一種熒光探針及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種基于Cy7的熒光探針及其在檢測(cè)半胱氨酸（Cys)中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] L-半胱氨酸是一種具有生理功能的氨基酸，是組成蛋白質(zhì)的20多種氨基酸中唯 一具有還原性基團(tuán)疏基（-SH)的氨基酸。含疏基的半胱氨酸（Cysteine, Cys)與高半胱氨 酸（Homocysteine, Hey)是同時(shí)表達(dá)在真核細(xì)胞內(nèi)的含疏基的氨基酸，分子結(jié)構(gòu)只有一個(gè) 亞甲基的區(qū)別，功能差異則非常明顯。Cys作為人體必須的氨基酸之一，是參與蛋白質(zhì)合成 的20中氨基酸中的一種，同時(shí)也是構(gòu)建重要的谷胱甘肽的三個(gè)氨基酸之一，而Hey為甲硫 氨酸代謝的中間產(chǎn)物，本身不參與蛋白質(zhì)的合成，體內(nèi)高半胱氨酸含量的大小與許多疾病 相關(guān)聯(lián)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研宄表明，細(xì)胞內(nèi)Hey的高表達(dá)與心血管疾病及阿爾茨海默與進(jìn)行性老 年癡呆有直接關(guān)聯(lián)。因此，研制高選擇性地識(shí)別半胱氨酸和高半胱氨酸的熒光探針具有十 分重要的意義。
[0003] 正是因?yàn)榘腚装彼峋哂腥绱酥匾纳砗筒±韺W(xué)意義，對(duì)存在于生物系統(tǒng)中的半 胱氨酸檢測(cè)引起了人們的廣泛重視。熒光探針是有效檢測(cè)生命體內(nèi)半胱氨酸的手段之一。 一個(gè)具有應(yīng)用前景的熒光探針應(yīng)具有作用前后熒光變化明顯、對(duì)目標(biāo)分子響應(yīng)快、選擇性 好、合成簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。近年來，能夠應(yīng)用于檢測(cè)活細(xì)胞中半胱氨酸的熒光探針如雨后春筍般 涌現(xiàn)了。在可見光區(qū)更長(zhǎng)區(qū)段（對(duì)生物組織傷害更?。┑臋z測(cè)半胱氨酸的熒光探針仍具有 重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種可用于選擇性檢測(cè)半胱氨酸的熒光探針。
[0005] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：一種熒光探針，所述的熒光探針的結(jié)構(gòu)式如（I )所 示：
[0006]
[0007] 上述的熒光探針的制備方法，包括如下步驟：
[0008] 1)中間體1的合成：在N2保護(hù)下，將Cy7熒光染料、無水乙腈和甲胺水溶液混合 后，于常溫下反應(yīng)，TLC跟蹤反應(yīng)終點(diǎn)，將反應(yīng)物過硅膠柱（200-300目的硅膠柱），干燥，得 中間體1 ;中間體1的結(jié)構(gòu)如（Π )所示：
[0009]
[0010] 優(yōu)選的，Cy7熒光染料與甲氨的摩爾比為1:1-1. 5 ;
[0011] TLC跟蹤反應(yīng)終點(diǎn)的展開劑為，按體積比，乙酸乙酯：甲醇=2-4:1。
[0012] 2)中間體2的合成：在隊(duì)保護(hù)下，于冰水浴中，將硫代乙酸和2-碘乙醇混合，緩慢 滴加1，8-二氮雜二環(huán)^^一碳-7-烯（DBU)，滴加完成后，將混合液置于室溫下反應(yīng)，TLC追 蹤反應(yīng)終點(diǎn)，反應(yīng)物過硅膠柱，得中間體2 ;中間體2的結(jié)構(gòu)如（III)所示：
[0013]
[0014] 優(yōu)選的，硫代乙酸、DBU和2-碘乙醇的摩爾比為1-1.5:1-1.5:1 ;
[0015] TLC跟蹤反應(yīng)終點(diǎn)的展開劑為二氯甲烷。
[0016] 3)中間體3的合成：在N2保護(hù)下，于冰水浴中，將中間體1、無水二氯甲烷和三乙 胺混合，緩慢滴加三光氣【雙（三氯甲基）碳酸酯】的甲苯溶液，滴加完成后，將混合液置于 室溫下攪拌反應(yīng)，TLC追蹤反應(yīng)終點(diǎn)，至反應(yīng)液由藍(lán)色變?yōu)榫G色，將反應(yīng)液在真空狀態(tài)下旋 干，無水乙醚洗絳，收集濾餅，得中間體3沖間體3的結(jié)構(gòu)如（IV)所示：
[0017]
[0018] 優(yōu)選的，中間體1、三乙胺與三光氣的摩爾比為1:15-25:5-7 ;
[0019] TLC跟蹤反應(yīng)終點(diǎn)的展開劑為，按體積比，乙酸乙酯：甲醇=10:1。
[0020] 4)熒光探針的合成：在N2保護(hù)下，將中間體2、中間體3和三乙胺混合，于30-40°C 下反應(yīng)，TLC追蹤反應(yīng)終點(diǎn)，得到目標(biāo)產(chǎn)物熒光探針；其結(jié)構(gòu)式如（I)所示。
[0021] 優(yōu)選的，三乙胺、中間體2和中間體3的摩爾比為1-1.5:2-2. 5:1-1. 5。TLC跟蹤 反應(yīng)終點(diǎn)的展開劑為乙酸乙酯：甲醇=10 :1。
[0022] 本發(fā)明的熒光探針，采用Cy7作為熒光母體，在Cy7母體上引入硫酯類結(jié)構(gòu)，使得 探針能夠測(cè)定半胱氨酸，與半胱氨酸發(fā)生反應(yīng)，指示半胱氨酸的存在或定量測(cè)定半胱氨酸 的濃度。
[0023] 本發(fā)明的熒光探針，可對(duì)半胱氨酸定性檢測(cè)。應(yīng)用于定性檢測(cè)半胱氨酸時(shí)，其是與 半胱氨酸作用后，從而導(dǎo)致熒光改變；此過程可用于定性檢測(cè)半胱氨酸。
[0024] 本發(fā)明的熒光探針，可對(duì)半胱氨酸定量檢測(cè)。將濃度呈梯度變化的半胱氨酸的PB 緩沖液分別加入熒光探針的PB緩沖液中，反應(yīng)達(dá)到平衡后，分別測(cè)定各樣品的熒光強(qiáng)度， 然后以半胱氨酸的濃度為橫坐標(biāo)、反應(yīng)后體系的熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)作圖，即可根據(jù)熒光強(qiáng) 度從圖中讀出待測(cè)溶液中半胱氨酸的含量。此過程可用于定量檢測(cè)半胱氨酸。
[0025] 本發(fā)明的熒光探針，熒光探針本身在750nm處沒有熒光，與半胱氨酸作用后750nm 處熒光發(fā)生增強(qiáng)，且熒光強(qiáng)度正比于半胱氨酸濃度，從而指示半胱氨酸的存在或定量測(cè)定 半胱氨酸的濃度。因此，本發(fā)明的熒光探針，可用于定性和/或定量檢測(cè)半胱氨酸。
[0026] 上述的應(yīng)用，方法如下：分別將上述的熒光探針和待測(cè)物溶于PH = 5-9的磷酸 鹽緩沖溶液中，分別取兩種溶液，然后加入體積比為1:1的PH = 5-9磷酸鹽緩沖溶液和二 甲基亞砜（DMSO)的混合液，混合均勾，得工作液，測(cè)量該工作液在Aex = 650nm，Aem = 750nm下的焚光發(fā)射光譜。
[0027] 本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明的熒光探針，在半胱氨酸存在下熒光發(fā)生顯著增強(qiáng)，可 用于高選擇性、高靈敏性地定性及定量檢測(cè)半胱氨酸。這對(duì)于深入研宄半胱氨酸在生物體 內(nèi)生理和病理過程的動(dòng)力學(xué)機(jī)理具有重要意義。
【附圖說明】
[0028] 圖1是實(shí)施例1合成的熒光探針的1H NMR。
[0029] 圖2是實(shí)施例1合成的熒光探針的13CNMR。
[0030] 圖3是實(shí)施例2中熒光探針與半胱氨酸響應(yīng)后的紫外可見吸收光譜；
[0031] 其中，圖3a :空白；圖3b :半胱氨酸終濃度IOuM ;圖3c :半胱氨酸終濃度20uM ;圖 3d :半胱氨酸終濃度40uM ;圖3e :半胱氨酸終濃度60uM ;圖3f :半胱氨酸終濃度80uM ;圖 3g :半胱氨酸終濃度100uM。
[0032] 圖4是實(shí)施例2中熒光探針與半胱氨酸響應(yīng)后的熒光發(fā)射光譜；
[0033] 其中，圖4a :空白；圖4b :半胱氨酸終濃度IOuM ;圖4c :半胱氨酸終濃度20uM ;圖 4d :半胱氨酸終濃度40uM ;圖4e :半胱氨酸終濃度60uM ;圖4f :半胱氨酸終濃度80uM ;圖 4g :半胱氨酸終濃度100uM。
[0034] 圖5是熒光探針與不同濃度下半胱氨酸反應(yīng)速率的動(dòng)力學(xué)示意圖；
[0035] 其中，圖5a :空白；圖5b :半胱氨酸終濃度IOuM ;圖5c :半胱氨酸終濃度20uM ;圖 5d :半胱氨酸終濃度40uM ;圖5e :半胱氨酸終濃度60uM ;圖5f :半胱氨酸終濃度80uM ;圖 5g :半胱氨酸終濃度100uM。
[0036] 圖6是本發(fā)明熒光探針對(duì)半胱氨酸的選擇性示意圖；
[0037] 其中，圖6a :空白；圖6b :抗壞血酸；圖6c :甘氨酸；圖6d :組氨酸；圖6e :半胱氨 酸；圖6f :二硫蘇糖醇；圖6g :色氨酸；圖6h :谷胱甘肽；圖6i :谷氨酸；圖6j :過氧化氫。
[0038] 圖7是本發(fā)明焚光探針在不同pH下的焚光強(qiáng)度不意圖。
[0039] 圖8是本發(fā)明熒光探針對(duì)半胱氨酸的定量檢測(cè)示意圖。
[0040]圖9是本發(fā)明熒光探針對(duì)半胱氨酸的檢出限示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0041] 以下實(shí)施例用于進(jìn)一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明不限于實(shí)施例。
[0042] 實(shí)施例1 一種焚光探針的合成
[0043] 1)中間體1的合成：在隊(duì)保護(hù)下，將Cy7-Cl (七甲川花菁）1.28g(2.0mm〇l)置于 IOOmL三口瓶中，加入50mL無水乙腈和甲胺水溶液（將0. 061g (2. Ommol)甲胺溶于20ml水 中），常溫反應(yīng)3小時(shí)。TLC追蹤反應(yīng)終點(diǎn)（展開劑為乙酸乙酯：甲醇=3:l(v/v))，反應(yīng) 后，將反應(yīng)產(chǎn)物過硅膠柱（硅膠的顆粒大小為200-300目的），收集流出液，真空狀態(tài)下用旋 轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干，得到藍(lán)色粉末狀產(chǎn)物lg，即中間體1，產(chǎn)率為79%。
[0044] 2)中間體2的合成：在隊(duì)保護(hù)下，將0. 874g(ll. 5mmol)硫代乙酸置于IOOmL三口 瓶中，將三口瓶置于冰浴中，加入1.72g(10.0mmol)2-碘乙醇，再將 1.749g(11.5mmol)DBU 緩慢滴加于反應(yīng)液中，滴加完成后，將混合液置于室溫下反應(yīng)，TLC追蹤反應(yīng)終點(diǎn)（用純二 氯甲烷作為展開劑），反應(yīng)后，將反應(yīng)產(chǎn)物過硅膠柱（硅膠的顆粒大小為200-300目的），收 集濾液，得到黃色油狀液體〇. 5g，即中間體2,產(chǎn)率為42 %。
[0045] 3)中間體3的合成：在隊(duì)保護(hù)下，將0. 127g(0. 2mmol)中間體1置于50mL三口 瓶中，加入50mL無水二氯甲燒中（必須保證絕對(duì)無水），加入0. 404g(4mmol)三乙胺，將三 口瓶置于冰浴中，將〇. 386g(l. 3mmol)固體三光氣溶于2mL甲苯中，用恒壓滴液漏斗緩慢的 滴加到反應(yīng)液中，滴加完成后，將混合液置于室溫下反應(yīng)，攪拌約3小時(shí)，TLC追蹤反應(yīng)終點(diǎn) (展開劑為，按體積比，乙酸乙酯：甲醇=10 :1)，直至反應(yīng)液由藍(lán)色變?yōu)榫G色。將反應(yīng)物在 真空狀態(tài)下旋干，無水乙醚60mLX 3進(jìn)行洗滌，將濾餅收集，得到0. 03g綠色固體，即中間體 3,產(chǎn)率為22%。
[0046] 4)熒光探針的合成：在N2保護(hù)下，將0. 109g(0. 14mmol)中間體3置于IOOmL三 口瓶中，將〇. 〇34g(0. 28mmol)中間體2加入到反應(yīng)瓶中，加入0. 014g(0. 14mmol)三乙胺， 35°C反應(yīng)，TLC追蹤反應(yīng)終點(diǎn)（展開劑為，按體積比，乙酸乙酯：甲醇=10 :1)，直至中間體3 完全反應(yīng)完畢，過濾，干燥，得到0. 005g綠色的固體粉末，即為熒光探針，產(chǎn)率為5%。熒光 探針的結(jié)構(gòu)式如（I)所示。
[0047]
[0048] 將獲得的熒光探針做核磁共振氫譜圖，結(jié)果如圖1 :? NMR (400MHz，⑶Cl3) δ (ppm) : 7. 56-7. 48 (d，2H)，7. 43-7. 38 (t，2H)，7. 37-7. 33 (d，2H)，7. 26-7. 22 (t， 4H)，7. 19-7. 14 (d，2H)，6. 37-6. 28 (d，2H)，5. 32-5. 29 (s，2H)，4. 35-4. 29 (m， 3H)，4. 16-4. 06 (t，2H)，3. 37-3. 33 (s，2H)，3. 31-3. 04 (t，2H)，2. 89-2. 77 (m， 2H)，2. 77-2. 66 (m，2H)，2. 00-1. 96 (s，3H)，I. 67-1. 64 (s，6H)，I. 50-1. 44 (t， 6H)，I. 27-1. 24 (s，4H)，I. 00-0· 96 (t，2H)。
[0049] 將獲得的熒光探針做