不對稱菁類熒光染料，組合物及在生物樣品染色中的用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及熒光染料，具體地講，本發(fā)明涉及適合用于生物樣品染色的不對稱菁 類熒光染料，包含所述熒光染料的組合物及其在生物樣品染色中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 熒光分析技術(shù)由于激光、微處理機(jī)和電子學(xué)等一些新的科學(xué)技術(shù)的引入和飛速發(fā) 展，極大地推動(dòng)了熒光分析的廣泛應(yīng)用。尤其近年來以熒光染料為標(biāo)識劑的生物芯片的出 現(xiàn)，使該技術(shù)在細(xì)胞免疫學(xué)、微生物學(xué)、分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)、病理學(xué)、臨床檢驗(yàn)學(xué)、植物 學(xué)等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。熒光染料的開發(fā)是發(fā)展熒光分析技術(shù)的具有決定性作用的 因素。
[0003] 早期應(yīng)用的染料包括新亞甲藍(lán)(NMB)、亮甲苯藍(lán)(BCB)、派諾寧Y、溴乙錠等。它們通 過嵌入或靜電吸引與核酸分子形成復(fù)合物，從而可以在顯微鏡下觀察增強(qiáng)后的熒光。但是 這些染料自身也可以形成染料復(fù)合物，不能明顯區(qū)別于染料與核酸形成的復(fù)合物，造成高 的熒光背景干擾。同時(shí)，這些染料的熒光量子效率較低，降低了熒光增強(qiáng)的程度，影響檢測 結(jié)果的準(zhǔn)確性。
[0004] 吖啶橙也應(yīng)用在熒光分析中，可以和核酸形成復(fù)合物，使熒光增強(qiáng)。這類染料分子 相互之間在能量傳遞的過程中可能會導(dǎo)致光淬滅，使得染料核酸復(fù)合物沒有熒光發(fā)出，影 響檢測結(jié)果真實(shí)性。同時(shí)在流式細(xì)胞分析儀中，吖啶橙和塑料管路有較強(qiáng)的作用，會增加背 景熒光強(qiáng)度。為了清除測試后殘留的染料和保證測試結(jié)果的準(zhǔn)確性，需要儀器進(jìn)行長時(shí)間 的管路清洗，這就降低了儀器的分析效率。
[0005] 美國專利4957870提出了一類噻唑藍(lán)染料用于檢測核酸和血液中的網(wǎng)織紅細(xì)胞。 該類染料使用的激發(fā)波長在488nm，需要使用價(jià)格高昂的激光器做光源，增加了儀器的使用 成本。同時(shí)，這類染料需要較長的孵育時(shí)間，才能和核酸較好的結(jié)合。
[0006] 美國專利5994138公開了一種用于血液中網(wǎng)織紅細(xì)胞染色的染料，它需要在35°C 以上的反應(yīng)條件下才能得到良好的檢測結(jié)果，對儀器的使用條件提出了較高的要求。
[0007] 目前使用的菁類熒光染料，如1'(^^、1'01'預(yù)、1'0-?肋-3、？0-?1?0-2和肋-?1?0-2等 [K.M.Sovenyhazy，J.A.Bordelon，J.T.Petty.Nucleic Acids Res,2003,31,2561]，它們的 吸收和發(fā)射都在近紅外區(qū)(670-1000nm)，但這類染料的分子結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，合成路線較長， 收率較低，因而價(jià)格高，限制了其使用范圍。
[0008]因此，需要開發(fā)新的熒光染料，該熒光染料優(yōu)選具有以下性質(zhì):無核酸時(shí)染料自身 不發(fā)熒光，與核酸形成復(fù)合物后時(shí)具有良好的熒光量子產(chǎn)率，光譜在近紅外區(qū)，避免背景熒 光的干擾;可以在633nm附近被激發(fā)，從而可以使用價(jià)格低廉的激光器作為激發(fā)光源;具有 一定水平的水溶性，同時(shí)具有一定的穿過細(xì)胞膜的能力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的上述種種目的通過提供本發(fā)明化合物而得以實(shí)現(xiàn)。因此，本發(fā)明一方面
[0010]
[0011]
[0012] n為 1、2或 3;
[0013] X為C(CH3)2、0、S或 Se;
[0014] RjPR2各自獨(dú)立選自H、0H、18烷基、&-6烷基0R 5、&-18烷基磺酸基、苯基或鹵素；
[0015] R3、R4各自獨(dú)立選自d-18烷基COOR^Ci-18烷基0R 6、芐基，其中芐基由選自以下的取 代基任選取代：?'素、羥基、疏基、氛基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、雜環(huán)基、鹵代烷基、氣基、 烷基氨基、酰氨基、羧基，條件是R3和R4不同時(shí)為芐基;且R3為芐基時(shí)R4不為&-18烷基0R 6;
[0016] 抱為&―18烷基或者Η;
[0017] 1?6為&-18烷基、Η或者苯基，其中苯基由選自以下的取代基任選取代:鹵素、羥基、巰 基、氛基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、雜環(huán)基、鹵代烷基、氣基、烷基氣基、醜氣基、駿基；
[0018] Υ-為負(fù)離子。
[0019] 本發(fā)明還一方面提供一種綴合物，所述綴合物包含上述式I化合物。
[0020] 本發(fā)明另一個(gè)方面還提供用于生物樣品染色的組合物，所述組合物包含上述式I 化合物或其綴合物。
[0021] 本發(fā)明再一方面還提供了本發(fā)明式I化合物或其綴合物或組合物在對生物樣品進(jìn) 行染色中的用途。
[0022] 本發(fā)明的化合物、綴合物或組合物對生物樣品如核酸、白細(xì)胞、有核紅細(xì)胞、網(wǎng)織 紅細(xì)胞等具有良好的染色作用，其形成的復(fù)合物發(fā)射波長在近紅外區(qū)，避免了生物自身的 熒光背景干擾，有助于提高檢測結(jié)果的精確度，同時(shí)可在流式細(xì)胞分析儀上用作各種生物 樣品的染色劑。
[0023] 本發(fā)明的這些特征和優(yōu)點(diǎn)以及其他特征和優(yōu)點(diǎn)在參考以下附圖和本發(fā)明的具體 實(shí)施方式之后將變得顯而易見。
【附圖說明】
[0024]圖1是Dye-Ι與含不同濃度鮭魚精DNA結(jié)合后在磷酸鹽緩沖液(PBS)中的熒光發(fā)射 光譜。
[0025]圖2是Dye-Ι在PBS中與鮭魚精DNA結(jié)合前后的熒光發(fā)射光譜。
[0026]圖3是Dye-Ι與含不同濃度甲魚肝RNA結(jié)合后在磷酸鹽緩沖液(PBS)中的熒光發(fā)射 光譜。
[0027]圖4是Dye-Ι在PBS中與甲魚肝RNA結(jié)合前后的熒光發(fā)射光譜。
[0028]圖5是Dye-2與含不同濃度鮭魚精DNA結(jié)合后在磷酸鹽緩沖液(PBS)中的熒光發(fā)射 光譜。
[0029] 圖6是Dye - 2與含不同濃度甲魚肝RNA結(jié)合后在磷酸鹽緩沖液(PBS)中的熒光發(fā)射 光譜。
[0030] 圖7是Dye-2在PBS中與鮭魚精DNA結(jié)合前后的熒光發(fā)射光譜。
[0031]圖8是Dye-2在PBS中與甲魚肝RNA結(jié)合前后的熒光發(fā)射光譜。
[0032]圖9是Dye-3在PBS中與鮭魚精DNA結(jié)合前后的熒光發(fā)射光譜。
[0033]圖10是Dye-3在PBS中與甲魚肝RNA結(jié)合前后的熒光發(fā)射光譜。
[0034]圖11是Dye-〇，Dye-l和Dye-2在PBS中與甲魚肝RNA結(jié)合后的熒光發(fā)射光譜對比。
【具體實(shí)施方式】 [0035] H
[0036]除另有說明外，本文中使用的術(shù)語具有以下含義。
[0037] 本文中使用的術(shù)語"烷基"，無論是單獨(dú)使用還是與其他基團(tuán)結(jié)合使用，指包含1-18、優(yōu)選1-12、更優(yōu)選1-8、最優(yōu)選1-6個(gè)碳原子的直鏈烷基和支鏈烷基。如提及單個(gè)烷基如 "正丙基"，則只特指直鏈烷基，如提及單個(gè)支鏈烷基如"異丙基"，則只特指支鏈烷基。例如， "Cl-6烷基包括Cl-4烷基、Cl-3烷基、甲基、乙基、正丙基、異丙基和叔丁基。類似的規(guī)則也適用 于本說明書中使用的其它基團(tuán)。
[0038] 本文中使用的術(shù)語"烷氧基"是指與基團(tuán)-0-結(jié)合的上述定義的"烷基"，其中所述 "烷基"包含1-18、優(yōu)選1-12、更優(yōu)選1-8、最優(yōu)選1-6個(gè)碳原子，例如甲氧基、乙氧基、丙氧基 等。
[0039] 本文中使用的術(shù)語"鹵素"包括氟、氯、溴和碘。
[0040] 本文中使用的術(shù)語"芐基"是指-CH2_Ph基團(tuán)。當(dāng)用"任選取代"修飾芐基時(shí)，指該芐 基可以未取代的形式存在，或者可被合適的取代基在任何合適的位置取代。合適的取代基 包括但不限于鹵素、羥基、疏基、氛基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、雜環(huán)基、鹵代烷基、氣基、燒 基氨基、酰氨基、羧基等，只要最終形成的化合物具有本發(fā)明期望的性質(zhì)。優(yōu)選芐基由鹵素、 羥基、巰基、氰基、硝基或氨基任選取代。
[0041] 本文中使用的術(shù)語"雜環(huán)基"是指包含3-14、優(yōu)選3-10、更優(yōu)選3-6個(gè)環(huán)成員并包含 一個(gè)或多個(gè)選自氮、氧和硫的雜原子的單環(huán)或稠環(huán)體系。
[0042] 本文中使用的術(shù)語"生物樣品"包括但不限于核酸、血液中的白細(xì)胞、有核紅細(xì)胞、 網(wǎng)織紅細(xì)胞等。
[0043] 本發(fā)明的化合物
[0044] 太發(fā)明榲供了一種縣有以下誦忒T結(jié)構(gòu)的化合物，
[0045]
[0046] 其中
[0047] n為 1、2或 3;
[0048] X為C(CH3)2、0、S或 Se;
[0049] R4PR2各自獨(dú)立選自Η、0Η、&-18烷基、6烷基OR^Ci-18烷基磺酸基、苯基或鹵素； [0050] R3、R4各自獨(dú)立選自Ci-18烷基COOR^Ci-18烷基0R 6、芐基，其中芐基由選自以下的取 代基任選取代：?'素、羥基、疏基、氛基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、雜環(huán)基、鹵代烷基、氣基、 烷基氨基、酰氨基、羧基，條件是R3和R4不同時(shí)為芐基，且R 3為芐基時(shí)R4不為&-18烷基0R6;; [0051 ] R5為18烷基或者Η;
[0052] R6為&-18烷基、Η或者苯基，其中苯基由選自以下的取代基任選取代：鹵素、羥基、巰 基、氛基、硝基、烷基、