專利名稱：用于治療高膽紅素血癥的免疫吸附材料的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物分離工程領(lǐng)域，特別涉及到發(fā)明了一種用于治療高膽紅素血癥的免疫吸附材料。
背景技術(shù)：
膽紅素是衰老紅細(xì)胞中血紅素的代謝產(chǎn)物。由于細(xì)胞的新陳代謝，正常人每天產(chǎn)生的膽紅素為每公斤體重3.9±0.7mg，血漿中膽紅素的濃度為2-9mg/L，其代謝的主要部位在肝臟，若肝臟代謝出現(xiàn)問(wèn)題，血液中則會(huì)產(chǎn)生膽紅素的累積，嚴(yán)重時(shí)血漿中膽紅素的濃度可達(dá)300-400mg/L，過(guò)量的膽紅素是一種內(nèi)源性毒素，它極易透過(guò)生物膜、透過(guò)血腦屏障與神經(jīng)核團(tuán)結(jié)合，干擾腦細(xì)胞的正常代謝及功能，它對(duì)大腦的毒副作用是不可逆的。膽道阻塞、急性及慢性黃疸性肝炎、中毒性肝炎、各種溶血性肝炎等都會(huì)導(dǎo)致肝臟對(duì)膽紅素的代謝紊亂，從而導(dǎo)致病患者體內(nèi)膽紅素的積累，產(chǎn)生高膽紅素血癥，致使患者生理失調(diào)，嚴(yán)重時(shí)危及生命。目前，急性肝功能衰竭導(dǎo)致的死亡率高達(dá)80％，死亡的主要原因是肝功能衰竭導(dǎo)致大量的毒素累積，主要是膽紅素、膽汁酸等，致使腦細(xì)胞中毒死亡。如果能夠及時(shí)除去血液中的過(guò)量膽紅素和膽汁酸，將極大的緩解病癥，維持肝衰病人存活。由于肝細(xì)胞具有很強(qiáng)的再生能力，病情的緩解將使肝組織得到一定的修復(fù)，同時(shí)也給肝臟移植創(chuàng)造了可能，對(duì)挽救病人的生命具有重大的意義。
血液凈化是近20年來(lái)出現(xiàn)的新的臨床治療方法，主要是通過(guò)清除存在于血液中的致病物質(zhì)實(shí)現(xiàn)治療某些疑難病癥的目的。其實(shí)質(zhì)是生物分離技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。近些年來(lái)對(duì)肝衰病人采用的主要治療方法是血漿置換，即通過(guò)丟棄掉部分的病人血漿，補(bǔ)充相當(dāng)量的健康人血漿來(lái)緩解病情，但這種方法存在如下缺點(diǎn)1)有害物質(zhì)在病人血液中仍然有大量的存留；2)異體血漿的輸入會(huì)使病人產(chǎn)生一定的免疫反應(yīng)并增加了傳染疾病的可能。伴隨生物分離技術(shù)的進(jìn)步，血液凈化技術(shù)也不斷得到發(fā)展。免疫吸附療法是血液凈化的重要分支，是近年來(lái)興起的一種治療疑難病癥的新方法，其特征是通過(guò)在體外建立的人體血液循環(huán)支路使血液通過(guò)免疫吸附柱吸附除去患者血液中的致病物質(zhì)，凈化人體內(nèi)環(huán)境，達(dá)到治療疾病的目的。免疫吸附柱中含有的免疫吸附材料可與血液中的致病物質(zhì)特異結(jié)合，而對(duì)血液中的其它成分無(wú)損害。目前，日本等國(guó)已研制出可特異吸附膽紅素的樹(shù)脂型吸附劑，雖然吸附效果較好，但存在價(jià)格較高，吸附時(shí)間較長(zhǎng)(8-12個(gè)小時(shí))，不能重復(fù)使用等缺點(diǎn)。對(duì)于血液中膽紅素含量較高的病人，由于膽紅素吸附柱的吸附容量一定，當(dāng)吸附劑吸附飽和后，血液中的膽紅素雖然有一定的降低，但仍維持在較高的水平，需要再換用一新的吸附柱，這無(wú)疑增加了患者的治療費(fèi)用和時(shí)間。如果研制出可重復(fù)使用的免疫吸附柱，則可以采用雙柱切換系統(tǒng)根據(jù)病人血漿中的膽紅素濃度確定免疫吸附柱的重復(fù)使用次數(shù)，以達(dá)到最大量地移走病人體內(nèi)膽紅素、增強(qiáng)治療效果的目的，同時(shí)也能降低治療成本，減少治療時(shí)間。問(wèn)題的關(guān)鍵在于新型免疫吸附劑的合成。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是設(shè)計(jì)、合成一種無(wú)毒、無(wú)害、吸附膽紅素效果好、成本底并且可重復(fù)使用的多糖型吸附劑取代目前的樹(shù)脂型吸附劑。通過(guò)選擇無(wú)毒無(wú)害的瓊脂糖凝膠等多糖類材料為載體，以可與膽紅素特異結(jié)合的人血清白蛋白(HSA)為功能化分子，使用二羰基咪唑作為活化試劑以增加材料表面固定化HSA的密度，通過(guò)改善HSA與膽紅素結(jié)合的微環(huán)境，提高材料的穩(wěn)定性和吸附性能，從而使膽紅素免疫吸附材料具有良好的血液相容性、較高的吸附容量、良好的再生性能，以減少臨床應(yīng)用的時(shí)間、費(fèi)用，提高臨床療效本發(fā)明的技術(shù)方案是選擇與人血液相容性好的多糖類材料為載體。此材料是從天然的植物中提取出來(lái)的一種高純度的多糖類物質(zhì)，含有大量的親水性羥基，羥基在通常情況下是惰性的，不具有吸附性，所以血液相容性較好。這里我們選用可與膽紅素發(fā)生特異性作用的人血清白蛋白(HSA)為功能化分子。HSA是人體內(nèi)重要的輸運(yùn)蛋白，HSA分子中含有一個(gè)膽紅素高親和力結(jié)合部位(或稱第一結(jié)合部位)和1-2個(gè)低親和力結(jié)合部位(或稱第二結(jié)合部位)。在通常情況下，血液中的膽紅素是以與HSA相結(jié)合的形式存在的。在理論上，以HSA為功能化分子應(yīng)該只結(jié)合游離膽紅素，而對(duì)與HSA結(jié)合的膽紅素吸附甚微。但在固定化HSA過(guò)程中，可以通過(guò)化學(xué)試劑使鍵合到多糖材料表面的HSA分子構(gòu)型發(fā)生部分改變以提高對(duì)血液中與HSA結(jié)合膽紅素分子的競(jìng)爭(zhēng)吸附能力。在固定化HSA的工藝上，選用N，N′-二羰基咪唑作為活化多糖類材料的試劑。N，N′-二羰基咪唑是一個(gè)具有很高反應(yīng)活性的試劑，可與多糖類材料上大量存在的羥基快速反應(yīng)，提高材料表面固定化HSA的密度?？紤]到微環(huán)境對(duì)HSA活性的影響，在多糖載體和HSA之間加入14個(gè)原子長(zhǎng)度的間隔臂分子以增強(qiáng)吸附材料對(duì)膽紅素的吸附效果。
本發(fā)明的顯著優(yōu)勢(shì)和效果是
1)選用來(lái)自天然的多糖類物質(zhì)為載體，與人工合成的樹(shù)脂相比，具有非特異吸附小，血液相容性好等優(yōu)點(diǎn)，增加了膽紅素免疫吸附材料的安全性和可靠性。
2)選用HSA作為功能化分子實(shí)現(xiàn)對(duì)血液中膽紅素的吸附作用。由于采用的是生物分子中特異性相互作用的原理，所以固定在材料上的HSA對(duì)血漿中的膽紅素吸附速度快(0.5小時(shí)就可吸附飽和，比樹(shù)脂型吸附材料速度快16倍)、選擇性高(主要吸附膽紅素和膽汁酸)，吸附效果好。吸附上的膽紅素在特定條件下可洗脫下來(lái)，使膽紅素免疫吸附材料可重復(fù)使用，在臨床治療中可采用雙柱切換的方式，顯著增強(qiáng)了治療效果。
本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)和效果在臨床治療上將表現(xiàn)為降低病人的治療費(fèi)用、減少治療的時(shí)間，提高治療的效果，同時(shí)也增加整個(gè)治療的安全性和可靠性具體實(shí)施方式
以下詳述本發(fā)明的最佳實(shí)施例實(shí)施例1含有咪唑氨基甲酸鹽的活性多糖類材料的合成在裝有攪拌器、冷凝器的5L三口燒瓶中，加入多糖類材料1升，加入分析純丙酮試劑，使固體的含量保持在30-50％的比例，攪拌均勻，加入50-100克/升的N，N′-二羰基咪唑，在室溫下攪拌活化1小時(shí)。結(jié)束反應(yīng)，將凝膠過(guò)濾，用3-5倍體積的溶劑沖洗以移走活化過(guò)程中產(chǎn)生的咪唑，過(guò)濾，將活化好的介質(zhì)置于丙酮中，儲(chǔ)存4℃?zhèn)溆?。用這種方法活化的材料每毫升至少含有100μmol的咪唑氨基甲酸鹽活性基團(tuán)用來(lái)鍵合其它分子。
實(shí)施例2帶有二氨基二丙基(DAPDA)的多糖類材料的合成在裝有攪拌器、冷凝器的5L三口燒瓶中，加入帶有咪唑氨基甲酸鹽的多糖類材料1升，將200克的二氨基二丙基溶于1000毫升的丙酮中，然后加入到三口燒瓶中。在室溫下攪拌反應(yīng)3小時(shí)。用丙酮沖洗凝膠移走未反應(yīng)的二氨基二丙基，濾干備用。
實(shí)施例3帶有醛基活性基團(tuán)的多糖類材料的合成在裝有攪拌器、溫度計(jì)及冷凝器的5L三口燒瓶中，加入帶有活性氨基的多糖類材料1L，加入戊二醛10～40ml，用硼酸鹽或磷酸鹽作緩沖液，加入緩沖液1.0～1.5L，pH值控制在7.0～9.0范圍內(nèi)，30～40℃攪拌反應(yīng)2小時(shí)，反應(yīng)停止后，用大量的水洗去戊二醛殘余液，濾干備用。
實(shí)施例4醛基多糖類材料與HSA直接反應(yīng)合成膽紅素免疫吸附材料在裝有攪拌器、溫度計(jì)及冷凝器的5L三口燒瓶中，加醛基多糖類材料1L，加入0.1mol/L的磷酸或硼酸緩沖液1.0～1.5L，pH值控制在7.0～8.5范圍內(nèi)，加入4～6g HSA，在25℃恒溫反應(yīng)16～20小時(shí)，停止反應(yīng)，回收未反應(yīng)的HSA，用0.1-0.2mol/L的羥基甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸乙酯鹽酸鹽和乙醇氨其中的一種試劑封閉未反應(yīng)活性基團(tuán)，用硼氫化鈉或氰基硼氫化鈉還原反應(yīng)中產(chǎn)生的雙鍵，在室溫下反應(yīng)15-20小時(shí)。用水沖洗干凈未反應(yīng)組分，保存在0.1mol/L、pH＝7.4的磷酸緩沖液中，加入0.02～0.1％的硫柳汞作防腐劑。用紫外法檢測(cè)HSA的鍵合量為8.0-10.0mg/ml材料，吸附膽紅素量為4.25μmol/ml材料，采用的洗脫劑為含有1M NaCl、0.02％的吐溫-80、pH＝7.5的0.05M磷酸緩沖液。每次再生后的膽紅素免疫吸附材料吸附能力下降約2.1％。
由于免疫吸附柱最終目的是進(jìn)行臨床實(shí)驗(yàn)，要求無(wú)菌、無(wú)熱源，所以整個(gè)實(shí)驗(yàn)應(yīng)在無(wú)菌無(wú)熱源條件下進(jìn)行。
實(shí)施例5膽紅素免疫吸附柱的離體實(shí)驗(yàn)將按上述方法制備的膽紅素免疫吸附材料5ml(HSA的鍵合量為50mg)裝于Φ10×100mm的層析柱中，用生理鹽水充分沖洗柱子，將110ml患高膽紅素血癥病人的血漿過(guò)柱循環(huán)30分鐘，分析過(guò)柱前后血液中主要成分的變化，得到如下的結(jié)果

以上結(jié)果證實(shí)，膽紅素免疫吸附劑對(duì)直接膽紅素、間接膽紅素及膽汁酸、膽堿脂酶都有很強(qiáng)的吸附能力，對(duì)血漿中的其它成分吸附很少，說(shuō)明此吸附劑的選擇性較好。免疫吸附劑在30分鐘內(nèi)達(dá)到其最大吸附量，說(shuō)明對(duì)膽紅素的吸附速度較快。
實(shí)施例6膽紅素免疫吸附材料的再生性能將按上述方法制備的膽紅素免疫吸附材料5ml(HSA的鍵合量為50mg)裝于Φ10×100mm的層析柱中，用生理鹽水充分沖洗柱子，將110ml患高膽紅素血癥病人的血漿過(guò)柱循環(huán)30分鐘，用含有1M NaCl、0.02％的吐溫-80、pH＝7.5的0.05M磷酸緩沖液作為洗脫劑將吸附在免疫吸附劑上的膽紅素等物質(zhì)洗脫下來(lái)，洗脫的整個(gè)過(guò)程大概需要20-30分鐘。洗脫完畢后，用生理鹽水將柱中的洗脫劑置換出來(lái)，再將110ml患高膽紅素血癥病人的血漿過(guò)柱循環(huán)30分鐘。重復(fù)以上操作6次，每次都分析過(guò)柱前后血漿中的主要成分，確定對(duì)總膽紅素的吸附容量。得到如下表的結(jié)果膽紅素吸附劑再生次數(shù)與吸附容量之間的關(guān)系

以上結(jié)果說(shuō)明，每次吸附劑再生，其對(duì)總膽紅素的吸附容量都約有2.1％的下降，使用20次后其吸附容量?jī)H為最初的一半。一個(gè)體重70公斤，血漿內(nèi)膽紅素濃度700μmol/L的高膽紅素血癥患者，若使用每個(gè)吸附柱含有70ml吸附材料的雙柱系統(tǒng)進(jìn)行治療，每柱只需重復(fù)使用4次就可將病人血漿中膽紅素的濃度降到30μmol/L以下，接近正常值，整個(gè)治療時(shí)間需要4個(gè)小時(shí)左右?？梢?jiàn)，免疫吸附材料的再生效果完全滿足治療要求。
權(quán)利要求
1.一種用于治療高膽紅素血癥的免疫吸附材料，以來(lái)自天然的多糖類材料為載體，以人血清白蛋白為功能化分子，采用N，N′二羰基咪唑作為活化試劑活化載體，將人血清白蛋白以共價(jià)鍵的方式固定在載體表面，從而合成一種對(duì)膽紅素具有較高吸附能力并能夠反復(fù)使用的膽紅素免疫吸附材料，其特征在于a)作為載體的多糖類材料包括瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠、纖維素、殼聚糖；b)吸附血漿中膽紅素的功能化分子是人血清白蛋白；c)用N，N′二羰基咪唑活化載體，用二氨基二丙基和戊二醛作為連接載體和人血清白蛋白的間隔臂分子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于治療高膽紅素血癥的免疫吸附材料，其特征還在于吸附劑再生采用的洗脫劑為含有1M NaCl、0.02％的吐溫-80pH＝7.5的0.05M磷酸緩沖液。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物分離工程領(lǐng)域,涉及到發(fā)明了一種可治療高膽紅素血癥的免疫吸附材料。其特征為:選用來(lái)自天然的多糖類材料為載體,以人血清白蛋白為功能化分子,采用N,N'二羰基咪唑作為活化試劑活化載體,用二氨基二丙基和戊二醛作為連接載體和人血清白蛋白的間隔臂分子合成了膽紅素免疫吸附材料。該吸附材料的優(yōu)點(diǎn)是:克服了現(xiàn)存樹(shù)脂型膽紅素吸附材料價(jià)格高、治療時(shí)間長(zhǎng)、不能重復(fù)使用的缺點(diǎn),可快速、高選擇性地從病人血漿中去除膽紅素和膽汁酸,吸附量大,血液相容性好,同時(shí)可減少治療時(shí)間,降低治療費(fèi)用,提高了治療過(guò)程的安全性和可靠性。
文檔編號(hào)B01J20/22GK1338330SQ0112819
公開(kāi)日2002年3月6日 申請(qǐng)日期2001年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月21日
發(fā)明者賈凌云 申請(qǐng)人:大連理工大學(xué)