本發(fā)明涉及熒光材料領(lǐng)域，尤其涉及一種熒光造影材料及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

長(zhǎng)久以來(lái)，與血管相關(guān)的疾病非常常見(jiàn)。以眼底血管為例，臨床上常見(jiàn)諸如糖尿病性視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜血管炎、血管阻塞性疾病、脈絡(luò)膜血管瘤，急性視網(wǎng)膜壞死、以及各種病因的黃斑病等等。由于眼底血管在眼球內(nèi)部，用普通的光學(xué)技術(shù)難以直接觀察病灶。利用眼底血管熒光造影技術(shù)，能夠?qū)ρ鄣撞康恼麄€(gè)血管脈絡(luò)組織進(jìn)行精確成像，以幫助醫(yī)生對(duì)病人的病患做出正確的診斷。

現(xiàn)在國(guó)際上通用的眼底血管熒光造影術(shù)主要是熒光素染色法(fluoresceinfundusangiography，ffa法)。醫(yī)生從病人肘靜脈快速(約5秒)推入20％熒光素鈉水溶液約3ml，在短時(shí)間內(nèi)用熒光檢測(cè)儀器對(duì)患者眼底血管進(jìn)行熒光成像拍攝。然而，現(xiàn)有的熒光素染料有許多缺點(diǎn)：(1)熒光素對(duì)人體毒副作用大，超過(guò)4％病人出現(xiàn)惡心嘔吐反應(yīng)，0.2％病人現(xiàn)嚴(yán)重疼痛癥狀，少數(shù)會(huì)有過(guò)敏性休克，因而必須進(jìn)行皮試實(shí)驗(yàn)。(2)熒光素在體內(nèi)代謝速度比較慢，熒光素注射后出現(xiàn)皮膚、結(jié)膜發(fā)黃，尿液呈黃色，該染黃現(xiàn)象持續(xù)24-48小時(shí)，代謝主要經(jīng)腎臟及膽道，會(huì)造成輕度肝腎功能損傷，相關(guān)功能不全者禁用。(3)熒光素法成像時(shí)間短，靜脈注射后2分鐘至幾小時(shí)，脈絡(luò)膜毛細(xì)血管中的熒光素會(huì)發(fā)生嚴(yán)重滲漏，致使周圍組織與鞏膜著色。

因此，現(xiàn)有技術(shù)還有待于改進(jìn)和發(fā)展。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種熒光造影材料及其制備方法與應(yīng)用，旨在解決現(xiàn)有熒光素染色法中，熒光素對(duì)人體毒副作用大、熒光素在體內(nèi)代謝速度比較慢、熒光素法成像時(shí)間短的問(wèn)題。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種熒光造影材料，其中，由類黃酮熒光染料與蛋白質(zhì)結(jié)合而成。

所述的熒光造影材料，其中，所述類黃酮熒光染料的結(jié)構(gòu)通式如下所示：

其中，r1、r2、r3、r4、r5、r6是不同的取代基，r1、r2、r3、r4為h、羥基、羥甲基或二甲胺基，r5和r6為甲基、乙基、丁基或羥丁基。

所述的熒光造影材料，其中，所述蛋白質(zhì)為人血清白蛋白、牛血清白蛋白、血紅蛋白、脂蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、酪蛋白、卵黃原蛋白、膠質(zhì)蛋白、血清球蛋白、人血清離心樣本中的一種。

所述的熒光造影材料，其中，所述類黃酮熒光染料與蛋白質(zhì)的重量比為1:10-1:100000。

一種如上任一所述的熒光造影材料的制備方法，其中，包括：

步驟a、將所述類黃酮熒光染料溶于第一溶劑中，配制成10^-6-10^-2摩爾/升的類黃酮熒光染料母液；

步驟b、將所述蛋白質(zhì)溶于第二溶劑中，配制成0.01-1000毫克/毫升的蛋白質(zhì)溶液母液；

步驟c、將1-100微升的所述類黃酮熒光染料母液滴加到1-100毫升的所述蛋白質(zhì)溶液母液中，并在滴加過(guò)程中對(duì)所述蛋白質(zhì)溶液母液施以震蕩或攪拌5-120分鐘，得到熒光造影材料。

所述的熒光造影材料的制備方法，其中，所述步驟a中，所述第一溶劑為甲醇、乙醇、dmso中的一種。

所述的熒光造影材料的制備方法，其中，所述步驟b中，所述第二溶劑為水、生理鹽水、磷酸鹽緩沖溶液、血清離心上清液中的一種。

所述的熒光造影材料的制備方法，其中，所述步驟a中，所述類黃酮熒光染料的制備方法包括：

步驟a1、將臨羥基苯乙酮和對(duì)氨基苯甲醛加入到乙醇中，然后冷卻，逐滴加入氫氧化鈉溶液，攪拌8-12h后，加入到冰水中，再用鹽酸中和，最后于冰箱中靜置過(guò)夜，過(guò)濾干燥，得到中間體查爾酮；

步驟a2、將所述中間體查爾酮溶于四氫呋喃中，然后加入乙醇，并逐滴加入氫氧化鉀溶液，然后冷卻，接著滴加雙氧水溶液，室溫?cái)嚢?0-60小時(shí)，再用鹽酸中和，最后過(guò)濾干燥并重結(jié)晶，獲得類黃酮熒光染料。

一種如上任一所述的熒光造影材料的應(yīng)用，其中，應(yīng)用于生物熒光成像。

所述的熒光造影材料的應(yīng)用，其中，所述生物熒光成像為細(xì)胞樣本染色、組織染色、血管系統(tǒng)熒光造影中的一種。

有益效果：本發(fā)明提供了一種熒光造影材料，所述熒光造影材料由高熒光量子產(chǎn)率的類黃酮熒光染料與高生物相容性蛋白質(zhì)內(nèi)的疏水空腔結(jié)合而成，其具有低生物毒性、高熒光量子產(chǎn)率、高熒光穩(wěn)定性、高水溶性以及高生物相容性特點(diǎn)，可應(yīng)用于細(xì)胞染色、組織標(biāo)記、以及血管熒光成像。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例4中利用fl341-hsa配合物對(duì)人體干細(xì)胞的染色圖。

圖2為實(shí)施例5中利用fl341-hsa配合物對(duì)血管內(nèi)皮組織的染色圖。

圖3為實(shí)施例6中利用fl341-hsa配合物對(duì)斑馬魚眼部外周血管第一視角的染色圖。

圖4為實(shí)施例6中利用fl341-hsa配合物對(duì)斑馬魚眼部外周血管第二視角的染色圖。

圖5為實(shí)施例6中利用fl341-hsa配合物對(duì)斑馬魚眼底血管第一視角的染色圖。

圖6為實(shí)施例6中利用fl341-hsa配合物對(duì)斑馬魚眼底血管第二視角的染色圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供一種熒光造影材料及其制備方法與應(yīng)用，為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及效果更加清楚、明確，以下對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

本發(fā)明提供一種熒光造影材料的較佳實(shí)施例，其中，由類黃酮熒光染料與蛋白質(zhì)結(jié)合而成。具體地，本發(fā)明所述熒光造影材料是由高熒光量子產(chǎn)率的類黃酮熒光染料與高生物相容性蛋白質(zhì)內(nèi)的疏水空腔結(jié)合而成的，所述類黃酮熒光染料的結(jié)構(gòu)通式如下所示：

其中，r1、r2、r3、r4、r5、r6是不同的取代基，r1、r2、r3、r4為h、羥基(-oh)、羥甲基(-och3)或二甲胺基(-n(ch3)2)，r5和r6為甲基(-ch3)、乙基(-ch2ch3)、丁基(-ch2ch2ch2ch3)或羥丁基(-ch2ch2ch2ch2oh)。

本發(fā)明利用高熒光量子產(chǎn)率的類黃酮熒光染料與高生物相容性蛋白質(zhì)內(nèi)疏水空腔結(jié)合，制備得到了具有低生物毒性、高熒光量子產(chǎn)率、高熒光穩(wěn)定性、高水溶性以及高生物相容性的熒光造影材料，所述熒光造影材料可應(yīng)用于細(xì)胞染色、組織標(biāo)記、以及血管熒光成像。

本發(fā)明還提供了一種如上任一所述的熒光造影材料的制備方法較佳實(shí)施例，其中，包括：

步驟a、將所述類黃酮熒光染料溶于第一溶劑中，配制成10^-6-10^-2摩爾/升的類黃酮熒光染料母液；

優(yōu)選地，所述第一溶劑可以為但不限于甲醇、乙醇、dmso等中的一種。

所述步驟a中，所述類黃酮熒光染料的制備方法包括：

步驟a1，制備中間體查爾酮：將50毫摩爾的含不同r1、r2、r3、r4取代基的臨羥基苯乙酮和50毫摩爾的含不同r5、r6取代基的對(duì)氨基苯甲醛加入到100-500毫升乙醇中，然后置于冰水浴中冷卻，逐滴加入10-100毫升的20％wt的氫氧化鈉溶液，攪拌8-12h(如10小時(shí))后，倒入到100-1000毫升的冰水中，用濃度為3摩爾/升的稀鹽酸中和，中和完畢后，將反應(yīng)液置于冰箱中靜置過(guò)夜，冰箱溫度設(shè)置在0-10℃之間，過(guò)夜時(shí)間為8-12小時(shí)，如10小時(shí)，將沉淀過(guò)濾干燥，即獲得中間體查爾酮，反應(yīng)方程式如下：

優(yōu)選的，上述步驟a1中，乙醇用量為200毫升，氫氧化鈉溶液用量為50毫升，冰水用量為500毫升。

步驟a2，制備類黃酮熒光染料：取10毫摩爾的含不同r1、r2、r3、r4、r5、r6取代基的中間體查爾酮溶于10毫升四氫呋喃，然后加入10-100毫升的乙醇溶液，并逐滴加入5-50毫升的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20％的氫氧化鉀溶液，加入完成后將反應(yīng)液用冰水浴冷卻，接著滴加5-30毫升30％wt的雙氧水溶液，室溫?cái)嚢?0-60小時(shí)(如48小時(shí))，用濃度為1摩爾/升的稀鹽酸中和，將沉淀過(guò)濾干燥后，在劣溶劑中重結(jié)晶，獲得類黃酮熒光染料，反應(yīng)方程式如下：

優(yōu)選的，上述步驟a2中，乙醇用量為50毫升，氫氧化鈉溶液用量為10毫升，雙氧水溶液用量為20毫升。

步驟b、將所述蛋白質(zhì)溶于第二溶劑中，配制成0.01-1000毫克/毫升的蛋白質(zhì)溶液母液；

優(yōu)選地，所述第二溶劑可以為但不限于水、生理鹽水、磷酸鹽緩沖溶液(ph＝7.4)、血清離心上清液等中的一種。

優(yōu)選地，所述蛋白質(zhì)可以為但不限于人血清白蛋白、牛血清白蛋白、血紅蛋白、脂蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、酪蛋白、卵黃原蛋白、膠質(zhì)蛋白、血清球蛋白、人血清離心樣本等中的一種。

步驟c、將1-100微升的所述類黃酮熒光染料母液緩慢滴加到1-100毫升的所述蛋白質(zhì)溶液母液中，并在滴加過(guò)程中對(duì)所述蛋白質(zhì)溶液母液施以震蕩或攪拌，震蕩或攪拌的時(shí)間為5-120分鐘，得到熒光造影材料。

本發(fā)明還提供了一種如上任一所述熒光造影材料的應(yīng)用，其中，將所述熒光造影材料應(yīng)用于生物熒光成像，例如細(xì)胞染色、組織標(biāo)記、以及血管熒光成像等。本發(fā)明所述熒光造影材料置于冰箱中保存，使用時(shí)將熒光造影材料緩慢加熱至37度。本發(fā)明方法制備的小分子染料-蛋白質(zhì)配合物(即所述熒光造影材料)，可以對(duì)常見(jiàn)細(xì)胞樣本、血管壁組織、生物組織切片、脊椎魚類、以及哺乳動(dòng)物的血管系統(tǒng)實(shí)施熒光造影，熒光造影的染色方式為滴加、涂抹、注射中的一種，詳細(xì)的配制流程與染色方式在實(shí)施例中闡述。

下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。

實(shí)施例1

類黃酮染料fl341(結(jié)構(gòu)式如下)的制備步驟如下：

將50毫摩爾的1-乙?；?2-羥基-4,5-二羥甲基苯和50毫摩爾的對(duì)二甲氨基苯甲醛加入含200毫升乙醇的反應(yīng)瓶中，將反應(yīng)瓶放于冰水浴中冷卻，逐滴加入50毫升的20％wt的氫氧化鈉溶液，攪拌10小時(shí)后，倒入500毫升的冰水中，用濃度為3摩爾/升的稀鹽酸中和。中和完畢后，將反應(yīng)液置于冰箱中靜置過(guò)夜，然后將得到的沉淀過(guò)濾干燥，即獲得查爾酮粗產(chǎn)物。取10毫摩爾的查爾酮粗產(chǎn)物溶于10毫升四氫呋喃，然后加入50毫升的乙醇溶液，并逐滴加入10毫升的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20％的氫氧化鉀溶液，加入完成后將反應(yīng)液用冰水浴冷卻，接著滴加20毫升30％wt的雙氧水溶液，室溫?cái)嚢?8小時(shí)，用濃度為1摩爾/升的稀鹽酸中和，將得到的沉淀過(guò)濾干燥后，在冰乙醇-正乙烷中重結(jié)晶，獲得類黃酮熒光染料fl341，其結(jié)構(gòu)式如下所示。

實(shí)施例2

類黃酮染料fl339的制備步驟如下：

將50毫摩爾的1-乙酰基-2-羥基-6-羥甲基苯和50毫摩爾的對(duì)二乙氨基苯甲醛加入到含250毫升乙醇的反應(yīng)瓶中，將反應(yīng)瓶放于冰水浴中冷卻，逐滴加入40毫升的20％wt的氫氧化鈉溶液，攪拌12小時(shí)后，倒入400毫升的冰水中，用濃度為3摩爾/升的稀鹽酸中和。中和完畢后，將反應(yīng)液置于冰箱中靜置過(guò)夜，將沉淀過(guò)濾干燥，即獲得查爾酮粗產(chǎn)物。取10毫摩爾的查爾酮粗產(chǎn)物溶于10毫升四氫呋喃，然后加入40毫升的乙醇溶液，并逐滴加入15毫升的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20％的氫氧化鉀溶液，加入完成后將反應(yīng)液用冰水浴冷卻，接著滴加20毫升30％wt的雙氧水溶液，室溫?cái)嚢?8小時(shí)，用濃度為1摩爾/升的稀鹽酸中和，將沉淀過(guò)濾干燥后，在冰乙醇中重結(jié)晶，獲得類黃酮熒光染料fl339，其結(jié)構(gòu)式如下所示。

實(shí)施例3

fl341-hsa配合物熒光造影材料的制備步驟如下：

將3.41毫克類黃酮染料fl341溶于10毫升乙醇，均勻攪拌至完全溶解，配制成10^-3摩爾/升的fl341類黃酮熒光染料母液；將100毫克人血清白蛋白(hsa)溶于10毫升磷酸鹽緩沖溶液(ph＝7.4)中，加熱37攝氏度，均勻攪拌至完全溶解，配制得10毫克/毫升的hsa蛋白質(zhì)溶液母液；將100微升的fl341類黃酮熒光染料母液緩慢滴入至10毫升的hsa蛋白質(zhì)溶液母液中，均勻攪拌為20分鐘，直至溶液至較透明，制備得fl341-hsa配合物熒光造影材料。

實(shí)施例4

利用fl341-hsa配合物進(jìn)行細(xì)胞染色。

將100微升的fl341-hsa配合物熒光造影材料溶液滴入1ml人體干細(xì)胞培養(yǎng)液中，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15分鐘后，用pbs水溶液清洗細(xì)胞3次。如圖1所示，由熒光顯微鏡可以觀察到，人體干細(xì)胞被熒光染料成功染色。

實(shí)施例5

利用fl341-hsa配合物進(jìn)行組織染色。

將培養(yǎng)好的血管內(nèi)皮組織，用pbs緩沖溶液清洗3次，然后置于培養(yǎng)皿中，將200微升的fl341-hsa配合物熒光造影材料溶液滴入培養(yǎng)皿，培養(yǎng)20分鐘后，再用pbs水溶液清洗細(xì)胞3次。如圖2所示，由熒光顯微鏡可以觀察到，血管內(nèi)皮組織被熒光染料成功染色。

實(shí)施例6

利用fl341-hsa配合物對(duì)斑馬魚眼底血管進(jìn)行熒光成像。

將3dpf的斑馬魚用agarose水凝膠側(cè)位固定于培養(yǎng)皿上，利用微注射技術(shù)，將20微升的fl341-hsa配合物熒光造影材料溶液注射入斑馬魚卵黃囊的血管區(qū)，注射速率小于10微升/分鐘，注射完成后，將載有斑馬魚培養(yǎng)皿置于28攝氏度的恒溫水中，直至水凝膠完全溶解。等待約10分鐘后，將斑馬魚取出，對(duì)斑馬魚眼底血管實(shí)施激光共聚焦熒光成像。如圖3-6所示，斑馬魚眼外環(huán)血管以及眼底血管，皆呈現(xiàn)明亮的熒光，而其他組織的熒光強(qiáng)度非常弱，證明該配合物能夠選擇性的對(duì)血管系統(tǒng)染色。

綜上所述，本發(fā)明提供的一種熒光造影材料及其制備方法與應(yīng)用，所述熒光造影材料是小分子染料和高生物相容性蛋白質(zhì)構(gòu)成的配合物，其中小分子染料為高熒光量子產(chǎn)率的類黃酮熒光染料，其與高生物相容性蛋白質(zhì)內(nèi)的疏水空腔結(jié)合；本發(fā)明利用類黃酮熒光染料的低生物毒性，解決了現(xiàn)有的熒光素染色法對(duì)人體產(chǎn)生較嚴(yán)重副作用的問(wèn)題，同時(shí)利用類黃酮熒光染料的高熒光量子產(chǎn)率、高熒光穩(wěn)定性和高生物相容性蛋白質(zhì)的高水溶性、高生物相容性，使得本發(fā)明的熒光造影材料能夠很好地應(yīng)用于臨床。

應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明的應(yīng)用不限于上述的舉例，對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，可以根據(jù)上述說(shuō)明加以改進(jìn)或變換，所有這些改進(jìn)和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍。