專利名稱：測定蘿芙木屬植物中利血平含量的高效液相色譜方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種色譜分析方法，具體要求保護的是一種測定蘿芙木屬植物中有效成分利血平(reserpine)含量的高效液相色譜方法。
背景技術：
利血平是從夾竹桃科蘿芙木屬(Rauvolfia)植物的根中提取的，具有降血壓作用的天然藥物，主要制劑有“利血平片”、“利血平注射液”、“復方降壓片”等，利血平的結構式如下 rserpine利血平由于結構復雜，化學合成成本高，利血平目前依靠從蘿芙木屬植物中提取，資源以云南蘿芙木R.yunnanensis、催吐蘿芙木R.vomitoria為主。由于多年采挖導致資源枯竭，人工種植正在興起。對蘿芙木中利血平的含量分析研究很少，有報道用紙色譜電泳或纖維素色譜分離利血平色帶后用分光光度法測定含量，操作煩瑣，誤差大。建立蘿芙木中利血平的先進分析方法，以準確掌握品種選育、栽培種植、提取加工等過程中有效成分利血平的變化，是蘿芙木產業(yè)開發(fā)的關鍵性技術。

發(fā)明內容
為準確測定并控制蘿芙木類原料中利血平的含量，本發(fā)明首次提供一種測定蘿芙木屬植物中利血平含量的高效液相色譜方法。通過以下技術方法實現(1)色譜柱以碳十八烷基鍵合硅膠為填充劑；(2)流動相為乙腈、甲醇、0.01％三乙胺水溶液組成的混合溶劑，其組成的體積比例為乙腈45％～35％、甲醇10％～25％、三乙胺水溶液45％～40％；(3)檢測波長268nm，柱溫40℃，流速1ml/min，進樣體積20ul。
1、色譜柱的選用考慮到應用的普遍性，選用HPLC測定最常用的碳十八烷基鍵合硅膠柱。比較了Phenomenex公司Luna C-18柱、Merck公司STARRP-18柱、Agilent公司XDB-C18柱、大連依利特公司C-18柱、江蘇漢邦公司C-18柱等，均有較好分離效果。
2、檢測波長確定取利血平標樣用甲醇、HPLC流動相溶解后測定紫外光譜(圖3、圖4)，具有一致的紫外吸收曲線，有三個主要吸收帶。其中218nm的吸收最大但接近末端吸收區(qū)域，292nm是肩峰，均不利于測定；268nm處的吸收大且吸收峰較平坦，故檢測波長選用268nm。
圖3是利血平標樣在HPLC流動相中的紫外吸收光譜圖。
圖4是利血平標樣在甲醇中的紫外吸收光譜圖。
3、流動相的選用利血平結構復雜，選擇適當的流動相以得到良好的分離效果是分析方法的關鍵。我們選擇甲醇-水、乙腈-水等流動相系統(tǒng)對比篩選，均無很好分離效果。根據峰型變化趨勢，將流動相調整為甲醇-乙腈-三乙胺水溶液混合溶劑，具有較好的分離效果，部分試驗結果見表3。
表3流動相對比篩選試驗的部分數據

結果表明，以乙腈、甲醇、0.01％三乙胺水溶液組成的混合溶劑最佳；此混合溶劑的組成體積比例在乙腈45％～35％、甲醇10％～25％、三乙胺水溶液45％～40％之間時，均有較好的分離效果，最佳流動相組成為乙腈-甲醇-0.01％三乙胺(45-10-45)。
4、其它測定條件按照一般經驗，流動相流速選用1ml/min；色譜柱溫度選用40℃；進樣體積20ul。
在上述研究確定的條件下，利血平吸收峰保留時間約21分鐘；蘿芙木樣品圖譜中各成分吸收峰可在40分鐘內全部流出色譜柱。利血平標樣吸收峰拖尾因子為1.05，理論塔板數大于10000，最低檢測限為0.8ng(S/N＝3)。蘿芙木藥材樣品測定圖譜中利血平吸收峰拖尾因子為1.04，理論塔板數大于8800，峰分離度大于1.5，符合HPLC測定方法要求。利血平標樣、蘿芙木藥材樣品的HPLC圖譜見附圖1、2。
四

圖1是本發(fā)明中利血平標樣的HPLC色譜圖。
圖2是本發(fā)明中蘿芙木藥材樣品的HPLC色譜圖。
五、方法學考查利血平標樣連續(xù)進樣6次，保留時間和峰面積RSD分別為0.99％、1.71％，精密度良好。利血平標樣用流動相溶解制成75ug/ml溶液，分別于0h、2h、4h、8h、24h、48h測定，峰面積RSD＝1.64％，說明利血平標樣溶液至少在48小時內是穩(wěn)定的，可用于含量測定。按照藥材樣品的提取方法制成供試品溶液，分別于0h、2h、4h、8h、24h、48h取樣測定，其峰面積RSD＝1.94％，說明蘿芙木藥材樣品溶液至少在48小時內是穩(wěn)定的，可用于含量測定。
精密稱取利血平標樣，用流動相溶解并定容至25ml棕色容量瓶中，制成0.16mg/ml的儲備液。分別精密吸取上述溶液0.05ml、0.5ml、1ml、2ml、5ml、7ml，流動相定容至10ml棕色容量瓶中，搖勻，按上述色譜條件分別進樣20μl測定。結果表明利血平進樣量在0.016μg～3.2μg范圍內與峰面積呈良好線性關系，縱軸截距和斜率之比為0.35％，標準曲線基本為通過原點的直線(表4)。
表4利血平進樣量和峰面積線性關系試驗數據

精密稱取同一份蘿芙木藥材粉末各2g，總共6份，按照實施例1項下的方法分別測定，利血平含量RSD＝2.47％(n＝6)，方法重現性良好。分別精確稱取已測定利血平含量的蘿芙木藥材約2g，共三組，每組3份，再分別加入相當于樣品含量約80％、100％、120％的利血平標樣，按照實施例1項下的方法測定利血平含量，并計算回收率，利血平的回收率在97.7％～99.4％之間，平均值為98.7％，RSD＝2.83％(n＝9)，測定的準確性良好，符合含量測定要求。
六、有益效果本發(fā)明的技術進步在于(1)經過系統(tǒng)的比較研究，首次建立了測定蘿芙木屬植物中利血平含量的高效液相色譜方法；(2)方法具有分離效果好，測定準確，靈敏高，專屬性強、分析簡便快速等技術特點；(3)分析快速，蘿芙木各成分吸收峰可在40分鐘內全部流出色譜柱；(4)該方法對準確掌握品種選育、栽培種植優(yōu)化、提取加工等過程中有效成分利血平的變化，有直接的應用價值。
七具體實施例方式
下面的具體實施例可進一步說明本發(fā)明，但并不構成對本發(fā)明權利要求所保護的范圍的限制。其工作原理和過程為蘿芙木的提取液注入高效液相色譜儀，由乙腈-甲醇-0.01％三乙胺組成的流動相載著利血平等成分進入色譜柱，以碳十八烷基鍵合硅膠為填充劑的色譜柱將利血平和其它化學成分分離，使它們依次到達紫外檢測器并被識別；檢測器測定蘿芙木樣品中利血平峰的響應值，分別對應其進量的多少，通過其響應值的大小和利血平標樣的比較來計算蘿芙木樣品中利血平的含量。
實施例1取蘿芙木藥材干燥后粉為粗粉，精密稱取約2g，置100ml圓底燒瓶中，準確加入甲醇50ml，稱重，水浴回流提取1小時，放冷，以甲醇補足減失的重量，過濾，續(xù)濾液經0.45um膜過濾，即為供試品溶液。
測定的條件選用Phenomenex公司Luna C-18柱；以乙腈-甲醇-0.01％三乙胺水溶液(45-10-45)為流動相，流速1ml/min；柱溫40℃；檢測波長268nm；進樣體積20ul。測定結果如表5。
表5不同產地的蘿芙木類研究樣品及測定結果

實施例2取樣品Y-3和Y-4按照實施例1制備供試品溶液。測定的條件改變流動相比例為乙腈-甲醇-0.01％三乙膠水溶液(35-25-40)，其余條件同實施例1。測定結果如表6。
表6不同產地的蘿芙木類研究樣品及測定結果

實施例3取樣品C-3和C-4按照實施例1制備供試品溶液。測定的條件改變流動相為乙腈-甲醇-0.01％三乙胺水溶液(40-20-40)，其余條件同實施例1。測定結果如表7。
表7不同產地的蘿芙木類研究樣品及測定結果

權利要求
1.一種測定蘿芙木屬植物中利血平含量的高效液相色譜方法，其特征在于(1)色譜柱以碳十八烷基鍵合硅膠為填充劑；(2)流動相為乙腈、甲醇、0.01％三乙胺水溶液組成的混合溶劑，其組成的體積比例為乙腈45％～35％、甲醇10％～25％、三乙胺水溶液45％～40％；(3)檢測波長268nm，柱溫40℃，流速1ml/min，進樣體積20ul。
全文摘要
一種測定蘿芙木屬植物中利血平(reserpine)含量的高效液相色譜方法，特征在于(1)色譜柱以碳十八烷基鍵合硅膠為填充劑；(2)流動相為乙腈、甲醇、0.01％三乙胺水溶液組成的混合溶劑，其組成的體積比例為乙腈45％～35％、甲醇10％～25％、三乙胺水溶液45％～40％；(3)檢測波長268nm，柱溫40℃，流速1ml/min，進樣體積20ul。本發(fā)明經過系統(tǒng)的比較研究，首次建立了測定蘿芙木屬植物中利血平含量的高效液相色譜方法，具有分離效果好，測定準確，靈敏高，專屬性強、分析簡便快速等技術特點，對準確掌握品種選育、栽培種植優(yōu)化、提取加工等過程中有效成分利血平的變化，有直接的應用價值。
文檔編號B01J20/281GK101071129SQ200610048619
公開日2007年11月14日 申請日期2006年8月15日 優(yōu)先權日2006年8月15日
發(fā)明者龔云麒, 張慧穎, 饒高雄, 蔡傳濤 申請人:饒高雄