專利名稱：一種基于基因強(qiáng)化與細(xì)胞強(qiáng)化耦合的生物強(qiáng)化新方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基于基因強(qiáng)化與細(xì)胞強(qiáng)化耦合的生物強(qiáng)化新方法，可達(dá)到污染系統(tǒng)或生物 反應(yīng)器中目標(biāo)污染物的高效穩(wěn)定去除，屬于環(huán)境保護(hù)與資源綜合一水污染防治領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
生物強(qiáng)化(Bioaugmentation)技術(shù)是通過向污染系統(tǒng)中投加具有特殊代謝功能的微生物， 來促進(jìn)目標(biāo)污染物降解的一種方法。該方法在難降解有機(jī)污染物治理中具有獨(dú)特的優(yōu)越性和 廣泛的應(yīng)用前景。從發(fā)生機(jī)制上分，生物強(qiáng)化可分為細(xì)胞強(qiáng)化(Cell augmentation)和基因強(qiáng) 化(Gene-augmentation)。細(xì)胞強(qiáng)化是利用微生物細(xì)胞本身的代謝功能對(duì)環(huán)境污染物直接進(jìn)行 分解，基因強(qiáng)化則向系統(tǒng)中引入編碼特殊降解功能的可移動(dòng)基因片斷(Mobile genetic dements, MGES),通過基因片斷在微生物細(xì)胞間的水平轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散，使固有菌群獲得特殊降解功能， 進(jìn)行目標(biāo)污染物的分解。
傳統(tǒng)意義上的生物強(qiáng)化技術(shù)主要指細(xì)胞強(qiáng)化。從自然界篩選或通過基因工程方法構(gòu)建高 效降解菌，擴(kuò)大培養(yǎng)后加入到污染系統(tǒng)或反應(yīng)器中，以達(dá)到改善系統(tǒng)性能或強(qiáng)化污染物去除 的目的。由于采用細(xì)胞強(qiáng)化投加的高效菌多為外源微生物，高效菌投加到污染系統(tǒng)后往往會(huì) 因無法適應(yīng)實(shí)際環(huán)境而喪失活性或代謝功能，或?qū)υ到y(tǒng)微生物菌群平衡產(chǎn)生較大破壞作用。 如Bouchez等向硝化反應(yīng)器加入好氧脫氮菌Mkrovi;^/fl flero血""n力ca"j,以期達(dá)到同時(shí)硝 化反硝化的目的。加入6.6%好氧脫氮菌時(shí)，只是收到了短暫的脫氮效果，當(dāng)4天后再次加入 37.1%好氧脫氮菌，投菌量過大破壞了原來生態(tài)系統(tǒng)的平衡，導(dǎo)致原生動(dòng)物生長(zhǎng)過多和硝化效 果的波動(dòng)。Ghyoot等向傳統(tǒng)活性污泥系統(tǒng)加入降解3-氯代苯甲酸(3-CBA)的純菌 ftewrfowowwp^WaBN210，因其適應(yīng)實(shí)際環(huán)境能力差而無法發(fā)揮促進(jìn)3-CBA的降解的作用。 基因強(qiáng)化是通過可移動(dòng)基因片斷的水平轉(zhuǎn)移而促使強(qiáng)化系統(tǒng)中固有菌群產(chǎn)生特殊降解能 力，它是對(duì)固有菌群基因組進(jìn)行原位修飾的一種方法，與細(xì)胞強(qiáng)化相比，其優(yōu)點(diǎn)在于(1) 基因強(qiáng)化過程中，供體細(xì)胞只是作為基因載體，故對(duì)供體細(xì)胞的環(huán)境適應(yīng)和存活能力的要求 比較低；(2)基因強(qiáng)化過程一般以固有菌群作為基因受體細(xì)胞，固有菌本身具備良好的環(huán)境 適應(yīng)和生存能力，其數(shù)量和活性易于在系統(tǒng)中保持；而細(xì)胞強(qiáng)化所采用的外源微生物往往適 應(yīng)污染環(huán)境能力比較差。
早在1994年，DeRore等以攜帶質(zhì)粒RP4::Tn4371的五"fera6acfer agg/omerara ￡>iG菌為供 體細(xì)胞，證實(shí)了質(zhì)粒水平轉(zhuǎn)移對(duì)土壤中聯(lián)苯的強(qiáng)化降解作用。后來'雖然許多研究人員嘗試了不同質(zhì)粒介導(dǎo)下基因強(qiáng)化對(duì)土壤系統(tǒng)、活性污泥及生物膜反應(yīng)器中目標(biāo)污染物的強(qiáng)化降解 效應(yīng)。但總體看來,基因強(qiáng)化用于環(huán)境污染物去除的效應(yīng)并不十分穩(wěn)定。如Bathe研究了 SBBR 系統(tǒng)攜帶pJP4質(zhì)粒的基因工程菌對(duì)2，4-D的強(qiáng)化降解效應(yīng)。發(fā)現(xiàn)投加工程菌后以2,4-D為唯 一碳源按8h/周期運(yùn)行了 8d，期間基因強(qiáng)化效果并不顯著，隨后以卯h/周期運(yùn)行2個(gè)周期， 基因強(qiáng)化效果才顯示出來；Bathe以攜帶pNB2質(zhì)粒的基因工程菌/^eW0OT0"aj pW必pA^2 為供體菌，以半連續(xù)流實(shí)驗(yàn)研究了質(zhì)粒介導(dǎo)下基因強(qiáng)化對(duì)目標(biāo)污染物3-氯苯胺的降解效應(yīng)， 發(fā)現(xiàn)在運(yùn)行前期幾乎無強(qiáng)化效果。但Yarlagadda研究了質(zhì)粒TOL介導(dǎo)對(duì)好氧顆粒污泥強(qiáng)化降 解目標(biāo)污染物苯乙醇的效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)連續(xù)九個(gè)反應(yīng)周期強(qiáng)化體系對(duì)苯乙醇的去除效率均比對(duì)照 體系高70%。分析以上基因強(qiáng)化效應(yīng)不穩(wěn)定的原因有直接向反應(yīng)系統(tǒng)投加攜MGEs的供體 菌，受到反應(yīng)運(yùn)行條件和微生物自身特性限制，基因水平轉(zhuǎn)移效率較低，在短時(shí)間內(nèi)很難形 成大量對(duì)目標(biāo)污染物具有降解作用的接合子，阻礙的基因強(qiáng)化作用的發(fā)揮。
綜上分析，細(xì)胞強(qiáng)化雖然具有啟動(dòng)快、效率高等特點(diǎn)，但高效菌篩選時(shí)間長(zhǎng)、難度大、實(shí) 際環(huán)境適應(yīng)能力差，投加后對(duì)系統(tǒng)固有菌群平衡影響大?；驈?qiáng)化是通過向污染系統(tǒng)中投加 攜帶可移動(dòng)基因片斷的功能微生物并通過基因水平轉(zhuǎn)移使固有微生物獲得特殊降解功能，促 進(jìn)目標(biāo)污染物的降解。這種方法雖然一定程度上克服了細(xì)胞強(qiáng)化過程外源高效菌環(huán)境適應(yīng)能 力差的問題，但由于可移動(dòng)基因片斷在反應(yīng)系統(tǒng)內(nèi)水平轉(zhuǎn)移的效率有限，基因強(qiáng)化往往存在 效應(yīng)滯后、不顯著等問題。鑒于細(xì)胞強(qiáng)化或基因強(qiáng)化單獨(dú)應(yīng)用存在的不足，有必要通過細(xì)胞 強(qiáng)化與基因強(qiáng)化技術(shù)耦合，開發(fā)高效穩(wěn)定的生物強(qiáng)化新方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提出一種生物強(qiáng)化新方法，它將細(xì)胞強(qiáng)化與基因強(qiáng)化技術(shù)有效耦合， 克服了細(xì)胞強(qiáng)化中存在的高效菌篩選時(shí)間長(zhǎng)、難度大、適應(yīng)實(shí)際環(huán)境能力差的缺點(diǎn)，以及基 因強(qiáng)化應(yīng)用效果滯后、不穩(wěn)定等問題，具有操作簡(jiǎn)單，見效快，效果穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的方案是以攜帶可移動(dòng)功能基因片斷(MGEs)的微生物 作為供體菌，從擬實(shí)施生物強(qiáng)化系統(tǒng)中取微生物樣品作為受體菌，通過系統(tǒng)外預(yù)接觸雜交反 應(yīng)，形成接合子將雜交后的微生物混合液進(jìn)行選擇性富集培養(yǎng)，獲得對(duì)目標(biāo)污染物具有高 效降解性能的接合子細(xì)胞及其它微生物，然后以其為菌源發(fā)酵培養(yǎng)制備成高效菌劑；最后將 一定量高效菌劑按一定方式投加到擬實(shí)施生物強(qiáng)化的系統(tǒng)中'以達(dá)到系統(tǒng)目標(biāo)污染物強(qiáng)化去 除的目的。
供體菌攜帶的可移動(dòng)基因片斷包括質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座元件及其它可移動(dòng)基因片斷'基因片斷上 含有編碼目標(biāo)物降解的完整的功能基因簇；生物樣品取自擬開展生物強(qiáng)化的污染系統(tǒng)(如土壤、水體)或生物反應(yīng)器。
生物樣品與基因供體菌系統(tǒng)外預(yù)接觸雜交方法具體為以營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基對(duì)供體菌進(jìn)行擴(kuò)大
培養(yǎng)，然后進(jìn)行離心洗滌、收集，配成菌懸液；將生物樣品(土壤、沉積物或污泥)經(jīng)多次
離心洗滌后配成懸濁液將供體菌與生物樣品按1/10-1/1 (質(zhì)量比)混合，在25-35'C下振蕩 雜交反應(yīng)6—24h (懸浮雜交)，期間補(bǔ)充一定量的目標(biāo)污染物作為選擇壓力，同時(shí)添加一定 量易利用的有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物(如葡萄糖，乙酸鈉等)作為補(bǔ)充碳源；也可將供體菌與生物樣品的 混合液過濾到濾膜上，將濾膜取出放置營(yíng)養(yǎng)固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)6—24h (濾膜雜交)，最后將 濾膜上的微生物洗脫到滅過菌的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中。
雜交完成時(shí)雜交液中接合子數(shù)量較少，雜菌較多，需要進(jìn)一步選擇性富集培養(yǎng)，具體方 法為將雜交反應(yīng)液離心、洗滌后重懸于以一定量的目標(biāo)污染物為唯一碳源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基 中，培養(yǎng)36—96h。
高效降解菌的發(fā)酵培養(yǎng)與菌劑制備從經(jīng)過選擇性富集培養(yǎng)的反應(yīng)液中接種一定量的菌
液到營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24—48h,離心收集菌體制備成干菌劑或液態(tài)菌劑。
高效菌劑的生物強(qiáng)化投加向擬進(jìn)行生物強(qiáng)化的系統(tǒng)中直接或間接(如固定化)投加5 % —30%高效菌劑，即可達(dá)到強(qiáng)化降解目標(biāo)污染物的目的。
有益效果
(1) 本發(fā)明提出了利用攜帶可移動(dòng)基因片斷的基因供體菌與擬實(shí)施生物強(qiáng)化系統(tǒng)的微生 物樣品雜交反應(yīng)獲得高效降解菌菌源的方法，豐富了高效菌獲取途徑，與從自然界 篩選髙效微生物的方法相比，具有簡(jiǎn)單，快捷，獲取的菌株環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)--
(2) 利用本發(fā)明提出的基于基因強(qiáng)化與細(xì)胞強(qiáng)化耦合的生物強(qiáng)化方法進(jìn)行污染物強(qiáng)化降 解時(shí)，菌種投加量要比傳統(tǒng)生物強(qiáng)化方法降低10—20%，并可獲得更加高效、穩(wěn)定 的生物強(qiáng)化效果。


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圖1生物膜反應(yīng)器內(nèi)2,4-D的生物強(qiáng)化降解效應(yīng)
圖2模擬河流沉積物系統(tǒng)內(nèi)2，4-D的生物強(qiáng)化降解效應(yīng)
具體實(shí)施例方式
(1) 將攜帶可移動(dòng)功能基因片斷的微生物預(yù)培養(yǎng)到對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期后，離心收集菌體并用無菌 磷酸鹽緩沖溶液洗滌2 — 3次，最終重懸于無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，制備供體菌菌懸液；
(2) 從擬進(jìn)行生物強(qiáng)化系統(tǒng)中取微生物樣品作為基因強(qiáng)化的受體菌，如果樣品中微生物數(shù)量較低，可預(yù)先擴(kuò)培；如果微生物濃度較高，則可直接經(jīng)離心、洗滌后用無菌磷酸鹽緩 沖溶液配成菌懸液；
(3) 取供體菌和受體菌菌懸液，按照質(zhì)量比1/10-1/1混合，在25 — 30'C下振蕩培養(yǎng)6—24h 進(jìn)行懸浮雜交，或供受體菌混合后過濾到聚碳酸脂濾膜上，將濾膜置于營(yíng)養(yǎng)平板培養(yǎng)基 上進(jìn)行膜面雜交；
(4) 將雜交后的培養(yǎng)液以選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)36—96h，淘汰對(duì)目標(biāo)污染物不具有降解功能 的微生物，選擇性富集具有降解功能的接合子及其它微生物；然后再以其為接種液進(jìn)行 高效菌的發(fā)酵培養(yǎng)，并制備高效菌劑；
(5) 將上述高效菌劑按照5% —30%比例(投加菌/同有菌，質(zhì)量比)投加到擬進(jìn)行生物強(qiáng) 化的污染系統(tǒng)或生物反應(yīng)器中，接觸12h后即可開始正常的運(yùn)行階段。
實(shí)例1活性污泥反應(yīng)器中2,4-D的生物強(qiáng)化降解
2，4-二氯苯氧基乙酸是一種難降解有機(jī)污染物，普通活性污泥法對(duì)其降解效率較低。為了 強(qiáng)化活性污泥系統(tǒng)對(duì)該物質(zhì)的去除，采用了本發(fā)明中基于基因強(qiáng)化與細(xì)胞強(qiáng)化耦合的生物強(qiáng) 化新方法。具體如下
(1) 以攜帶質(zhì)粒pJP4 (其上含編碼2,4-D降解功能的基因簇(押))的基因工程菌/^Wowo"似
SM1443::g^&(pJP4::dsRed)為供體菌，以LB營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基將該菌擴(kuò)大培養(yǎng)36h,然后離心 收集菌體，并以無菌磷酸鹽緩沖溶液洗滌3次，最后制成菌懸液；
(2) 從活性污泥反應(yīng)器中取一定量的污泥，按照上述方法離心洗滌菌體，也以無機(jī)鹽培養(yǎng)基 制備成菌懸液；
(3) 雜交反應(yīng)取供體菌和活性污泥菌懸液，按照l: 1 (質(zhì)量比)加入到錐形瓶?jī)?nèi)，同時(shí)加 入2,4-D作為碳源(初始濃度為50mg/L)， 30'C， 150r/min下振蕩反應(yīng)12h;
(4) 選擇性富集培養(yǎng)雜交結(jié)束后，將雜交反應(yīng)液沉淀，棄上清，再次補(bǔ)充含2， 4-D的新鮮 無機(jī)鹽培養(yǎng)液，30°C, 150r/min下繼續(xù)培養(yǎng)50h;
(5) 高效菌的發(fā)酵培養(yǎng)從經(jīng)過選擇性富集培養(yǎng)的反應(yīng)液中接種lmL菌懸液到LB培養(yǎng)基中， 30°C， 150r/miii下培養(yǎng)36h，離心收集菌體并將其配成2,4-D降解高效菌劑；
(6) 高效菌投加強(qiáng)化活性污泥系統(tǒng)將高效菌劑按10%投加量直接投加到活性污泥系統(tǒng)，接 觸反應(yīng)6h，開始連續(xù)流運(yùn)行，2，4-D初始濃度為400mg/L，生物強(qiáng)化系統(tǒng)啟動(dòng)期縮短13h，去除 速率提高368%，高效菌能夠在系統(tǒng)中得到穩(wěn)定保持。
實(shí)例2生物膜反應(yīng)器內(nèi)2,4-D的生物強(qiáng)化降解以基因工程菌/^ewab/wwKM;wricfa SM1443::她2c(pJP4::dsRed)為供體菌，經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)、離心洗 滌后制備成菌懸液；取一定量活性污泥，將基因工程菌按10%投菌量加入到活性污泥中，同 時(shí)加入400mg/L 2,4-D并以半連續(xù)流方式進(jìn)行選擇性富集培養(yǎng)；培養(yǎng)過程取微生物樣品，用 2,4-D為唯一碳源的抗性平板篩選到能高效降解2，4-D的接合子。將接合子細(xì)胞以LB培養(yǎng)基擴(kuò) 大培養(yǎng)后，直按10%接投加到某一含懸浮填料為載體的生物膜反應(yīng)器中。對(duì)于初始濃度約為 180 mg/L的2,4-D，強(qiáng)化系統(tǒng)在44h可將初始濃度約為180 mg/L的2,4-D降解完全，而對(duì)照系統(tǒng) 經(jīng)過115對(duì)其去除率僅為75% (如圖l)。
實(shí)例3污染水體沉積物中2，4-D的生物強(qiáng)化降解
污染水體(河流及湖泊)中難降解有機(jī)物的去除受到普遍關(guān)注，尤其是對(duì)于寒冷季節(jié)北方地 表水中有機(jī)物的去除。通過基因水平轉(zhuǎn)移獲得2,4-D降解高效菌，對(duì)其擴(kuò)大培養(yǎng)后投加到河流 沉積物中，也可促進(jìn)2,4-D的降解。具體方法如下取一定量河流沉積物，加入無菌磷酸鹽溶 液，混合，然后按照供體菌沉積物-l: 10向沉積物中加入攜帶質(zhì)粒pJP4的供體菌，3(TC， 150r/min條件下接觸反應(yīng)48h，通過含抗性和2,4-D為唯一碳源的選擇性平板篩選到對(duì)2,4-D具 有強(qiáng)降解能力的接合子；接合子采用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)36h后，離心收集，并向沉積物中投加4% 的接合子；在反應(yīng)溫度為7'C, 2，4-D初始濃度為4.5mg/L條件下，生物強(qiáng)化系統(tǒng)2,4-D不經(jīng)延滯 期即開始降解，40d得到完全去除，而對(duì)照系統(tǒng)經(jīng)過約32d延滯期后才開始降解，50d后得到全 部去除(如圖2)。
權(quán)利要求
1.一種基于基因強(qiáng)化與細(xì)胞強(qiáng)化耦合的生物強(qiáng)化新方法，其特征在于(1)以攜帶可移動(dòng)功能基因片斷的微生物為供體菌，擬實(shí)施生物強(qiáng)化的污染系統(tǒng)或生物反應(yīng)中的土著微生物為受體菌，通過系統(tǒng)外的預(yù)接觸雜交反應(yīng)產(chǎn)生接合子；(2)從雜交后菌液中選擇性富集培養(yǎng)對(duì)目標(biāo)污染物具有高效降解性能的接合子及其它微生物，制備成高效菌劑。(3)向擬實(shí)施生物強(qiáng)化的污染系統(tǒng)或生物反應(yīng)中按照一定方式投加一定量的該高效菌劑，以達(dá)到目標(biāo)污染物強(qiáng)化去除的目的。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的可移動(dòng)基因片斷，包括質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座元件及其它可移動(dòng)基因片斷；
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的預(yù)接觸雜交反應(yīng)，可采用懸浮雜交和膜面雜交兩種方式，雜交時(shí)供 受體菌比例為1/10-1/1,雜交時(shí)間6—24h。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效菌選擇性富集培養(yǎng)方法，具體為將雜交后的菌懸液以一定量 的目標(biāo)污染物為唯一選擇壓，培養(yǎng)36—96h，再以其為菌源采用營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)24—48h。
5. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的向污染系統(tǒng)投加高效菌的方法，可采用直接投加或固定化投加的方 式，投加量為5—30%。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于基因強(qiáng)化與細(xì)胞強(qiáng)化耦合的生物強(qiáng)化新方法。首先，以攜帶可移動(dòng)功能基因片斷的微生物為供體菌，以擬實(shí)施生物強(qiáng)化系統(tǒng)內(nèi)的固有微生物為受體菌，通過預(yù)雜交反應(yīng)及選擇性富集培養(yǎng)，獲得對(duì)目標(biāo)污染物具有高效降解性能的接合子及其它微生物；再以其為生物強(qiáng)化的菌源，通過發(fā)酵培養(yǎng)制備高效菌劑；向擬實(shí)施生物強(qiáng)化的污染系統(tǒng)中按一定方式投加5％-30％(投加菌與固有菌質(zhì)量比)高效菌劑，即可達(dá)到強(qiáng)化污染物去除的目的。本發(fā)明與傳統(tǒng)生物強(qiáng)化方法相比，具有高效菌源易得、環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，菌劑投加量少，對(duì)固有系統(tǒng)菌群結(jié)構(gòu)影響小，見效快，效果穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C02F3/34GK101549911SQ20091000054
公開日2009年10月7日 申請(qǐng)日期2009年1月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月16日
發(fā)明者何孟常, 全向春, 楊志峰, 林春野, 華 湯 申請(qǐng)人:北京師范大學(xué)