隔區(qū)與如下序列具有至少60%同源性，優(yōu)選具有至少80%同源性，更優(yōu)選具有至少90%同源性，5'ATAAAAAAGTGGGTCTTAGAAATAAATTTCGAAGTGCAATAATTATTATTCACAACATTTCGATTTTTGCAACTACTTCAGTTCACTCCAAATTA3，(SEQIDNO:3)(95個(gè)堿基)。14.權(quán)利要求4-13中任一項(xiàng)的方法，其中所述捕獲部分含有10-100個(gè)核苷酸、優(yōu)選15-40個(gè)核苷酸，更優(yōu)選20-30個(gè)核普酸。15.權(quán)利要求5-14中任一項(xiàng)的方法，其中所述捕獲分子在支持物上的密度是20-2000fmoles/cm2。16.權(quán)利要求5-15中任一項(xiàng)的方法，其中所述捕獲分子以微陣列形式被固定在固體支持物的具體定位的區(qū)域中，其中所述微陣列為至少4個(gè)間隔區(qū)分子/cm2，優(yōu)選至少20個(gè)間隔區(qū)分子/cm2、更優(yōu)選至少100個(gè)間隔區(qū)分子/cm2。17.權(quán)利要求5-16中任一項(xiàng)的方法，其中所述固體支持物是珠形式。18.權(quán)利要求4-17中任一項(xiàng)的方法，其中用至少兩種捕獲分子檢測(cè)至少兩種擴(kuò)增子，其中所述至少兩種捕獲分子的所述捕獲部分相差至少10%、優(yōu)選至少20%。19.權(quán)利要求4-18中任一項(xiàng)的方法，其中所述捕獲部分能夠區(qū)分靶序列和與所述靶具有少少85%的同源性的其他序列。20.權(quán)利要求4-19中任一項(xiàng)的方法，包括使用共有引物對(duì)和捕獲分子，所述共有引物對(duì)能夠擴(kuò)增同源性大于60%、優(yōu)選大于卯％的至少兩種靶序列，所述捕獲分子能夠檢測(cè)兩種靶序列中的一種。21.權(quán)利要求4-20中任一項(xiàng)的方法，其中在所述擴(kuò)增子于溶液中的濃度小于10nM,優(yōu)選小于lnM，更優(yōu)選小于O.lnM及更加優(yōu)選小于O.OlnM時(shí)予以檢測(cè)。22.權(quán)利要求4-21中任一項(xiàng)的方法，其中隨著在系列PCR循環(huán)過(guò)程中產(chǎn)生所述擴(kuò)增子而實(shí)時(shí)予以檢測(cè)。23.在檢測(cè)擴(kuò)增子的方法中使用的試劑盒，所述試劑盒包含權(quán)利要求3的捕獲分子。24.權(quán)利要求23的試劑盒，還包含用于固定捕獲分子的固體支持物，預(yù)處理所述固體支持物以使其與捕獲分子的間隔區(qū)部分反應(yīng)。25.權(quán)利要求23的試劑盒，還包含固定有捕獲分子的固體支持物。26，權(quán)利要求23-25中任一項(xiàng)的試劑盒，還包含進(jìn)行擴(kuò)增子與捕獲分子的雜交所必要的工具。27.以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)的試劑盒，還包含用于進(jìn)行PCR的引物對(duì)和標(biāo)記工具。全文摘要本發(fā)明涉及設(shè)計(jì)和/或制備多核苷酸捕獲分子的方法，所述捕獲分子被用于檢測(cè)與之雜交的擴(kuò)增子，所述擴(kuò)增子的一條鏈作為待檢測(cè)和/或定量的靶，所述方法包括以下步驟a)選擇引物對(duì)定義擴(kuò)增子；b)在擴(kuò)增子內(nèi)選擇10-100個(gè)核苷酸的特異序列，使所述特異序列定義擴(kuò)增子的兩個(gè)非互補(bǔ)末端；c)定義具有捕獲部分和間隔區(qū)部分的捕獲分子，所述捕獲部分與步驟b)中選擇的特異序列互補(bǔ)，所述間隔區(qū)部分含有至少20個(gè)核苷酸；d)在擴(kuò)增子的兩個(gè)非互補(bǔ)末端中分別鑒定出間隔區(qū)末端和非間隔區(qū)末端，使所述間隔區(qū)末端不與所述捕獲分子的所述間隔區(qū)部分互補(bǔ)，且所述間隔區(qū)末端比所述非間隔區(qū)末端多出至少50個(gè)堿基。文檔編號(hào)B01J19/00GK101506377SQ200780025949公開(kāi)日2009年8月12日申請(qǐng)日期2007年5月15日優(yōu)先權(quán)日2006年5月17日發(fā)明者J·利馬科爾,S·海米爾斯申請(qǐng)人:埃佩多夫陣列技術(shù)股份有限公司