專利名稱：產(chǎn)表面活性劑的酵母菌株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及環(huán)境生物領(lǐng)域中的酵母菌及其應(yīng)用，特別涉及ー株產(chǎn)表面活性劑的酵母及其在采油廢水處理中的應(yīng)用，屬于酵母菌株領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
含油廢水主要來(lái)源于石油、石油化工、鋼鐵、焦化、煤氣發(fā)生站、機(jī)械加工等エ業(yè)部門，其中所含的油類物質(zhì)包括天然石油、石油產(chǎn)品、焦油及其分餾物，以及食用動(dòng)植物油和脂肪類等。這些エ業(yè)部門生產(chǎn)過(guò)程中所產(chǎn)生的含油廢水如果不加以回收，會(huì)造成極大地資源浪費(fèi)；如果不加處理而直接排入河流、湖泊或海灣，會(huì)污染水體，含油廢水中的疏水性有機(jī)物會(huì)在水體表面形成油膜，使水中溶解氧急劇下降，從而影響水生生物生存；如果直接用于農(nóng)業(yè)灌溉，這些疏水性有機(jī)物進(jìn)入土壌后會(huì)嚴(yán)重影響土壤的透氣性和滲水性，堵塞土壌空隙，妨礙農(nóng)作物生長(zhǎng)；此外，含油廢水中的多環(huán)芳烴具生物毒性和致畸作用，可通過(guò)各種 渠道(如食物鏈)進(jìn)入人體，直接對(duì)人們的身體健康構(gòu)成威脅。含油廢水中由于存在大量的疏水性有機(jī)物，易在水中形成油層、油珠，不易于被細(xì)菌攝取，利用常規(guī)的活性污泥方法直接處理存在一定的難度。為了提高疏水性有機(jī)物在水中的溶解度并促進(jìn)其被生物降解，通常采用表面活性劑來(lái)減少污水張力，増加疏水性有機(jī)物的溶解。目前較常用的表面活性劑如Tween 80等對(duì)于環(huán)境中生物具有一定的毒性，也具有一定的持久性，容易造成二次污染。同時(shí)，國(guó)內(nèi)對(duì)于高含油廢水的生物處理往往由于污水前期化學(xué)處理過(guò)程中酸堿中和產(chǎn)生大量的鹽，使得生物處理反應(yīng)器中的活性污泥經(jīng)常處于活性抑制狀態(tài)，所以處理效果不理想。生物表面活性劑是微生物或植物在一定條件下培養(yǎng)時(shí)，在其代謝過(guò)程中分泌出的具有一定表面活性的代謝產(chǎn)物，如糖脂、多糖脂、脂肽或中性類脂衍生物等。它們不僅具有化學(xué)表面活性劑具有的各種表面性能，而且還具有選擇性廣，對(duì)環(huán)境友好；其龐大而復(fù)雜的化學(xué)結(jié)構(gòu)使得表面活性和乳化能力更強(qiáng)；分子結(jié)構(gòu)類型多祥，具有許多特殊的官能團(tuán)，專ー性強(qiáng)；原料在自然界廣泛存在且價(jià)廉；綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)。酵母菌屬真菌，具有耐酸、耐高鹽、耐高滲透壓以及代謝效率高等特點(diǎn)。目前，已有研究發(fā)現(xiàn)酵母菌對(duì)某些難降解物質(zhì)及有機(jī)的有毒物質(zhì)具有較強(qiáng)的分解能力，并且在降解強(qiáng)疏水性物質(zhì)如多環(huán)芳烴上，相對(duì)于其它微生物具有較強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)。如日本于70年代進(jìn)行了酵母菌利用廢水的探索性研究，并于90年代成功開發(fā)了酵母菌廢水處理技木。目前該技術(shù)已經(jīng)被應(yīng)用到油脂加工、海產(chǎn)加工、食品加工以及制醬等行業(yè)的廢水處理中。因此，從環(huán)境中篩選具有較好的降解疏水性有機(jī)物以及產(chǎn)生生物表面活性劑能力的酵母菌對(duì)處理含油廢水具有重要的意義，利用產(chǎn)生表面活性劑的酵母菌株來(lái)處理高含油廢水也具有較好的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要目的是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題提供ー種產(chǎn)表面活性劑的酵母菌株及其應(yīng)用，本發(fā)明篩選到的酵母菌株能夠產(chǎn)生表面活性劑，井能夠以Cltl-C24烷烴和/或多環(huán)芳烴為碳源進(jìn)行生長(zhǎng)，并對(duì)這些疏水性有機(jī)物具有良好的降解作用，在采油廢水處理方面具有良好的應(yīng)用前景。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明一方面提供一株酵母菌季也蒙畢赤酵母PichiaguiIliermondii AH2。本發(fā)明所提供的酵母菌株已于2011年4月28日保藏于“中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心”，其分類命名為Pichia gui I liermondii AH2，保藏號(hào)為CGMCCNo. 4813。保藏地址是北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。該菌株從河北冀東油田采油場(chǎng)油井周圍的原油污染土壤中采用富集培養(yǎng)、平板稀釋法分離、純化得到。其中，富集培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基中添加菲溶液0. 2%，調(diào)節(jié)pH值為5-6，培養(yǎng)基在 121°C下恒溫滅菌20分鐘得到，其中所述的基本培養(yǎng)基組成如下(NH4)2SO4 lg, K2HPO4 0. 8g, KH2PO4 0. 2g, MgSO4 7H20 0. 2g, CaCl2 2H20 0. lg,FeSO4 7H20 5mg, ImL過(guò)濾除菌的維他命溶液，純凈水1，OOOmL, pH 5-6。特別是，所述維他命溶液的組成如下煙酸lOOmg，維生素BI IOOmg,生物素5mg，對(duì)氨基苯甲酸50mg,維生素B12 Img,泛酸I丐50mg,維生素B6 50mg,微生素M 50mg, 3NaEDTA 200mg，超純水稀釋至100mL。特別是，所述的菲溶液的組成為lg菲，IL正己烷。其中，分離純化培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基中添加菲溶液0.pH值為5-6，培養(yǎng)基在121°C下恒溫滅菌20分鐘得到，其中所述的基本培養(yǎng)基組成如下(NH4)2SO4 lg, K2HPO4 0. 8g, KH2PO4 0. 2g, MgSO4 7H20 0. 2g, CaCl2 2H20 0. lg,FeSO4 7H20 5mg, ImL過(guò)濾除菌的維他命溶液，純凈水1，OOOmL, pH 5-6。菌株P(guān)ichia gui I liermondii AH2 有以下特征I、菌落形態(tài)學(xué)特征為^YPD固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)2天的菌落直徑大小為3-4mm，菌落呈圓形，表面光滑，邊緣整齊，突出，白色。2、細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征為球形，成熟細(xì)胞直徑約5um。3、26S rDNA 基因序列特征為菌株 Pichia gui I liermondii AH2 的 26S rDNA 序列長(zhǎng)度為574bp。本發(fā)明另一方面提供ー種利用季也蒙畢赤酵母菌株P(guān)ichia gui I liermondii AH2生產(chǎn)表面活性劑的方法，包括將季也蒙畢赤酵母菌株接種于培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)，即得表面活性剤，其中，所述培養(yǎng)基為烷烴的培養(yǎng)基或含有多環(huán)芳烴的混合培養(yǎng)基。其中，所述燒烴培養(yǎng)基選擇含Cltl-C24燒烴中的ー種或多種的培養(yǎng)基。特別是，所述烷烴培養(yǎng)基選擇十六烷烴培養(yǎng)基，所述十六烷烴培養(yǎng)基組成如下十六烷烴 8g，KH2PO4 lg, (NH4)2SO4 0. 5g，MgSO4 7H20 0. 5g，酵母提取物 0. 5g，純凈水1，OOOrnL，pH 5-6 o其中，所述含有多環(huán)芳烴培的混合養(yǎng)基選擇含萘混合培養(yǎng)基或含菲混合培養(yǎng)基。特別是，所述含萘混合培養(yǎng)基的組成如下十六烷烴8g，萘lOOmg，KH2PO4 lg,(MM)2SO4 0. 5g，MgSO4 7H20 0. 5g，酵母提取物 0. 5g，純凈水 I, OOOmL，pH 5-6。特別是，所述含菲混合培養(yǎng)基的組成如下十六燒烴8g,菲20mg, KH2PO4 lg,(MM)2SO4 0. 5g，MgSO4 7H20 0. 5g，酵母提取物 0. 5g，純凈水 I, OOOmL, pH 5-6。其中，所述振蕩培養(yǎng)是在以下條件下進(jìn)行黑暗條件，培養(yǎng)溫度為25_27°C，轉(zhuǎn)速150-170rpm，震蕩培養(yǎng)時(shí)間為72_168h。特別是，所述振蕩培養(yǎng)條件為黑暗條件，培養(yǎng)溫度為25_27°C，轉(zhuǎn)速150rpm，震蕩培養(yǎng)時(shí)間為96-168h。特別是，所述將季也蒙畢赤酵母菌株接種于培養(yǎng)基包括如下步驟首先，將酵母菌株P(guān)ichia gui I liermondii AH2接種于萘培養(yǎng)基中，25_27°C，150rpm培養(yǎng)至培養(yǎng)液的OD6tltl值達(dá)到0. 4-0. 6，獲得P. gui I liermondii AH2菌的接種母液，然后將接種母液與培養(yǎng)基混合均勻。其中，所述的萘培養(yǎng)基組成如下萘IOOmgjKH2PO4 lg, (NH4)2SO4 0. 5g,MgSO4 *7H200. 5g，酵母提取物0. 5g，純凈水1，OOOmL, pH 5_6，培養(yǎng)基在121°C下恒溫滅菌20分鐘。
特別是，將所述季也蒙畢赤酵母菌株接種于萘培養(yǎng)基的過(guò)程中，每IOOml萘培養(yǎng)基中接種ー接種環(huán)的季也蒙畢赤酵母菌株。其中，接種母液與培養(yǎng)基混合過(guò)程中所述季也蒙畢赤酵母菌株的接種母液的用量為每100毫升培養(yǎng)基中混合0. I-Iml所述接種母液。本發(fā)明又一方面提供一種季也蒙畢赤酵母菌株P(guān)ichia gui I liermondii AH2在降解疏水性有機(jī)物中的應(yīng)用。將所述季也蒙畢赤酵母菌株接種于含有疏水性有機(jī)物的污染物中，進(jìn)行酵母菌培養(yǎng)。其中，所述酵母培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度為25_27°C。本發(fā)明再一方面提供ー種利用季也蒙畢赤酵母菌株P(guān)ichia gui I liermondii AH2降解疏水性有機(jī)污染物的方法，包括將菌株P(guān)ichia gui I liermondii AH2接種于疏水性有機(jī)污染物中，混合均勻，進(jìn)行酵母菌培養(yǎng)。其中，所述的酵母菌培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度為25_27°C。本發(fā)明又一方面提供一種季也蒙畢赤酵母菌株在浄化處理油田廢水中的應(yīng)用。其中，所述的凈化處理油田廢水中的應(yīng)用是向油田廢水中加入所述季也蒙畢赤酵母菌株，攪拌均勻，處理20-24小時(shí)。特別是，首先將季也蒙畢赤酵母菌株接種于葡萄糖-萘培養(yǎng)基中，25_27°C，150rpm培養(yǎng)至培養(yǎng)液的OD6tltl值達(dá)到0. 4-0. 6，獲得處理油田廢水的菌株接種母液，然后將接種母液與油田廢水混合均勻。其中，所述葡萄糖-萘培養(yǎng)基組成如下滅菌純凈水1L，葡萄糖10g，萘lOOmg，KH2PO4 lg, (NH4)2SO4 0. 5g，MgSO4 7H20 0. 5g，酵母提取物 0. 5g，pH 5_6，培養(yǎng)基在 121。。下恒溫滅菌20分鐘。特別是，將所述季也蒙畢赤酵母菌株接種于葡萄糖-萘培養(yǎng)基的過(guò)程中，每IOOml葡萄糖-萘培養(yǎng)基中接種ー接種環(huán)的季也蒙畢赤酵母菌株。本發(fā)明又一方面提高ー種利用酵母菌株P(guān)ichia gui I liermondii AH2處理油田廢水的方法。本發(fā)明利用酵母菌株P(guān)ichia gui I liermondii AH2對(duì)油田廢水中的有機(jī)物進(jìn)行降解處理，向廢水中加入所述酵母菌，攪拌均勻，處理20-24小吋。
本發(fā)明的酵母菌株P(guān)ichia gui I liermondii AH2 CGMCC No. 4813是一株具有極高活力，對(duì)疏水性有機(jī)污染物降解能力極強(qiáng)的菌株，其培養(yǎng)方法簡(jiǎn)單，生長(zhǎng)速度快，不易變異，可以用于生產(chǎn)表面活性劑和降解疏水性有機(jī)污染物，尤其適用于石油、石油化工、鋼鐵、焦化、煤氣發(fā)生站、機(jī)械加工等エ業(yè)部門產(chǎn)生的含有廢水的降解處理，在降解含有疏水性有機(jī)污染物廢水方面具有エ業(yè)化應(yīng)用的前景。


圖I 是酵母菌株 P. gui I liermondii AH2 CGMCC No. 4813 細(xì)胞形態(tài)圖；圖2是酵母菌株在十六烷烴培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)的生長(zhǎng)曲線圖；圖3是酵母菌株在萘培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)的生長(zhǎng)曲線圖；圖4是酵母菌株在菲培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)對(duì)菲的降解曲線圖。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)ー步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法，所有百分比濃度均為質(zhì)量百分比濃度，所有培養(yǎng)基中的溶劑均為純凈水。 實(shí)施例I酵母菌株的分離及純化I、培養(yǎng)基制備(I)基本培養(yǎng)基(NH4)2SO4 lg, K2HPO4 0. 8g, KH2PO4 0. 2g, MgSO4 7H20 0. 2g, CaCl2 2H20 0. lg,FeSO4 7H20 5mg, ImL過(guò)濾除菌的維他命溶液，純凈水1，OOOmL, pH 5-6，培養(yǎng)基在121°C下恒溫滅菌20分鐘。維他命溶液的組成如下煙酸IOOmg,維生素BI IOOmg,生物素5mg,對(duì)氨基苯甲酸50mg，維生素 B12 lmg，泛酸鈣 50mg，維生素 B6 50mg，微生素 M 50mg, 3Na EDTA 200mg，滅菌純凈水稀釋至100mL。(2)富集培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基中添加菲溶液0. 2%，調(diào)節(jié)pH值為5-6，培養(yǎng)基在121°C下恒溫滅菌20分鐘；其中菲溶液組成為lg菲，IL正己烷。(3)分離、純化培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基中添加菲溶液0. 2%，瓊脂2%，調(diào)節(jié)pH值為5-6，培養(yǎng)基在121°C下恒溫滅菌20分鐘；其中菲溶液組成為lg菲，IL正己烷。平板分離、純化培養(yǎng)基將分離、純化培養(yǎng)基煮好后趁熱裝于500ml的三角瓶中，用牛皮紙封ロ后于121°C高壓滅菌20mim。滅菌后趁熱移至無(wú)菌超凈工作臺(tái)，分裝于60cmX I. 3cm的平皿中，裝液量為13ml，將平板水平擺放，待培養(yǎng)基冷卻后備用。斜面分離、純化培養(yǎng)基將分離、純化培養(yǎng)基煮好后趁熱分裝于5ml的離心管中，裝液量為I. 8ml，裝于離心管架上，于121 °C高壓滅菌20mim，滅菌后將離心管架傾斜擺放使培養(yǎng)基成一斜面?zhèn)溆谩?br> (4)十六烷烴培養(yǎng)基十六烷烴8g，KH2PO4 lg, (NH4)2SO4 0. 5g，MgSO4 7H20 0. 5g，酵母提取物 0. 5g，純凈水lOOOmL，pH 5-6，培養(yǎng)基在121°C下恒溫滅菌20分鐘；(5)萘培養(yǎng)基萘lOOmg, KH2PO4 lg, (NH4) 2S04 0. 5g，MgSO4 7H20 0. 5g，酵母提取物 0. 5g，純凈水IOOOmL, pH 5-6，培養(yǎng)基在121°C下恒溫滅菌20分鐘；(6)菲培養(yǎng)基菲20mg, KH2PO4 lg, (NH4)2SO4 0. 5g，MgSO4 7H20 0. 5g，酵母提取物 0. 5g，純凈水IOOOmL, pH 5-6，培養(yǎng)基在121°C下恒溫滅菌20分鐘； (7)含萘混合培養(yǎng)基滅菌純凈水1L，十六烷烴 8g，萘 lOOmg, KH2PO4 lg, (NH4)2SO4 0. 5g，MgSO4 7H20
0.5g，酵母提取物0. 5g，調(diào)節(jié)pH 5-6，培養(yǎng)基在121°C下恒溫滅菌20分鐘。(8)含菲混合培養(yǎng)基滅菌純凈水1L，十六烷烴 8g，菲 20mg，KH2P04 lg, (NH4)2SO4 0. 5g, MgSO4 *7H200. 5g，酵母提取物0. 5g，調(diào)節(jié)pH 5-6，培養(yǎng)基在121°C下恒溫滅菌20分鐘。(9) YH)培養(yǎng)基酵母浸粉5g,牛肉膏蛋白胨IOg,葡萄糖IOg,去離子水1L,pH 5.0。培養(yǎng)基使用前在115°C下滅菌20分鐘。(IO)YPD固體培養(yǎng)基酵母浸粉5g,牛肉膏蛋白胨IOg,葡萄糖IOg,去離子水1L,固體培養(yǎng)基則加入2%的瓊脂，PH 5. O。培養(yǎng)基使用前在115°C下滅菌20分鐘。(11)葡萄糖-萘培養(yǎng)基滅菌純凈水1L，葡萄糖 10g，萘 lOOmg，KH2PO4 lg, (NH4)2SO4 0. 5g，MgSO4 *7H200. 5g，酵母提取物0. 5g，pH 5-6，培養(yǎng)基在121°C下恒溫滅菌20分鐘。2、富集培養(yǎng)稱取Ig采集于河北冀東油田采油場(chǎng)油井周圍的原油污染土壌，加入IOml滅菌水，制成懸浮液，接著加入富集培養(yǎng)基，于27°C，150rpm振蕩，進(jìn)行富集培養(yǎng)，直至得到0D_為
0.5的富集培養(yǎng)液。3、分離、純化培養(yǎng)將富集培養(yǎng)液在平板分離、純化培養(yǎng)基上劃線分離培養(yǎng)，放入恒溫培養(yǎng)箱中于27°C下培養(yǎng)至平板上長(zhǎng)出單個(gè)菌落，挑取形成的單個(gè)菌落，劃線接種于斜面分離、純化培養(yǎng)基中，于27°C進(jìn)行培養(yǎng)，對(duì)斜面培養(yǎng)物進(jìn)行顯微鏡檢查，如果獲得的斜面培養(yǎng)物菌種不純，則挑取斜面培養(yǎng)物劃線接種于斜面分離、純化培養(yǎng)基中繼續(xù)純化，直到顯微鏡檢查結(jié)果表明為純菌為止；經(jīng)純化得到純酵母菌菌株。實(shí)施例2酵母菌株的微生物學(xué)特性研究I、菌落形態(tài)觀察將純化培養(yǎng)得到的酵母菌菌株劃線接種于YPD固體培養(yǎng)基中，于27°C下培養(yǎng)至長(zhǎng)出菌落，觀察菌落形態(tài)，結(jié)果如下菌株的菌落特征為在YPD固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)2天的菌落直徑大小為3_4mm，菌落呈圓形，表面光滑，邊緣整齊，突出，白色。2、細(xì)胞形態(tài)觀察將菌株接種于YPD培養(yǎng)基中，在27°C，150rpm下培養(yǎng)至培養(yǎng)液的OD6tltl為0. 5，用顯微鏡觀察培養(yǎng)液中菌株的細(xì)胞形態(tài)，觀察結(jié)果如圖I所示，酵母菌的細(xì)胞為球形，成熟細(xì)胞直徑約5um。3、26S rDNA基因序列測(cè)定 將酵母菌接種于YPD培養(yǎng)基中，于27°C，150rpm培養(yǎng)8小時(shí)后，離心收集酵母菌細(xì)胞，用生理鹽水重新懸浮后，反復(fù)凍融，加玻璃珠震蕩破壁，用酚-氯仿法提取DNA，采用正向引物 NLl (5' -GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3')和反向引物 NL4(5' -GGTCCG TGT TTC AAG ACG G_3')對(duì)菌株的26S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序；其中，PCR反應(yīng)體系為50 uし反應(yīng)混合液包括3ng模板DNA，IOpmol引物，2. 5units Taq酶，10XPCR緩沖液(包含2. 5mM MgC12)，IOnmolDNTP和適量的雙蒸水。PCR條件為95°C，IOmin -M0C，lmin, 55°C，lmin, 72°C，Imin ；30 個(gè)循環(huán)，72°C，IOmin, 4°C保存；測(cè)序結(jié)果見序列表，其中，菌株的26S rDNA(SEQ ID NO. I)序列長(zhǎng)度為574bp。根據(jù)菌株的菌落形態(tài)特征，細(xì)胞形態(tài)特征以及其26S rDNA基因序列的比對(duì)結(jié)果，鑒定菌株屬于 Pichia gui I liermondii o酵母菌菌株已于2011年4月28日保藏于“中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心”，其菌株名稱為季也蒙畢赤酵母Pichia guilliermondiiAH2，在“中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心”的保藏編號(hào)為CGMCC No. 4813。實(shí)施例3李也蒙畢赤酵母菌株P(guān)ichia gui I liermondii AH2的培養(yǎng)I)配制酵母菌株P(guān)ichia gui I liermondii AH2的接種母液取酵母菌株P(guān)ichia gui I liermondii AH2的新鮮斜面菌種，接種于萘培養(yǎng)基中，27 °C，150rpm進(jìn)行培養(yǎng)，并測(cè)定培養(yǎng)液的OD6tltl值，直到OD6tltl值達(dá)到0. 5，獲得P. gui I liermondii AH2菌的接種母液，其中，姆IOOml萘培養(yǎng)基中接種ー接種環(huán)的P. gui I liermondii AH2 菌種。2)十六烷烴培養(yǎng)基培養(yǎng)將菌株P(guān). gui I liermondii AH2 CGMCC No. 4813的接種母液接種于十六烷烴培養(yǎng)基中，其中，接種量為1% (V/V)，即接種母液與十六烷烴培養(yǎng)基的體積之比為I : 100，然后在黑暗條件下，于27°C，150rpm進(jìn)行培養(yǎng)，每6小時(shí)測(cè)定培養(yǎng)液的0D_值，測(cè)定48小時(shí)，測(cè)定結(jié)果如附圖2示。測(cè)定結(jié)果表明菌株P(guān).guilliermondii AH2 CGMCC No. 4813 在接種后 6_36h 為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌株快速生長(zhǎng)，在培養(yǎng)12h后，培養(yǎng)液的0D_即達(dá)到I. 2左右，在培養(yǎng)36h后菌株生長(zhǎng)速度趨于平緩，達(dá)到生長(zhǎng)穩(wěn)定期。菌株P(guān). guilliermondii AH2CGMCC No. 4813在十六烷烴培養(yǎng)基生長(zhǎng)狀態(tài)良好，能夠有效利用十六烷烴作為其生長(zhǎng)的碳源進(jìn)行生長(zhǎng)。3)萘培養(yǎng)基培養(yǎng)將菌株P(guān). guilliermondii AH2 CGMCC No. 4813的接種母液接種于萘培養(yǎng)基中，其中，接種量為0.1% (v/v)，即接種母液與萘培養(yǎng)基的體積之比為0.1 100，然后在黑暗條件下，于27°C，150rpm進(jìn)行培養(yǎng)，每天定時(shí)測(cè)定培養(yǎng)液的0D_值，測(cè)定7天，測(cè)定結(jié)果如附圖3示。
測(cè)定結(jié)果表明菌株P(guān). guilliermondii AH2 CGMCC No. 4813在接種于萘培養(yǎng)基后2-7天為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌株快速生長(zhǎng)，且生長(zhǎng)良好，在第7天時(shí)培養(yǎng)液的OD6tltl可以達(dá)到0. 5左右。4)菲培養(yǎng)基培養(yǎng)將菌株P(guān). guilliermondii AH2CGMCC No. 4813的接種母液接種于菲培養(yǎng)基中，其中，接種量為0.1% (v/v)，即接種母液與菲培養(yǎng)基的體積之比為0.1 100，然后在黑暗條件下，于27°C，150rpm進(jìn)行培養(yǎng)，每天定時(shí)測(cè)定培養(yǎng)液中菲的殘留率，測(cè)定7天，測(cè)定結(jié)果如附圖4示。測(cè)定結(jié)果表明菌株P(guān). guilliermondii AH2能夠利用菲作為卩隹一碳源進(jìn)行生長(zhǎng)，菌株培養(yǎng)7天可以使培養(yǎng)基中的菲含量降至35%，說(shuō)明菌株P(guān). guilliermondiiAH2對(duì)底物菲具有良好的降解作用。

實(shí)施例4菌株P(guān)ichia guilliermondii AH2產(chǎn)表面活性劑試驗(yàn)I、配制酵母菌株P(guān)ichia guilliermondii AH2的接種培養(yǎng)液取酵母菌株P(guān)ichia guilliermondii AH2的新鮮斜面菌種，接種于萘培養(yǎng)基中，27 °C，150rpm進(jìn)行培養(yǎng)，并測(cè)定培養(yǎng)液的OD6tltl值，直到OD6tltl值達(dá)到0. 5，獲得P. guilliermondii AH2菌的接種培養(yǎng)液，其中，姆IOOml基本培養(yǎng)基中接種ー接種環(huán)的P. guilliermondii AH2 菌種。2、以十六烷烴培養(yǎng)基的產(chǎn)表面活性劑試驗(yàn)將菌株P(guān). guilliermondii AH2 CGMCC No. 4813的接種培養(yǎng)液接種于十六烷烴培養(yǎng)基中，其中，接種量為為1% (v/v)，即接種培養(yǎng)液與十六烷烴培養(yǎng)基的體積之比為I 100，在黑暗條件下，于27°C，150rpm的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，得到含有表面活性劑的培養(yǎng)液。I)采用表面張カ儀測(cè)定接種前培養(yǎng)基和培養(yǎng)24小時(shí)、96小時(shí)后的培養(yǎng)液的表面張力，測(cè)定結(jié)果如表I所示。2)將8mL液體石蠟加入裝有60mL蒸餾水的直徑為9cm的培養(yǎng)皿中，待整個(gè)平板形成ー層分散均勻的薄膜后，用微量移液器在油膜中心加入IuL培養(yǎng)96小時(shí)后得到的培養(yǎng)液，觀察培養(yǎng)皿中的排油圈大小，測(cè)定排油圈直徑，測(cè)定結(jié)果如表I所示。3)采用GC-MASS方法測(cè)定培養(yǎng)前各培養(yǎng)基和培養(yǎng)24小吋、96小時(shí)后培養(yǎng)液中十六烷烴的濃度，測(cè)定結(jié)果見表I。3、以含萘混合培養(yǎng)基、含菲混合培養(yǎng)基培養(yǎng)的產(chǎn)表面活性劑試驗(yàn)將菌株P(guān). guilliermondii AH2 CGMCC No. 4813的接種培養(yǎng)液接種于含萘混合培養(yǎng)基、含菲混合培養(yǎng)基中，在黑暗條件下，于27°C，150rpm的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，得到不同的培養(yǎng)液；其中，接種量為為0. 1% (v/v)，即接種培養(yǎng)液分別與含萘混合培養(yǎng)基、含菲混合培養(yǎng)基的體積之比為0.1 100。I)采用表面張カ儀測(cè)定接種前培養(yǎng)基和培養(yǎng)4天后的培養(yǎng)液的表面張力，測(cè)定結(jié)果如表2所示。2)將8mL液體石蠟加入裝有60mL蒸餾水的直徑為9cm的培養(yǎng)皿中，待整個(gè)平板形成ー層分散均勻的薄膜后，用微量移液器在油膜中心加入IuL培養(yǎng)4天后得到的培養(yǎng)液，觀察培養(yǎng)皿中的排油圈大小，測(cè)定排油圈直徑，測(cè)定結(jié)果如表2所示。
3)采用GC-MASS方法測(cè)定培養(yǎng)前各培養(yǎng)基和培養(yǎng)4天后各培養(yǎng)液中十六烷烴、萘、菲的濃度，測(cè)定結(jié)果見表3。表I菌株以十六烷為培養(yǎng)基時(shí)產(chǎn)表面活性劑試驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一株季也蒙畢赤酵母(Pichia guiIIiermondii)菌株,其特征是其微生物保藏編號(hào)為 CGMCC No. 4813。
2.ー種利用如權(quán)利要求I所述季也蒙畢赤酵母菌株生產(chǎn)表面活性劑的方法，其特征是將所述季也蒙畢赤酵母菌株接種于培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)，即得；其中所述的培養(yǎng)基為烷烴培養(yǎng)基或含有多環(huán)芳烴的混合培養(yǎng)基。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征是所述烷烴培養(yǎng)基含有Cltl-C24烷烴中的ー種或多種；優(yōu)選的，所述烷烴培養(yǎng)基是十六烷烴培養(yǎng)基，其組成如下十六烷烴8g，KH2PO4 Ig,(NH4)2SO4 0. 5g，MgSO4 7H20 0. 5g，酵母提取物 0. 5g，純凈水 I, OOOmL, pH5_6。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征是所述含有多環(huán)芳烴的混合培養(yǎng)基選擇含萘混合培養(yǎng)基或含菲混合培養(yǎng)基；優(yōu)選的，所述含萘混合培養(yǎng)基的組成如下十六烷烴Sg，萘IOOmg, KH2PO4 lg, (NH4) 2804 0. 5g，MgSO4 7H20 0. 5g，酵母提取物 0. 5g，純凈水 I, OOOmL, pH5-6 ;優(yōu)選的，所述含菲混合培養(yǎng)基的組成如下十六烷烴8g，菲20mg，KH2PO4 lg, (NH4)28040. 5g，MgSO4 7H20 0. 5g，酵母提取物 0. 5g，純凈水 1，OOOmL, pH 5-6。
5.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征是所述振蕩培養(yǎng)是在以下條件下進(jìn)行黑暗條件，溫度為25-27°C，轉(zhuǎn)速為150-170rpm，振蕩培養(yǎng)時(shí)間為72_168h。
6.權(quán)利要求I所述季也蒙畢赤酵母菌株在降解疏水性有機(jī)物中的應(yīng)用。
7.按照權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征是將所述季也蒙畢赤酵母菌株接種于含有疏水性有機(jī)物的污染物中，進(jìn)行酵母菌培養(yǎng)。
8.按照權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征是所述培養(yǎng)溫度為25-27°C。
9.權(quán)利要求I所述季也蒙畢赤酵母菌株在浄化處理油田廢水中的應(yīng)用。
10.按照權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征是向油田廢水中加入所述季也蒙畢赤酵母菌株，攪拌均勻，處理20-24小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株產(chǎn)表面活性劑的季也蒙畢赤酵母菌株P(guān)ichia guilliermondii AH2CGMCC No.4813，能夠以C10-C24烷烴和/或多環(huán)芳烴為碳源進(jìn)行生長(zhǎng)，在以烷烴為碳源生長(zhǎng)的同時(shí)能夠產(chǎn)生表面活性劑，且對(duì)疏水性有機(jī)物包括烷烴和多環(huán)芳烴具有良好的降解作用，酵母菌株在采油廢水處理方面具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C02F101/30GK102766579SQ201110115650
公開日2012年11月7日 申請(qǐng)日期2011年5月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月5日
發(fā)明者呂文洲, 張昱, 楊敏, 鄧艷芹, 黑山姆 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心