專利名稱：一種適用于低溫沼氣發(fā)酵的復(fù)合微生物菌劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體說，涉及一種用于低溫條件下產(chǎn)沼氣并且能提高以牛羊糞及秸稈為原料的復(fù)合菌劑及其制備的技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
在可持續(xù)發(fā)展的理念下，我國政府把節(jié)能減排作為主攻方向，農(nóng)村高度關(guān)注“三農(nóng)”及“生態(tài)富民工程”建設(shè)。農(nóng)村沼氣已成為農(nóng)村生態(tài)家園建設(shè)、社會主義新農(nóng)村建設(shè)、 實現(xiàn)農(nóng)業(yè)資源循環(huán)利用和節(jié)能減排的重要紐帶，與整個農(nóng)村社會的經(jīng)濟(jì)發(fā)展有著密切的聯(lián)系。沼氣是屬于地面生物質(zhì)能源，一般含甲烷(CH4)60 % -70 %，二氧化碳 (CO2) 25% -40%, H2S, N2, CO、H2等約占5 %，主要是通過細(xì)菌發(fā)酵使植物秸稈和牲畜糞便的有機(jī)物還原成氣體。沼氣無色、無臭、無味，沼氣在完全燃燒時火焰呈藍(lán)色，溫度可達(dá) 1400-2000°C，并放出大量的熱。燃燒后的產(chǎn)物是二氧化碳和水蒸氣，不會產(chǎn)生嚴(yán)重污染環(huán)境的氣體。Im3沼氣的熱值約18017KJ-25140KJ，相當(dāng)于Ikg原煤或0. 74kg標(biāo)準(zhǔn)煤，是一種優(yōu)質(zhì)的氣體燃料。沼氣熱效率比較穩(wěn)定，使用方便，其技術(shù)經(jīng)濟(jì)性僅次于液化石油氣。沼氣的制備主要是通過細(xì)菌發(fā)酵使植物秸稈和牲畜糞便的有機(jī)物還原成氣體的厭氧發(fā)酵過程。在沼氣制備過程中，厭氧消化過程是一個多菌群相互交替作用的復(fù)雜過程， 參與代謝的微生物菌群也相當(dāng)復(fù)雜，有水解性細(xì)菌、還原乙酸細(xì)菌、產(chǎn)甲烷菌等等。在一個能夠正常進(jìn)行發(fā)酵的沼氣池中，不產(chǎn)甲烷菌對有機(jī)物分解利用的速度決定了產(chǎn)甲烷菌產(chǎn)甲烷的速度，為了進(jìn)一步提高沼氣產(chǎn)量，重要的不是產(chǎn)甲烷菌的繼續(xù)富集，而是提高不產(chǎn)甲烷菌對有機(jī)物的水解速度。在水解細(xì)菌所產(chǎn)生的各種水解酶作用下，使大分子的蛋白質(zhì)、脂肪、纖維素、淀粉水解為水溶性的酸、醇、糖等小分子化合物以及少量H2和CO2，然后進(jìn)一步發(fā)酵形成乙酸鹽等，為甲烷菌提供充足的營養(yǎng)物質(zhì)，甲烷菌完成正常代謝后產(chǎn)出甲烷氣體。 因此，在酸化調(diào)節(jié)過程中，為了提高底物中有機(jī)物的降解效果，更好地為產(chǎn)甲烷菌提供甲烷合成底物，可添加微生物、酶、營養(yǎng)物質(zhì)、代謝促進(jìn)物、吸附劑、螯合劑等促進(jìn)劑以提高沼氣產(chǎn)量。但由于目前我國大面積推廣的戶用沼氣池幾乎全部采用的是常溫發(fā)酵模式，沼氣池的產(chǎn)氣情況受溫度變化的影響很大，而北方地區(qū)冬季普遍寒冷漫長，沼氣的生產(chǎn)存在產(chǎn)氣率低、使用率低、原料分解率低、沼氣使用綜合效益差等問題，甚至在冬季會出現(xiàn)凍裂沼氣池。有些地區(qū)冬季基本不產(chǎn)氣，沼氣池利用率50%，原料分解不到30%，沼氣使用每年只有3個月。尤其在農(nóng)牧區(qū)以羊糞為主的沼氣發(fā)酵存在原料上浮、結(jié)殼及產(chǎn)氣率低的問題。這種狀況在一定程度上限制了北方地區(qū)沼氣的發(fā)展。使北方沼氣的普及和應(yīng)用落后于南方地區(qū)，為此，在北方寒冷地區(qū)如何合理開發(fā)利用沼氣是一個亟待解決的問題。目前國內(nèi)的戶用沼氣池一般是采取一些可提高產(chǎn)用沼氣池冬季產(chǎn)氣率和發(fā)揮綜合效益的越冬保溫增溫措施，主要包括—是日光溫室、養(yǎng)豬暖舍、廁所、沼氣池“四位一體”模式；二是北方一般采用挖防寒溝，溝內(nèi)填發(fā)酵物的方式對農(nóng)村戶用沼氣池進(jìn)行保溫；三是調(diào)節(jié)發(fā)酵原料配比，改善微生物的食料結(jié)構(gòu)；四是在使用管理方面做到勤出料、勤進(jìn)料，每次進(jìn)出料量要少，進(jìn)料要適當(dāng)添加一些熱性原料，如經(jīng)過慪制的作物秸稈、牛糞、馬糞等，以提高發(fā)酵物濃度，采取以料補(bǔ)溫的方法對沼氣池料液升溫。這些措施雖有一些效果，但仍難以滿足需要，難以實現(xiàn)戶用沼氣池冬季正常產(chǎn)氣。今后通過為沼氣池提供水解微生物的優(yōu)勢菌群，改善不產(chǎn)甲烷菌的代謝功能，是提高有機(jī)物分解利用率和沼氣產(chǎn)量的一項重要措施。現(xiàn)有技術(shù)表明，添加沼氣發(fā)酵促進(jìn)劑在沼氣發(fā)酵中主要可以改善微生物營養(yǎng)狀況、加速新陳代謝、改變沼氣微生物占優(yōu)勢的種類，使產(chǎn)甲烷絲狀菌屬 (Methanothrix)過渡為活性更強(qiáng)的產(chǎn)甲烷八疊球菌屬(Methanosarcina)；中國專利文件 CN1888073 (200510077792. 3)公開了一種復(fù)合菌劑預(yù)處理秸稈的沼氣發(fā)酵方法，復(fù)合菌劑為高溫單胞菌、枯草芽孢桿菌、木霉菌和地衣芽孢桿菌，向潤濕后的秸稈加入復(fù)合菌劑和作為秸稈堆慪的氮源碳酸氫銨并補(bǔ)加水，用塑料布覆蓋堆慪，然后將堆慪好的秸稈入沼氣池， 同時加入碳酸氫氨和產(chǎn)甲烷接種物，密閉2-7天，即產(chǎn)沼氣。預(yù)處理后的秸稈發(fā)酵速度和產(chǎn)氣速度快，使初始產(chǎn)氣時間縮短，產(chǎn)氣率提高30%左右，能使所有玉米秸桿、稻草、麥桿等農(nóng)作物秸稈作為沼氣發(fā)酵的原料，適用范圍廣泛。該方法的局限性在于，一是側(cè)重于分解秸稈不能解決用戶沼氣池冬季產(chǎn)沼氣問題；二是該復(fù)合菌劑只能在預(yù)處理秸稈時使用，不能直接投入沼氣池內(nèi)促沼氣生成，使用方法麻煩，限制了其推廣。經(jīng)國內(nèi)專利檢索，尚未見有適用沼氣低溫發(fā)酵微生物菌種及推廣應(yīng)用的相關(guān)產(chǎn)品的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，目的在于提供一種用于低溫沼氣生產(chǎn)中適用的高效復(fù)合微生物菌劑及其制備方法，本發(fā)明的復(fù)合微生物菌劑可直接投加到沼氣池，使得沼氣池在冬季正常產(chǎn)氣，具有較好的應(yīng)用前景。本發(fā)明的主要技術(shù)方案根據(jù)外源酶類對低溫下沼氣發(fā)酵影響的研究，針對蛋白酶、糖化酶、木質(zhì)素酶、纖維素酶、半纖維素酶、甲烷菌等進(jìn)行研究；重點(diǎn)篩選水解菌、還原乙酸菌、產(chǎn)甲烷菌等，通過對羊糞、牛糞的木質(zhì)素、纖維素、半纖維素及含氮量進(jìn)行了測定分析，并對沼氣發(fā)酵前后微生物作用效果進(jìn)行對比分析，確定發(fā)酵菌種類型。并通過不同的馴化方式擴(kuò)展菌株的溫度適應(yīng)范圍，使其能夠在較寬的溫度范圍內(nèi)均具有較高的活性。同時利用生物技術(shù)手段對低溫沼氣發(fā)酵微生物菌群進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測，并針對性的篩選優(yōu)勢菌株， 同時結(jié)合菌劑接種實驗結(jié)果，制定沼氣低溫發(fā)酵菌劑生物監(jiān)測標(biāo)準(zhǔn)。本發(fā)明具體提供了一種用于沼氣低溫發(fā)酵的復(fù)合微生物菌劑。所述的復(fù)合微生物菌劑由巴氏醋桿菌(Acetobacter)、假單胞菌(Pseudomonas sp.)和成團(tuán)泛菌(Pantoea agglomerans)三種菌的發(fā)酵液按重量比計，將三種菌分別發(fā)酵后的發(fā)酵液按1 1 1比例混勻，即為液體劑型。具體的，本發(fā)明提供用于沼氣低溫發(fā)酵的假單胞菌(Pseudomonas sp.)。通過從羊糞沼氣發(fā)酵反應(yīng)器中進(jìn)行微生物菌種的培養(yǎng)、分離與篩選，獲得一批細(xì)菌，并從中分離篩選出一株產(chǎn)表面活性劑較高的菌株，編號為R1，菌落呈擴(kuò)散狀生長，半透明，最佳生長溫度^°c，短桿狀，革蘭氏染色陰性；可在添加甲醇的培養(yǎng)基上生長。經(jīng)形態(tài)、微生物學(xué)分類和16S rDNA特征序列分析鑒定，屬于假單胞菌(I^seudomonas sp.)。通過對菌株發(fā)酵條件及酶學(xué)特性進(jìn)行研究，結(jié)果表明R1菌株的最佳生長培養(yǎng)基為I3R培養(yǎng)基，在^°C，150rpm， 培養(yǎng)48h，其能夠產(chǎn)生一種生物表面活性劑。參照《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)鑒定手冊》(《Bergey， s Manual of Systematic Bacterio-Iogy)))第九版和《常用細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》等對菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)測定，生理生化檢測、G+C含量測定，確定編號為Rl菌株為假單胞菌中的成員。 該菌株已于申請日前保藏于布達(dá)佩斯條約微生物國際保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)。地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101。保藏日期是2011年04月14日，保藏號是CGMCC No. 4764。經(jīng)過16SrRNA同源分析、系統(tǒng)發(fā)育分析和細(xì)胞脂肪酸組分分析結(jié)果都表明，編號為Rl的菌株為假單胞菌(Pseudomonas sp.)，以下簡稱假單胞菌(Pseudomonas sp.) CGMCC No. 4764。同時，本發(fā)明提供用于沼氣低溫發(fā)酵的成團(tuán)泛菌(Pantoea agglomerans)。通過從羊糞沼氣發(fā)酵反應(yīng)器中進(jìn)行微生物菌種的培養(yǎng)、分離與篩選，獲得一批細(xì)菌，并從中分離篩選出一株產(chǎn)2，3 丁二醇較高的菌株，編號為R4，菌落呈邊緣整齊，表面較濕潤；革蘭氏陽性菌，短桿狀，無芽孢，無莢膜；最佳生長溫度，檸檬酸鹽利用試驗、明膠水解試驗、油脂水解、淀粉水解，尿素酶試驗、硫化氫的產(chǎn)生試驗、硝酸鹽和亞硝酸鹽還原試驗、甲基紅試驗結(jié)果均為陰性；己酰甲基甲醇(V-P)試驗陽性；利用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖，乳糖產(chǎn)酸，利用淀粉產(chǎn)堿。經(jīng)形態(tài)、微生物學(xué)分類和16S rDNA特征序列分析鑒定，屬于成團(tuán)泛菌(Pantoea agglomerans)。經(jīng)搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化試驗研究。結(jié)果表明R4菌株的最佳生長培養(yǎng)基為R4F 培養(yǎng)基，28°C，150rpm，培養(yǎng)48h，其能夠產(chǎn)生一種生物表面活性劑。參照《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)鑒定手冊》(《Bergey，s Manual of Systematic Bacterio-Iogy)))第九版和《常用細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》等對菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)測定，生理生化檢測、G+C含量測定，確定編號為R4菌株為成團(tuán)泛菌中的成員。該菌株已于申請日前保藏于布達(dá)佩斯條約微生物國際保藏單位 中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)。地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1 號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101。保藏日期是2011年04月14日，保藏號是CGMCC No. 4765。經(jīng)過16SrRNA同源分析、系統(tǒng)發(fā)育分析和細(xì)胞脂肪酸組分分析結(jié)果都表明，編號為R4菌株為成團(tuán)泛菌(Pantoea agglomerans)，以下簡稱成團(tuán)泛菌(Pantoea agglomerans)CGMCC No. 4765。其中，本發(fā)明采用的巴氏醋桿菌(AcetcAacter)株菌為購買菌株，公眾可通過市場途徑購買獲得。進(jìn)一步，本發(fā)明提供巴氏醋桿菌(AcetcAacter)、假單胞菌(Pseudomonas sp.) CGMCC No. 4764 和成團(tuán)泛菌(Pantoea agglomerans) CGMCC No. 4765 三種菌的發(fā)酵液分別按斜面菌種培養(yǎng)活化、搖瓶培養(yǎng)、種子罐液體發(fā)酵培養(yǎng)、發(fā)酵罐液體發(fā)酵生產(chǎn)，生產(chǎn)條件如下假單胞菌G^seudomonas sp. ) CGMCC No. 4764采用LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時制備菌種，取菌種200毫升接種至10升I3R培養(yǎng)基中；發(fā)酵溫度為^°C，并用NH4OH溶液將PH恒定調(diào)節(jié)至6-8，優(yōu)選6. 8 ；攪拌速率為400rpm，通氣量設(shè)定為0. 4(V/V)；當(dāng)生物量的濃度達(dá)到10g/L-40g/L時停上發(fā)酵。成團(tuán)泛菌(Pantoeaagglomerans) CGMCC No. 4765 采用 R4F 液體培養(yǎng)基培養(yǎng) 24 小時制備菌種，取菌種250毫升接種至10升R4F培養(yǎng)基中；發(fā)酵溫度為^°C，并用NH4OH 28% 溶液將PH恒定調(diào)節(jié)至6-8，優(yōu)選7. 0 ；攪拌速率為lOOrpm，通氣量設(shè)定為0. 2 (V/V)；當(dāng)生物量的濃度達(dá)到10g/L-30g/L時停上發(fā)酵。巴氏醋桿菌(AcetcAacter)用FC液體培養(yǎng)基培養(yǎng)M小時制備菌種，用上述菌種 250毫升接種至10升FC培養(yǎng)基中。發(fā)酵溫度為^°C，并用NH4OH溶液將pH恒定調(diào)節(jié)至4-7，優(yōu)選7. O。攪拌速率為150rpm，通氣量設(shè)定為0. 1 (V/V)。當(dāng)生物量的濃度達(dá)到IOg/ L至20g/L時(優(yōu)選12g/L)停上發(fā)酵。將上述三種制備好的發(fā)酵液按等體積混合，直接應(yīng)用于沼氣池。以上三種菌的發(fā)酵液中有效活菌數(shù)分別都在10億個/毫升以上。本領(lǐng)域熟知，沼氣發(fā)酵的生物學(xué)過程由多菌種聯(lián)合作用，可分為三個階段，即水解階段、產(chǎn)酸階段、產(chǎn)氣階段。在農(nóng)作物秸稈發(fā)酵產(chǎn)沼氣過程中，纖維素類物質(zhì)分解是關(guān)鍵，纖維素的破壞意味著復(fù)雜的有機(jī)物水解成相應(yīng)的單體和無形體物質(zhì)產(chǎn)生，這是最重要的物理性狀變化。因此，本發(fā)明根據(jù)微生物菌株的特性和沼氣發(fā)酵過程原理，研究、制備專用的高效環(huán)保微生物復(fù)合接種菌劑，同時提供利用微生物復(fù)合菌劑加速富含纖維素農(nóng)作物秸稈進(jìn)行分解的處理方法，有利于沼氣發(fā)酵過程水解階段進(jìn)行，并加快產(chǎn)酸階段和產(chǎn)氣階段實施， 縮短產(chǎn)沼氣時間，增加沼氣產(chǎn)量，是十分必要的。本發(fā)明通過對三種性能優(yōu)異的微生物菌株的有機(jī)組合，制成的復(fù)合微生物菌劑， 在較低的溫度下具備較強(qiáng)的繁殖能力，而且對各類粗纖維和蛋白類大分子具有很強(qiáng)的消化能力。該復(fù)合微生物菌劑添加到沼氣池中可以加速低溫產(chǎn)沼氣菌的富集，從而加速沼氣池啟動。上述復(fù)合微生物菌劑的制備方法中未明確限定的均可按現(xiàn)有技術(shù)。通過實施本發(fā)明具體的發(fā)明內(nèi)容，可以達(dá)到以下有益效果1、本發(fā)明提供了一種用于沼氣低溫發(fā)酵的復(fù)合微生物菌劑的制取技術(shù)具有良好
的重復(fù)性。2、該復(fù)合微生物菌劑在低溫下可明顯提高沼氣產(chǎn)量。只要沼氣發(fā)酵裝置中料液溫度保持在大于10°c，以牛羊糞便為主要原料的沼氣池，比不加菌劑的提高30% -50%以上。3、該復(fù)合微生物菌劑的使用方法簡單，而且該菌劑具有長效性。由于沼氣池常年可以使用，每尸每年平均可節(jié)省幾個月的生活用煤。4、本發(fā)明對加該復(fù)合微生物菌劑后的沼渣測定結(jié)果表明，沼渣中氮、磷、鉀及有機(jī)質(zhì)含量都比較高，是一種很好的有機(jī)肥料，特別是對纖維素類農(nóng)作物秸稈分解的微生物菌劑的制備；以及利用此專用復(fù)合菌劑作為接種菌劑，提供對農(nóng)作物秸稈進(jìn)行分解處理，加快發(fā)酵產(chǎn)沼氣的應(yīng)用方法。同時也可以用于對其它有機(jī)固體廢物進(jìn)行生物處理產(chǎn)沼氣。


圖1顯示為不同菌劑處理產(chǎn)沼氣率圖。圖2顯示為5L沼氣羊糞產(chǎn)氣圖。
具體實施例方式下面，舉實施例說明本發(fā)明，但是，本發(fā)明并不限于下述的實施例。
本發(fā)明中涉及到的主要原輔材料和設(shè)備有主要試劑牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、淀粉、牛肉膏、蔗糖、Na2HPCV NaCL, MgS04 · 7H20、K2HPCMJeSOJH2CK MnSO4 · H20、NaN03。主要儀器5升及10升發(fā)酵系統(tǒng)、搖床、PCR擴(kuò)增儀、冷凍離心機(jī)、顯微鏡、生化培養(yǎng)箱、分析天平、超凈工作臺。本發(fā)明中選用的所有試劑和儀器都為本領(lǐng)域熟知選用的，其他本領(lǐng)域熟知的一些試劑和設(shè)備都可適用于本發(fā)明以下實施方式的實施。實施例一菌株的篩選、馴化、選育及分類鑒定在10°C條件下，對幾個不同處理的羊糞沼氣反應(yīng)器優(yōu)勢微生物進(jìn)行分離、篩選、培養(yǎng)、鑒定及回接實驗驗證，對其作用效果進(jìn)行對比分析，確定發(fā)酵菌種類型。同時。利用分子生物學(xué)手段，對沼氣發(fā)酵罐細(xì)菌及真菌優(yōu)勢菌群進(jìn)行分離鑒定，對已發(fā)酵良好的羊糞沼氣反應(yīng)器進(jìn)行樣品的采集和DNA的提取，進(jìn)行了微生物種群的16S rDNA及18S rDNA的鑒定及微生物多樣性的比較、鑒定等研究，確定菌群類型。最終確定了兩株具有明顯效果的菌株Rl和R4菌。通過從羊糞沼氣發(fā)酵反應(yīng)器中進(jìn)行微生物菌種的培養(yǎng)、分離與篩選，獲得一批細(xì)菌，并從中分離篩選出一株產(chǎn)表面活性劑較高的菌株，編號為R1，菌落呈擴(kuò)散狀生長，半透明，最佳生長溫度^°C，短桿狀，革蘭氏染色陰性；可在添加甲醇的培養(yǎng)基上生長。經(jīng)形態(tài)、微生物學(xué)分類和16S rDNA特征序列分析鑒定，屬于假單胞菌(I^eudomonas sp.)。通過對菌株發(fā)酵條件及酶學(xué)特性進(jìn)行研究，結(jié)果表明R1菌株的最佳生長培養(yǎng)基為I3R培養(yǎng)基， 在^°C，150rpm，培養(yǎng)48h，其能夠產(chǎn)生一種生物表面活性劑。參照《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)鑒定手冊》(《Bergey，s Manual of Systematic Bacterio-Iogy)))第九版和《常用細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》等對菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)測定，生理生化檢測、G+C含量測定，確定編號為Rl菌株為假單胞菌中的成員。該菌株已于申請日前保藏于布達(dá)佩斯條約微生物國際保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)。地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101。保藏日期是2011年04月14日，保藏號是CGMCC No. 4764。經(jīng)過16SrRNA同源分析、系統(tǒng)發(fā)育分析和細(xì)胞脂肪酸組分分析結(jié)果都表明，編號為Rl的菌株為假單胞菌O^seudomonas sp.)，以下簡稱假單胞菌(I^seudomonas sp.)CGMCC No. 4764。通過從羊糞沼氣發(fā)酵反應(yīng)器中進(jìn)行微生物菌種的培養(yǎng)、分離與篩選，獲得一批細(xì)菌，并從中分離篩選出一株產(chǎn)2，3 丁二醇較高的菌株，編號為R4，菌落呈邊緣整齊，菌落形態(tài)小而平、透明、白色、表面較濕潤；革蘭氏陽性菌，球狀，呈單個或成雙，有時呈短鏈狀排列，無芽孢，無莢膜；最佳生長溫度，革蘭氏陽性，檸檬酸鹽利用試驗、明膠水解試驗、 油脂水解、淀粉水解，尿素酶試驗、硫化氫的產(chǎn)生試驗、硝酸鹽和亞硝酸鹽還原試驗、甲基紅試驗結(jié)果均為陰性；己酰甲基甲醇(V-P)試驗陽性；利用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖，乳糖產(chǎn)酸，利用淀粉產(chǎn)堿。經(jīng)形態(tài)、微生物學(xué)分類和16S rDNA特征序列分析鑒定，屬于成團(tuán)泛菌 (Pantoea agglomerans)。經(jīng)搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化試驗研究。結(jié)果表明R4菌株的最佳生長培養(yǎng)基為R4F培養(yǎng)基，280C，150rpm,培養(yǎng)48h，其能夠產(chǎn)生一種生物表面活性劑。參照《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)鑒定手冊》(((Bergey,s Manual of Systematic Bacterio-Iogy)))第九版和 《常用細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》等對菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)測定，生理生化檢測、G+C含量測定，確定編號為R4菌株為成團(tuán)泛菌中的成員。該菌株已于申請日前保藏于布達(dá)佩斯條約微生物國際保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)。地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101。保藏日期是2011年04月 14日，保藏號是CGMCC No. 4765。經(jīng)過16SrRNA同源分析、系統(tǒng)發(fā)育分析和細(xì)胞脂肪酸組分分析結(jié)果都表明，編號為R4菌株為成團(tuán)泛菌(Pantoea agglomerans)，以下簡稱成團(tuán)泛菌 (Pantoea agglomerans)CGMCC No· 4765。將上述菌的發(fā)酵液分別按斜面菌種培養(yǎng)活化、搖瓶培養(yǎng)、種子罐液體發(fā)酵培養(yǎng)、發(fā)酵罐液體發(fā)酵生產(chǎn)，生產(chǎn)條件如下假單胞菌(I^eudomonas sp.)采用LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)M小時制備菌種，取菌種 200毫升接種至10升I3R培養(yǎng)基中；發(fā)酵溫度為^°C，并用NH40H溶液將pH恒定調(diào)節(jié)至6-8，優(yōu)選6. 8 ；攪拌速率為400rpm，通氣量設(shè)定為0. 4(V/V)；當(dāng)生物量的濃度達(dá)到IOg/ L-40g/L時停上發(fā)酵。成團(tuán)泛菌(Pantoea agglomerans)采用R4F液體培養(yǎng)基培養(yǎng)M小時制備菌種，取菌種250毫升接種至10升R4F培養(yǎng)基中；發(fā)酵溫度為^°C，并用NH4OffiS%溶液將PH恒定調(diào)節(jié)至6-8，優(yōu)選7.0 ；攪拌速率為lOOrpm，通氣量設(shè)定為0.2(V/V)；當(dāng)生物量的濃度達(dá)到 10g/L-30g/L時停上發(fā)酵。同時，Rl菌株經(jīng)16S rDNA序列測定，其序列在NCBI Genbank數(shù)據(jù)庫中與已報道的I3Seudomonas sp.菌株同源性高達(dá)98 %，進(jìn)一步確證提供的菌株Rl為假單胞菌 (Pseudomonas sp.) 0同時，R4菌株經(jīng)16S rDNA序列測定，其序列在NCBI Genbmk數(shù)據(jù)庫中與已報道的Pmtoea agglomerms菌株同源性高達(dá)99 %，進(jìn)一步確證提供的菌株R4為成團(tuán)泛菌 (Pantoea agglomerans)0實施例二 用于沼氣低溫發(fā)酵的復(fù)合微生物菌劑的制備本發(fā)明提供巴氏醋桿菌(Acetobacter)、假單胞菌(Pseudomonas sp. ) CGMCC No. 4764和成團(tuán)泛菌(Pantoea agglomerans) CGMCC No. 4765三種菌的發(fā)酵液分別按斜面菌種培養(yǎng)活化、搖瓶培養(yǎng)、種子罐液體發(fā)酵培養(yǎng)、發(fā)酵罐液體發(fā)酵生產(chǎn)，生產(chǎn)條件如下假單胞菌G^seudomonas sp. ) CGMCC No. 4764采用LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)M小時制備菌種，取菌種200毫升接種至10升I3R培養(yǎng)基中；發(fā)酵溫度為^°C，并用NH4OH溶液將PH恒定調(diào)節(jié)至6-8，優(yōu)選6. 8 ；攪拌速率為400rpm，通氣量設(shè)定為0. 4(V/V)；當(dāng)生物量的濃度達(dá)到10g/L-40g/L時停上發(fā)酵。成團(tuán)泛菌(Pantoeaagglomerans) CGMCC No. 4765 采用 R4F 液體培養(yǎng)基培養(yǎng) 24 小時制備菌種，取菌種250毫升接種至10升R4F培養(yǎng)基中；發(fā)酵溫度為^°C，并用NH4OH 28% 溶液將PH恒定調(diào)節(jié)至6-8，優(yōu)選7. O ；攪拌速率為lOOrpm，通氣量設(shè)定為0. 2 (V/V)；當(dāng)生物量的濃度達(dá)到10g/L-30g/L時停上發(fā)酵。巴氏醋桿菌(AcetcAacter)用FC液體培養(yǎng)基培養(yǎng)M小時制備菌種，用上述菌種 250毫升接種至10升FC培養(yǎng)基中。發(fā)酵溫度為^°C，并用NH4OH溶液將pH恒定調(diào)節(jié)至4-7，優(yōu)選7. O。攪拌速率為150rpm，通氣量設(shè)定為0. 1 (V/V)。當(dāng)生物量的濃度達(dá)到IOg/ L至20g/L時(優(yōu)選12g/L)停上發(fā)酵。LB培養(yǎng)基表面培養(yǎng)基組分[g/ml]為每IOOOmL蒸餾水中加入3克牛肉膏；5克NaCL ；10克蛋白胨；18-20克瓊脂粉。PR培養(yǎng)基每IOOOmL蒸餾水中加入1克淀粉；5克Na2HPO4 ；5克酵母膏；10克蛋白胨；18-20克瓊脂粉。R4F培養(yǎng)基每IOOOmL蒸餾水中加入2克牛肉膏；3克蛋白胨；0. 05克 MgS04 · 7H20 ；0. 5 克 K2HP04 ；0. 05 克 FeSO4 · 7H20 ；0. 05 克 MnSO4 · H2O ；20 克蔗糖；18-20 克
瓊脂粉。R4G培養(yǎng)基表面培養(yǎng)基組分[g/ml]為每IOOOmL蒸餾水中加入2克牛肉膏；3克蛋白胨；10 克蔗糖；2 克 NaNO3 ；0. 5 克 MgSO4 · 7H20 ；0. 5 克 K2HPO4 ； 18-20 克瓊脂粉。FC培養(yǎng)基(g/L) 20克蔗糖，5克酵母膏，5克蛋白胨，2克Na2HPO4將上述三種制備好的發(fā)酵液按等體積混合，可直接應(yīng)用于沼氣池。實施例三10°C、15°C -18°C、30°C下沼氣發(fā)酵產(chǎn)氣實驗研究進(jìn)行了 10°C、15°C -18°C (室溫)、30°C條件下5L罐羊糞沼氣發(fā)酵菌劑接種試驗 (添加5-10克菌劑)，對其產(chǎn)氣條件及產(chǎn)氣率進(jìn)行了實驗。結(jié)果為只要沼氣發(fā)酵裝置中料液溫度保持在大于10°C，以牛羊糞便為主要原料的沼氣池，比不加菌劑的提高30%以上， 參見附圖1、2。
權(quán)利要求
1.一種用于沼氣低溫發(fā)酵的復(fù)合微生物菌劑，其特征在于，所述的復(fù)合微生物菌劑由巴氏醋桿菌(Acetobacter)、假單胞菌(Pseudomonas sp. )CGMCC No. 4764和成團(tuán)泛菌 (Pantoea agglomerans) CGMCC No. 4765三種菌的發(fā)酵液按重量比計，將三種菌分別發(fā)酵后的發(fā)酵液按1 1 1比例混勻，混合后的液體即為液體菌劑劑型。
2.一種采用權(quán)利要求1所述的用于沼氣低溫發(fā)酵的假單胞菌(I^eudomonas sp.) CGMCC No. 4764。
3.一種采用權(quán)利要求1所述的用于沼氣低溫發(fā)酵的成團(tuán)泛菌(Pantoea agglomerans) CGMCC No. 4765。
全文摘要
本發(fā)明公開一種用于沼氣低溫發(fā)酵的復(fù)合微生物菌劑。由假單胞菌(Pseudomonas sp.)CGMCC No.4764、成團(tuán)泛菌(Pantoea agglomerans)CGMCC No.4765和成團(tuán)泛菌(Pantoea agglomerans)三種菌的發(fā)酵液按重量比計，將三種菌分別發(fā)酵后的發(fā)酵液按1∶1∶1比例混勻，即為液體劑型。本發(fā)明的復(fù)合微生物菌劑可直接投加到沼氣池，使得沼氣池在冬季正常產(chǎn)氣，具有廣泛的應(yīng)用價值。
文檔編號C02F11/04GK102433262SQ20111041302
公開日2012年5月2日 申請日期2011年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月13日
發(fā)明者馮蕾, 史慧鋒, 唐嫻, 楊新平, 秦新政, 陳競, 馬彩雯 申請人:新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所