專利名稱：一株高鹽生物脫氮的小短桿菌菌株及在廢水處理中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物脫氮領(lǐng)域，特別涉及一種用于高鹽生物脫氮的小短桿菌菌株(Brachybacterium)及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著社會的進(jìn)步和經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，我國各類水體富營養(yǎng)化污染日益嚴(yán)重，藍(lán)藻赤潮問題頻發(fā)，對水體安全和人體健康造成了巨大的損害。氮、磷等營養(yǎng)物質(zhì)過剩是引發(fā)水體富營養(yǎng)化的根本原因，一般認(rèn)為當(dāng)水體中N濃度>0. 2mg/l、P濃度>0. 02mg/l時就可能出現(xiàn)富營養(yǎng)化現(xiàn)象。生活污水是氮、磷等營養(yǎng)物質(zhì)的最大排放源；為此，我國一直致力于開發(fā)各種各樣的生活污水脫氮除磷工藝以從根本上防止富營養(yǎng)化問題的發(fā)生。生物脫氮技術(shù)是目前應(yīng)用最廣的污水脫氮技術(shù)，基本原理是在微生物的作用下將污水中的有機(jī)氮和氨態(tài)氮轉(zhuǎn)化為N2的過程。其中包括硝化和反硝化兩個反應(yīng)過程。硝化反應(yīng)是由一群自養(yǎng)好氧微生物完成的，它分為兩個階段，分別由亞硝酸菌和硝酸菌兩種菌完成。第一步是由亞硝酸菌將NH4+氧化為N02_，第二步是由硝酸菌將N02_進(jìn)一步氧化為N03_。反硝化反應(yīng)是由一群異養(yǎng)型兼性厭氧微生物完成的，是指在無氧或低氧條件下，反硝化細(xì)菌將N02_和N03_還原為氮氣的過程。由上述基本原理可以看出，生物脫氮過程本身就存在著矛盾硝化反應(yīng)需要較長的污泥齡和好氧條件，大量有機(jī)物存在時會造成硝化細(xì)菌的流失；而反硝化細(xì)菌則需要較短的污泥齡和缺氧條件，高度依賴有機(jī)物為其脫氮過程提供電子供體。因硝化細(xì)菌和反硝化細(xì)菌生理機(jī)制的差異導(dǎo)致了基于該理論的污水脫氮技術(shù)工藝冗長，能耗大，占地面積大，且對環(huán)境變化非常敏感，尤其在高鹽條件下脫氮效率不佳。高鹽度對常規(guī)生物處理系統(tǒng)中微生物的正常代謝會產(chǎn)生不利的影響，主要包括滲透壓偏高，微生物細(xì)胞質(zhì)壁分離，使生長受到阻礙甚至死亡；微生物代謝酶活性受阻；水體密度增加，影響污泥沉降效果等。這些原因會導(dǎo)致微生物對污染物的去除率明顯降低，出水難以達(dá)標(biāo)。近些年來，有研究者通過選擇培養(yǎng)馴化出耐高鹽的菌種，以及從自然界高鹽環(huán)境中分離出耐鹽菌和嗜鹽菌，將其應(yīng)用于高鹽廢水處理，取得了一定處理效果。但就現(xiàn)有研究來看，高鹽廢水中的生物脫氮效果并不十分理想。本申請的發(fā)明人分離出一株小短桿菌(Brachybacterium),發(fā)現(xiàn)其能夠耐高鹽并且兼具異養(yǎng)硝化-好氧反硝化的能力；利用這類具有特殊性質(zhì)的細(xì)菌的生理特性和代謝機(jī)理，基于硝化過程可以是異養(yǎng)細(xì)菌的生理行為，而反硝化過程可以在好氧條件下進(jìn)行，使得可在高鹽條件的同一好氧環(huán)境下完成脫氮過程，能夠較好克服傳統(tǒng)生物處理過程中存在的矛盾。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種高鹽生物脫氮的小短桿菌菌株及其在高鹽廢水處理 中的應(yīng)用。
本發(fā)明提供的小短桿菌(Brachybacterium)菌株已于2012年3月29日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏號為CGMCC No. 5947。本發(fā)明所提供的菌 株，具有以下表型特征在25_35°C下，營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)16-32h后，菌落表面光滑，淺黃色；通過革蘭氏染色后在顯微鏡下呈陽性，菌體呈短桿狀，大小為(0.6-1. 2) UmX (I. 5-6.0) Pm,菌落較小,扁平。該菌株的16S rRNA基因序列特征其16S rRNA具有如序列表中序列I所示的核苷酸序列，序列長度為1360bp。根據(jù)其形態(tài)特征和生理生化特征及其16S rRNA基因序列在Genbank中的檢索結(jié)果，鑒定該菌株為小短桿菌(Brachybacterium)。根據(jù)該菌株耐鹽性能實驗結(jié)果,小短桿菌(Brachybacterium)耐鹽范圍(以 NaCl 計)為 1%_13%。本發(fā)明所提供的小短桿菌(Brachybacterium)能夠在高鹽條件下，以有機(jī)物為電子受體，NH4+為電子供體，將NH4+氧化為NOf或NO3-;能夠在好氧的條件下，以有機(jī)物為電子供體，NO2-或N03_為電子受體，將其還原為氮氣，實現(xiàn)在高鹽條件下脫氮的目的。所述廢水的鹽度(以NaCl計)范圍為1%_13%，優(yōu)選為3%_10%。所述廢水的接種量可為5-15%，優(yōu)選為10%。所述廢水的碳氮比可為3. 7-9，優(yōu)選為9。所述廢水的溫度可為20_40°C，優(yōu)選為20_30°C，更優(yōu)選為30°C。所述廢水的pH可為6. 5-8. 0，優(yōu)選為6. 5-7. 5，更優(yōu)選為6. 5-7. O。本發(fā)明的小短桿菌(Brachybacterium)及其應(yīng)用與現(xiàn)有技術(shù)相比較有如下有益效果(I)本發(fā)明的小短桿菌(Brachybacterium)菌株對高鹽的耐受力強(qiáng),能夠在高鹽、好氧條件下以氨氮為唯一氮源生長，并進(jìn)行異養(yǎng)硝化-好氧反硝化作用，利用該菌株的這種特性，可以將其直接接種于高鹽含氮廢水，只需要通過好氧階段即可實現(xiàn)總氮的快速去除。該菌株的應(yīng)用可以解決高鹽條件下微生物代謝受阻，硝化反應(yīng)難以進(jìn)行的問題；另外，不需設(shè)置缺氧反硝化段即可實現(xiàn)總氮的有效去除，簡化了工藝流程，節(jié)約了基建和運行費用，具有巨大的經(jīng)濟(jì)效益和環(huán)境效益。(2)本發(fā)明的小短桿菌(Brachybacterium)菌株適用于高鹽度廢水的脫氮處理,應(yīng)用前景廣闊，具有很好的社會效益。(3)本發(fā)明的小短桿菌(Brachybacterium)菌株在30°C下接種到初始氨氮濃度為40mg/L、鹽度(以NaCl計)為3%的廢水中，可以利用葡萄糖為唯一碳源,氨氮為唯一氮源進(jìn)行新陳代謝。經(jīng)過36h，氨氮的去除率達(dá)到94. 75%，且無硝氮與亞硝氮的明顯積累。(4)本發(fā)明的小短桿菌(Brachybacterium)菌株生長鹽度((以NaCl計)范圍為1-13%，在鹽度為3-10%的范圍內(nèi)均能夠生長良好并高效脫氮。(5)本發(fā)明的小短桿菌(Brachybacterium)菌株在接種量較大約為10%時,脫氮性能較好。但即使在接種量較小約為5%時，仍能高效去除廢水中的氮素，處理效果并不隨接種量的降低而明顯下降，這種特性也使得菌種在實際應(yīng)用中經(jīng)濟(jì)可行。下面結(jié)合具體實施方式
對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解，實施例僅僅是舉例說明的目的，本發(fā)明的范圍并不以具體實施方法為限，而是由權(quán)利要求的范圍加以限定。


圖I為小短桿菌(Brachybacterium)菌株的顯微鏡照片圖2為小短桿菌(Brachybacterium)菌株在鹽度(以NaCl計)為5%下對氨氮的降解曲線圖3為小短桿菌(Brachybacterium)菌株在鹽度(以NaCl計)為5%下對磷酸鹽的降解曲線圖4為小短桿菌(Brachybacterium)菌株在不同鹽度下對氨氮的降解曲線圖5為小短桿菌(Brachybacterium)菌株在不同接種量時對氨氮的降解曲線圖6為小短桿菌(Brachybacterium)菌株在不同溫度條件下的氨氮降解曲線 圖7為小短桿菌(Brachybacterium)菌株在不同pH條件下的氨氮降解曲線圖8為小短桿菌(Brachybacterium)菌株在不同C/N條件下的氨氮降解曲線
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不限于一下實施例。下述實施例中，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中，所述百分含量如無特殊說明，均為質(zhì)量百分含量。實施例中各種污染物的監(jiān)測分析方法參考《水和廢水監(jiān)測分析方法》(第四版，中國環(huán)境科學(xué)出版社，2002)。溫度和溶解氧通過便攜式溶氧測定儀(YSI550A，USA)進(jìn)行測定。污泥濃度(MLSS)和揮發(fā)性懸浮固體濃度(MLVSS)根據(jù)重量法測定。實施例中使用的各種單位，統(tǒng)一采用國家標(biāo)準(zhǔn)。實施例I.具有高鹽異養(yǎng)硝化-好氧反硝化性能的小短桿菌(Brachybacterium)菌株的篩選具體步驟如下I)將ImL鹽水樣(采集自天津漢沽鹽場曬鹽池)置于盛IOOmL液體培養(yǎng)基(每L含酵母浸膏5g，胰蛋白胨10g, NaCl :3%-10%，pH :7. 0-7. 5，121。。20min 蒸汽滅菌)的 250mL三角瓶中，30°C 150r/min搖床培養(yǎng)5天，富集菌體；2)采用倍比稀釋法將富集菌體后的鹽水樣稀釋成10_\10_2、……10_6各個梯度的菌懸液，取稀釋度為10_4、10_5、10_6的菌懸液各0. 1ml，均勻涂布于預(yù)先制備好的高鹽固體培養(yǎng)基(每L含酵母浸膏5g，胰蛋白胨10g，NaCl :3%-10%，瓊脂16_18g，pH7. 0-7. 5，121。。20min蒸汽滅菌)IOml的固體平板上；3)將平板置于培養(yǎng)箱中30°C恒溫培養(yǎng)直至單菌落的形成。選取適當(dāng)梯度的平板進(jìn)行觀察，對各個菌落的形態(tài)特征進(jìn)行詳細(xì)對比以識別出各個不同的單菌落；4)挑取單菌落反復(fù)進(jìn)行平板劃線，直到確保平板上的單菌落形態(tài)一致，取單菌落接于高鹽固體培養(yǎng)基斜面上保藏；5)考察各個菌株對高鹽度的耐受能力；6)測定各個菌株在鹽度(以NaCl計)分別為1%、3%、5%、8%、10%和13%時的脫氮性倉泛;7)由此分離出一株對高鹽耐受能力強(qiáng)并且具有異樣硝化-好氧反硝化能力的細(xì)菌——小短桿菌株，并于2012年3月29日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏號為CGMCC No. 5947。實施例2.菌株在鹽度為5%的脫氮實驗以葡萄糖為碳源，氨氮為氮源，實施例I中所述小短桿菌(Brachybacterium)菌株對氨氮的去除能力測定。具體實施步驟如下將小短桿菌(Brachybacterium)菌株接種于IOOml的鹽度(以NaCl計)為5%的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中(每升含0.94g葡萄糖，0. 153g NH4Cl,0.035g KH2PO4,0. IgMgSO4 *7H20,0. 006gFeSO4 7H20, pH 7. 0 7. 5)，于30°C 150rpm的搖床中振蕩培養(yǎng)。未接種菌懸液的培養(yǎng)基進(jìn)行同等條件下的實驗作為空白對照。于611、1211、1811、2411、3611和4811取少量反應(yīng)液，其中一部分直接用于測定菌體光密度，其余部分在SOOOrpm下離心lOmin，取上清液測定各種含氮化合物的濃度。 結(jié)果如圖2、3所示,小短桿菌(Brachybacterium)菌株在高鹽條件下生長良好,且對氨氮有較強(qiáng)降解能力。在48h反應(yīng)時間內(nèi)，菌株在36h時氨氮的去除率達(dá)到最大,氨氮濃度值從最初的40mg/L下降至2. 10mg/L。此外,在整個降解過程中，硝氮和亞硝氮的濃度無明顯積累，廢水中大部分的氨氮通過異養(yǎng)硝化-好氧反硝化作用直接轉(zhuǎn)化為氣體產(chǎn)物。因此，該菌株在高鹽條件下僅經(jīng)過好氧階段就有效實現(xiàn)了氮素的徹底去除。實施例3.菌株在不同鹽度條件下的脫氮實驗以葡萄糖為碳源，氨氮為氮源，實施例中所述小短桿菌(Brachybacterium)菌株在不同鹽度下對氨氮的去除能力測定。具體實施步驟如下將小短桿菌(Brachybacterium)菌株接種于鹽度(以NaCl計)分別為1%、3%、5%、8%、10%和13%的IOOml無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，于30°C 150rpm的搖床中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。待菌株生長至對數(shù)生長期后期時，取IOml菌液接入新鮮的鹽度(以NaCl計)分別為1%、3%、5%、8%、10%和13%的90ml無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，于30°C 150rpm的搖床中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)。未接種菌懸液的培養(yǎng)基進(jìn)行同等條件下的實驗作為空白對照。于611、1211、1811、2411、3611和48h取少量反應(yīng)液，其中一部分直接用于測定菌體光密度，其余部分在8000rpm下離心IOmin,取上清液測定各種含氮化合物的濃度。結(jié)果如圖4所示，該菌株在鹽度(以NaCl計)分別為3%、5%、8%、10%時，均可以有效去除氨氮，在鹽度為1%和13%時，菌株對氨氮的去除效果不理想。其中在鹽度為5%時的脫氮性能最好，去除速率也較快，氨氮的最大去除率達(dá)到94. 75%。而在一般認(rèn)為當(dāng)廢水中含鹽量超過20g/L時，用普通的淡水微生物無法進(jìn)行處理。由此可見，該菌株為對高鹽有良好耐受能力的耐鹽菌，其能夠在高鹽條件下有效實現(xiàn)生物脫氮。整個反應(yīng)過程中沒有硝酸鹽氮的累積，只有微量的亞硝酸鹽氮出現(xiàn)。實施例4.菌株在不同接種量時的脫氮實驗將小短桿菌(Brachybacterium)菌株接種于IOOml的鹽度(以NaCl計)為5%無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，于30°C 150rpm的搖床中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。待菌株生長至對數(shù)生長期后期時，分別取5ml、10ml、15ml菌液接入95ml、90ml、85ml的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，于30°C 150rpm的搖床中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)。未接種菌懸液的培養(yǎng)基進(jìn)行同等條件下的實驗作為空白對照。于6h、12h、18h、24h、36h和48h取少量反應(yīng)液，其中一部分直接用于測定菌體光密度，其余部分在8000rpm下離心lOmin，取上清液測定各種含氮化合物的濃度。由圖5可見,小短桿菌(Brachybacterium)菌株在接種量較大約為10%時,脫氮性能較好。但即使在接種量較小約為5%時，仍能高效去除廢水中的氨氮，處理效果并不隨接種量的降低而明顯下降。該特性無疑使得菌株易于實際應(yīng)用。整個反應(yīng)過程中沒有硝酸鹽氮的累積，只有微量的亞硝酸鹽氮出現(xiàn)。實施例5.菌株在不同溫度條件下的脫氮實驗將小短桿菌(Brachybacterium)菌株接種于IOOml的鹽度(以NaCl計)為5%無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，于30°C 150rpm的搖床中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。待 菌株生長至對數(shù)生長期后期時，取IOml菌液接入新鮮的90ml無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，控制其培養(yǎng)溫度分別為20°C、30°C和40°C，于150rpm的搖床中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)。未接種菌懸液的培養(yǎng)基進(jìn)行同等條件下的實驗作為空白對照。于6h、12h、18h、24h、36h和48h取少量反應(yīng)液，其中一部分直接用于測定菌體光密度，其余部分在8000rpm下離心IOmin,取上清液測定各種含氮化合物的濃度。由圖6可見,小短桿菌(Brachybacterium)菌株在溫度為30°C效果最好,不同溫度下其脫氮性能相差較小，使得該菌種具備較寬的溫度適應(yīng)范圍。整個反應(yīng)過程中沒有硝酸鹽氮的累積，只有微量的亞硝酸鹽氮出現(xiàn)。實施例6.菌株在不同pH條件下脫氮實驗將小短桿菌(Brachybacterium)菌株接種于IOOml的鹽度(以NaCl計)為5%無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，于30°C 150rpm的搖床中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。待菌株生長至對數(shù)生長期后期時，取IOml菌液接入新鮮的IOOml無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH分別為6. 5-7. 0,7. 0-7. 5和7. 5-8. 0的范圍內(nèi)，于30°C 150rpm的搖床中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)。未接種菌懸液的培養(yǎng)基進(jìn)行同等條件下的實驗作為空白對照。于6h、12h、18h、24h、36h和48h取少量反應(yīng)液，其中一部分直接用于測定菌體光密度，其余部分在SOOOrpm下離心lOmin，取上清液測定各種含氮化合物的濃度。由圖7可見,小短桿菌(Brachybacterium)菌株在不同pH條件下脫氮性能相差較大，48h脫氮率分別為88. 7%,56. 4%和34. 7%，在pH為6. 5-7. O時該菌種的脫氮性能最好，說明該菌株的最佳脫氮環(huán)境為中度偏酸性環(huán)境。整個反應(yīng)過程中沒有硝酸鹽氮的累積，只有微量的亞硝酸鹽氮出現(xiàn)。實施例7.菌株在不同C/N條件下的脫氮實驗將小短桿菌(Brachybacterium)菌株接種于IOOml的鹽度(以NaCl計)為5%無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，于30°C 150rpm的搖床中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。待菌株生長至對數(shù)生長期后期時，取IOml菌液接入新鮮的90ml無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)其C/N分別為3. 7,7. 5和9，于150rpm的搖床中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)。未接種菌懸液的培養(yǎng)基進(jìn)行同等條件下的實驗作為空白對照。于6h、12h、18h、24h、36h和48h取少量反應(yīng)液，其中一部分直接用于測定菌體光密度，其余部分在8000rpm下離心lOmin，取上清液測定各種含氮化合物的濃度。由圖8可見，小短桿菌(Brachybacterium)菌株在不同C/N條件下脫氮性能相差較小，其中在C/N為9的時候脫氮性能最好，36h脫氮率達(dá)到94. 75%，整個反應(yīng)過程中沒有硝酸鹽氮的累積，只有微量的亞硝酸鹽氮出現(xiàn)，這也有力證明了該菌株的異樣硝化-好氧反硝化特性。
權(quán)利要求
1.一種小短桿菌Brachybacterium,保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No. 5947。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的小短桿菌Brachybacterium,其特征在于該小短桿菌菌株的16S rRNA基因序列長度為1360bp，如序列表中序列I所不。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的小短桿菌Brachybacterium,其特征在于在30_40°C下，營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)16_32h后,菌落表面光滑,淺黃色；通過革蘭氏染色后在顯微鏡下呈陽性，菌體呈短桿狀，大小為(0.6-1. 2) UmX (1.5-6. 0) Pm，菌落較小，扁平。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3之一所述的小短桿菌Brachybacterium,其特征在于能夠以有機(jī)物為電子受體，NH4+為電子供體，將NH4+氧化為NOf或N03_ ;能夠在高鹽、好氧的條件下，以有機(jī)物為電子供體，NO2-或N03_為電子受體，將其還原為氮氣，從而實現(xiàn)在高鹽條件下脫氮的目的。
5.權(quán)利要求I所述的小短桿菌Brachybacterium在廢水處理中的應(yīng)用,其特征是選用小短桿菌Brachybacterium對高鹽廢水進(jìn)行處理,實現(xiàn)同步硝化反硝化過程，實現(xiàn)在高鹽條件下脫氮的目標(biāo)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的小短桿菌Brachybacterium的應(yīng)用，其特征在于其所述的高鹽廢水的鹽度(以NaCl計)范圍為1%_13%，優(yōu)選為3%-10%。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的小短桿菌Brachybacterium的應(yīng)用，其特征在于其所述的高鹽廢水的碳氮比范圍為3. 7-9，優(yōu)選為9。
8.根據(jù)權(quán)利要求5-7之一所述的小短桿菌Brachybacterium的應(yīng)用，其特征在于其所述的高鹽廢水的pH范圍為6. 5-8. 0，優(yōu)選為6. 5-7. 5。
9.根據(jù)權(quán)利要求5-8之一所述的應(yīng)用,其特征是利用小短桿菌Brachybacterium或以其為主要成份微生物制劑對廢水進(jìn)行處理，可在高鹽、好氧環(huán)境下完成同步硝化反硝化過程，進(jìn)而實現(xiàn)總氮的去除。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種能夠在高鹽條件下進(jìn)行生物脫氮的小短桿菌菌株及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的小短桿菌(Brachybacterium)菌株已于2012年3月29日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏號為CGMCC No.5947。在鹽度(以NaCl計)3%-10%下，將該菌株置于溶解氧為2-6mg/L的含氮廢水中即可生物脫氮。該菌株對高鹽度的耐受能力強(qiáng)，在高鹽條件下生長良好，并且同時具備異養(yǎng)硝化和好氧反硝化的能力。在高鹽、好氧條件下，該菌株能夠進(jìn)行同步硝化反硝化，高效、徹底地去除污水中的總氮，從而有效解決高鹽條件下生物脫氮難以進(jìn)行的重大難題，具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號C02F3/02GK102703349SQ20121017123
公開日2012年10月3日 申請日期2012年5月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月29日
發(fā)明者倪晉仁, 鄧若男 申請人:北京大學(xué)