一類(lèi)熒光強(qiáng)度對(duì)溫度不敏感的熒光系統(tǒng)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，涉及一種對(duì)溫度不敏感的香豆素類(lèi)熒光分子、熒光分 子的制備及其熒光強(qiáng)度與溫度的變化關(guān)系。它是以香豆素為母體設(shè)計(jì)的香豆素類(lèi)衍生物熒 光分子，通過(guò)選定合適的激發(fā)波長(zhǎng)，其熒光強(qiáng)度對(duì)溫度的變化不敏感，可用于設(shè)計(jì)能夠排除 溫度因素干擾的熒光探針，也可用于建立一種溫度熒光探針的矯正標(biāo)準(zhǔn)。
【背景技術(shù)】
[0002] 熒光探針作為一種有效的檢測(cè)手段，具有較高的時(shí)空分辨率和實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)性能，已 廣泛的應(yīng)用于生物系統(tǒng)中重要物種和生理過(guò)程的成像研究\和其他微環(huán)境領(lǐng)域的研究，如 沸石催化劑的活性位點(diǎn)成像2、微流體裝置中檢測(cè)某些物種或者監(jiān)測(cè)某些過(guò)程3等。然而， 在現(xiàn)有熒光探針的開(kāi)發(fā)中，溫度效應(yīng)對(duì)熒光探針光物理或者光化學(xué)特性的影響往往被忽略 了 4,而這種效應(yīng)直接影響到熒光信號(hào)的準(zhǔn)確性和可靠性。這是由于通常來(lái)說(shuō)，溫度升高后 系統(tǒng)的熒光強(qiáng)度和熒光量子產(chǎn)率會(huì)下降，這是由于溫度升高加快了染料分子的碰撞、旋轉(zhuǎn) 和振動(dòng)，促進(jìn)了其溶解，從而導(dǎo)致了更高的非輻射躍遷率。這種普遍現(xiàn)象的存在，就使得所 有的熒光探針都會(huì)不同程度的對(duì)溫度變化做出響應(yīng)，主要表現(xiàn)為熒光強(qiáng)度的降低或增高。
[0003] 近期研究表明，細(xì)胞內(nèi)和某些微環(huán)境中溫度的分布是高度不均勻和時(shí)刻變化的5 6。因此，在熒光探針用于細(xì)胞和其他微環(huán)境成像時(shí)，就必須考慮到探針對(duì)溫度和識(shí)別物種 的交叉響應(yīng)，并設(shè)法排除溫度效應(yīng)對(duì)熒光信號(hào)的干擾，從而提高熒光信號(hào)的準(zhǔn)確性和可靠 性7。然而到目前為止，還沒(méi)有對(duì)溫度不敏感的熒光系統(tǒng)被報(bào)道。在熒光系統(tǒng)中能夠提供低 溫度依賴(lài)的唯一方法是使用某些剛性的染料，如羅丹明101。但是這種染料的熒光對(duì)溫度變 化依然較敏感，在20°c下的溫度相關(guān)系數(shù)為0. 13% /°C，當(dāng)環(huán)境變化50°C時(shí)，這一強(qiáng)度變化 可以達(dá)到6% 8。因此，設(shè)計(jì)一種具有超低的溫度相關(guān)系數(shù)的熒光系統(tǒng)成為很迫切和具有挑 戰(zhàn)性的工作。
[0004] 基于近些年來(lái)對(duì)于分子聚集體以及其功能的一些研究進(jìn)展9 n，我們提出和構(gòu)建 了一種新的設(shè)計(jì)理念，以單體-聚集體系統(tǒng)來(lái)實(shí)現(xiàn)熒光強(qiáng)度對(duì)溫度變化不敏感的設(shè)想。在 這一設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)化想法中，染料的熒光量子產(chǎn)率隨著溫度升高而下降；同時(shí)，溫度升高導(dǎo)致處 于分離狀態(tài)的非自發(fā)光的分子發(fā)生聚集，這樣就增加了發(fā)光分子的量。在這兩種因素相平 衡時(shí)，熒光系統(tǒng)的總體發(fā)光強(qiáng)度就會(huì)維持在一個(gè)恒定的水平。然而，實(shí)際的效果可能更加復(fù) 雜，因?yàn)椴煌N類(lèi)的聚集體可能同時(shí)存在，而且某些分子的聚集體是處在高度發(fā)光狀態(tài)的， 或者大部分具有很弱以及幾乎沒(méi)有熒光。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了克服溫度效應(yīng)對(duì)熒光探針的影響，本發(fā)明提供一種對(duì)溫度變化不敏感的香豆 素類(lèi)熒光分子。它是以香豆素為母體設(shè)計(jì)的香豆素類(lèi)衍生物熒光分子，本發(fā)明以單體-聚 集體系統(tǒng)設(shè)想來(lái)實(shí)現(xiàn)通過(guò)選定合適的激發(fā)波長(zhǎng)，實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)熒光強(qiáng)度對(duì)溫度的變化不敏感， 可用于設(shè)計(jì)能夠排除溫度因素干擾的熒光探針，也可用于建立一種溫度熒光探針的矯正 標(biāo)準(zhǔn)。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案是，一種熒光強(qiáng)度對(duì)溫度變化不敏感的香豆素類(lèi)熒光分子，其 特征在于，結(jié)構(gòu)式如下：
[0008] 其合成路線如下所示：
[0010] 具體合成步驟為：
[0011] (1)、中間體4-二甲基氨基-2-羥基苯甲醛的合成（化合物3)
[0012] 0°C _5°C下將30mmol的P0C13滴加到無(wú)水DMF中，攪拌30-40分鐘后，將事先溶解 在無(wú)水DMF中的3-二甲基氨基苯酚20mmol緩慢滴加到該溶液中，升溫至80°C -90°C。反 應(yīng)過(guò)夜后，將反應(yīng)液倒入冰水中，用氫氧化鈉溶液調(diào)至中性，過(guò)濾得固體。將所得固體放在 真空干燥箱中干燥6-12小時(shí)，柱層析分離得黃色固體4-(二甲基氨基）-2-羥基苯甲醛，柱 層析分離得黃色固體4-(二甲基氨基）-2-羥基苯甲醛，柱層析分條件為石油醚：乙酸乙酯 =3 :1〇
[0013] (2)、7_二甲基氨基香豆素的合成（化合物2)
[0014] 在圓底燒瓶中加入1. 5mmol的4-二甲基氨基-2-羥基苯甲酸和3mmol丙二酸二 甲酯，哌啶，以乙醇為溶劑回流反應(yīng)6-12小時(shí)；反應(yīng)后減壓蒸出乙醇，加入濃鹽酸（優(yōu)選濃 度為36. 5% )和冰醋酸攪拌6-12小時(shí)，反應(yīng)液倒入冰水中，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH到5-6， 抽濾得黃色固體，真空干燥箱干燥6-12小時(shí)，柱層析分離得到中間體7-二甲基氨基香豆 素，柱層析分條件為石油醚：乙酸乙酯=3 :1，濃鹽酸與冰醋酸的體積比為1:1-3:1。
[0015] (3)、7_二甲基氨基-3-醛基香豆素的合成（化合物1)
[0016] 0°C _5°C下將1. 6mmol的P0C13滴加到無(wú)水DMF中，攪拌30-40分鐘，將事先溶解 在干燥DMF中的7-二甲基氨基香豆素1. 06mmol滴加到該溶液中，升溫至60°C -70°C;反應(yīng) 12-16小時(shí)后，將反應(yīng)液倒入冰水中，用氫氧化鈉溶液調(diào)至中性，過(guò)濾得固體，乙醇重結(jié)晶得 產(chǎn)品7-二甲基氨基-3-醛基香豆素。
[0017] 步驟⑴中所用的氫氧化鈉溶液的物質(zhì)的量濃度為2摩爾每升。
[0018] 步驟（2)中所用的溶劑乙醇是預(yù)先進(jìn)行蒸餾處理過(guò)的不含水或含有極少量水的 乙醇。
[0019] 步驟（3)中所用的氫氧化鈉溶液的物質(zhì)的量濃度為2摩爾每升。
[0020] 本發(fā)明所述香豆素類(lèi)熒光分子，在不同溶劑中存在Η-聚合體。在氯仿中，用350nm 激發(fā)時(shí)，除了 470nm處出現(xiàn)的主要發(fā)射峰，在406nm和436nm處也出現(xiàn)了兩個(gè)發(fā)射峰，而當(dāng) 激發(fā)波長(zhǎng)增加時(shí)，470nm處的峰變得更強(qiáng)，其他的兩個(gè)峰變的更弱，直到檢測(cè)不到；并且當(dāng) 發(fā)射波長(zhǎng)分別為406nm、436nm、470nm，發(fā)現(xiàn)在370nm、395nm和445nm處有三個(gè)不同的吸收 峰，從而證明了分子聚集的存在，說(shuō)明了在溶液中同時(shí)存在著三個(gè)物種，我們分別稱(chēng)其為高 度H-聚合體，二聚體和單體。
[0021] 本發(fā)明所述香豆素類(lèi)單體聚合體熒光系統(tǒng)，其熒光強(qiáng)度對(duì)溫度的變化不敏感，可 作為排除溫度因素干擾的熒光探針。當(dāng)用395nm激發(fā)時(shí)，由于二聚體的強(qiáng)吸收，溫度升高 時(shí)，熒光強(qiáng)度會(huì)發(fā)生很明顯的增強(qiáng)。而當(dāng)用415nm激發(fā)時(shí)，在溫度變化從5°C到50°C時(shí)，系 統(tǒng)的總體熒光強(qiáng)度幾乎不發(fā)生變化，實(shí)現(xiàn)了到目前為止報(bào)道的最低的熒光與溫度相關(guān)系 數(shù)-0. 05% /°C。當(dāng)用440nm激發(fā)時(shí)，由于單體的低補(bǔ)償能力，使得系統(tǒng)溫度升高時(shí)熒光強(qiáng) 度會(huì)下降。
[0022] 本發(fā)明所述香豆素類(lèi)熒光分子，在乙酸乙酯中不同激發(fā)光下，由于二聚體熒光的 增強(qiáng)抵消了單體熒光的降低，從而使得在特定的激發(fā)波長(zhǎng)下，熒光隨溫度變化很小，可以達(dá) 到 0· 05%。。。
[0023] 本發(fā)明所述香豆素類(lèi)熒光分子，在四氫呋喃中不同激發(fā)光下，由于二聚體熒光的 增強(qiáng)抵消了單體熒光的降低，從而使得在特定的激發(fā)波長(zhǎng)下，熒光隨溫度變化很小，可以達(dá) 到 0· 07%°C。
[0024] 在選定的激發(fā)波長(zhǎng)下，所述熒光系統(tǒng)的熒光強(qiáng)度對(duì)溫度的變化不敏感，而其他的 熒光分子，以羅丹明6G為例，其熒光強(qiáng)度隨溫度的增加會(huì)出現(xiàn)明顯的下降。因此，我們用該 化合物和羅丹明6G組成混合體系，通過(guò)研究混合體系溫度的變化而導(dǎo)致的兩種分子熒光 強(qiáng)度的不同變化，來(lái)建立一種用內(nèi)標(biāo)法精確矯正體系溫度的方法。
【附圖說(shuō)明】
[0025] 圖1本發(fā)明熒光分子3的1H NMR譜圖；
[0026] 圖2本發(fā)明熒光分子2的1H NMR譜圖；
[0027] 圖3本發(fā)明熒光分子2的13C NMR譜圖；
[0028] 圖4本發(fā)明熒光分子1的1H NMR譜圖；
[0029] 圖5本發(fā)明熒光分子1的13C NMR譜圖；
[0030] 圖6本發(fā)明熒光分子1在氯仿溶液中不同濃度下歸一化的紫外可見(jiàn)吸收光譜。
[0031] 圖7本發(fā)明熒光分子1在氯仿溶液中二維的吸收-發(fā)射譜圖。
[0032] 圖8本發(fā)明熒光分子1在氯仿溶液中不同激發(fā)波長(zhǎng)下的熒光發(fā)射光譜。
[0033] 圖9本發(fā)明熒光分子1在氯仿溶液中發(fā)射波長(zhǎng)為406nm不同溫度下的熒光吸收光 譜。
[0034] 圖10本發(fā)明熒光分子1在氯仿溶液中發(fā)射波長(zhǎng)為436nm不同溫度下的熒光吸收 光譜。
[0035] 圖11本發(fā)明熒光分子1在氯仿溶液中發(fā)射波長(zhǎng)為470nm