本發(fā)明屬于納米材料制備技術(shù)領(lǐng)域，涉及可用于多糖體外示蹤、病原真菌檢測(cè)、細(xì)胞成像、真菌多糖免疫機(jī)制研究、觀賞魚(yú)鳥(niǎo)花卉熒光著色、量子點(diǎn)敏化太陽(yáng)能電池等方面的真菌多糖包覆量子點(diǎn)，具體涉及真菌多糖包覆量子點(diǎn)的生物合成及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

量子點(diǎn)(Quantum dot,QD)是一類(lèi)準(zhǔn)零維納米材料，粒徑通常介于1-10nm之間。該類(lèi)材料由Ⅱ-Ⅵ族(如：Cd，Pb與S，Se，Te)或Ⅲ～Ⅴ族(如：In，Ga與P，As)元素組成，常見(jiàn)的量子點(diǎn)材料包括CdS、CdSe、CdTe、GaAs、InAs等。量子點(diǎn)的電子和空穴被量子限域，其連續(xù)的能帶結(jié)構(gòu)被分割成具有分子特性的分立能級(jí)結(jié)構(gòu)，因而該類(lèi)材料受到光激發(fā)后可發(fā)生熒光。與傳統(tǒng)的有機(jī)熒光染料相比，量子點(diǎn)熒光材料的激發(fā)光譜寬且連續(xù)分布，發(fā)射光的穩(wěn)定性強(qiáng)，不易發(fā)生光漂白，并且通過(guò)控制量子點(diǎn)粒徑可以獲得從紫外至近紅外范圍內(nèi)的任意發(fā)射光譜。鑒于在熒光特性上的諸多優(yōu)點(diǎn)，量子點(diǎn)在生物熒光成像方面具有廣泛的應(yīng)用前景。不僅如此，量子點(diǎn)獨(dú)特的光電學(xué)性能使其在光電子器件、太陽(yáng)能電池、激光器等方面同樣應(yīng)用廣泛。因此，量子點(diǎn)成為近年來(lái)材料科學(xué)的研究熱點(diǎn)。

量子點(diǎn)的合成方法主要包括有機(jī)相合成法與水相合成法。在有機(jī)相合成法中，金屬前體在配體和特定溶劑中分解成單體而形成核心，晶體成核后由于有機(jī)配體，如三辛基膦(TOPO)、十四烷基膦酸(TDPA)、己基膦酸等(HPA)等的包覆作用而被限制生長(zhǎng)，所形成的量子點(diǎn)晶體得以穩(wěn)定存在。該方法合成的量子點(diǎn)粒徑均勻，分散性好，但合成過(guò)程中需要高溫?zé)峤?，合成設(shè)備苛刻，合成原料具有強(qiáng)毒性，操作復(fù)雜，合成過(guò)程不易控制。不僅如此，所合成的量子點(diǎn)為脂溶性，不能直接與生物分子相連，而需要先進(jìn)行復(fù)雜的表面修飾才能應(yīng)用。與此相比，水相合成法所制備的量子點(diǎn)不需要進(jìn)行表面修飾即可與生物分子連接，使用便捷。該方法是采用含巰基的小分子化合物，如巰基丁酸(MCA)、巰基乙醇(MCH)、L-半胱氨酸(L-Cys)等對(duì)成核體系進(jìn)行分散，在防止晶體聚合的同時(shí)對(duì)晶體表面進(jìn)行功能修飾，并使晶體具備良好的水溶性。然而，該方法對(duì)設(shè)備要求高，合成過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生H₂Te、H₂Se等劇毒氣體，而且量子點(diǎn)與水相分離難度大。因此，探索高效、綠色的量子點(diǎn)水相合成方法勢(shì)在必行。

近年來(lái)，隨著生物技術(shù)的迅速發(fā)展，采用生物合成法制備納米材料日益受到關(guān)注，這是因?yàn)樵擃?lèi)方法具有反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)過(guò)程安全易控、成本低廉、產(chǎn)物生物相容性好等諸多優(yōu)點(diǎn)，因而必將成為納米材料合成領(lǐng)域的重要發(fā)展趨勢(shì)。對(duì)于量子點(diǎn)生物合成而言，人們開(kāi)始嘗試采用大腸桿菌、釀酒酵母、蚯蚓等模式生物合成CdS、CdSe、CdTe等量子點(diǎn)材料。然而，迄今為止，采用生物合成方法制備量子點(diǎn)存在量子點(diǎn)產(chǎn)率低、分離過(guò)程繁瑣等不足。因此，生物合成量子點(diǎn)的相關(guān)方法亟待改進(jìn)與完善。

鑒于真菌感染及真菌污染在人類(lèi)健康、食品安全、工業(yè)生產(chǎn)等諸多方面具有極為負(fù)面的影響，真菌檢測(cè)具有非常重要的意義。然而，迄今該類(lèi)檢測(cè)基本仍采用傳統(tǒng)的菌培方法。該方法不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且對(duì)于不易培養(yǎng)的真菌易產(chǎn)生假陰性結(jié)果。因此，臨床檢測(cè)、食品檢測(cè)等諸多領(lǐng)域亟需快捷、準(zhǔn)確的真菌檢測(cè)方法。與傳統(tǒng)的菌培方法相比，免疫熒光方法因具有特異性強(qiáng)、操作時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，勢(shì)必在真菌檢測(cè)方面具有廣闊的應(yīng)用前景。但目前仍罕見(jiàn)有針對(duì)真菌的免疫熒光試劑的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是為了解決現(xiàn)有量子點(diǎn)合成過(guò)程中制備成本高、操作復(fù)雜、設(shè)備要求高、易產(chǎn)生有毒物質(zhì)、分離過(guò)程繁瑣等諸多問(wèn)題，而提供一種采用絲狀真菌合成多糖包覆的制備方法，以及所制備的量子點(diǎn)在多糖體內(nèi)示蹤、病原真菌檢測(cè)、真菌多糖免疫機(jī)制研究、觀賞魚(yú)鳥(niǎo)花卉熒光著色、量子點(diǎn)敏化太陽(yáng)能電池等方面的應(yīng)用。

一類(lèi)采用生物合成法制備的真菌多糖包覆量子點(diǎn)，是采用能產(chǎn)生胞外多糖的絲狀真菌制備的多糖包被量子點(diǎn)，包括CdS，CdSe，CdTe，GaAs、InAs等，其粒徑大小為1-10nm，激發(fā)光波長(zhǎng)范圍為200-700nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為400nm-800nm，發(fā)射熒光顏色為藍(lán)色、綠色、黃色、橙色或紅色。

一種真菌多糖包覆量子點(diǎn)的生物合成方法，是以能產(chǎn)生胞外多糖的絲狀真菌作為合成菌株，往培養(yǎng)液中添加量子點(diǎn)合成前體，以硼氫化鈉為還原劑，以巰基乙酸(或其他含巰基化合物)為穩(wěn)定劑，通過(guò)改變培養(yǎng)溫度(溫度20-37℃)，制備不同粒徑及不同熒光發(fā)射光譜的量子點(diǎn)，進(jìn)而采用乙醇沉淀法分離得到目的產(chǎn)物。其步驟為：

(1)真菌液體培養(yǎng)

以能夠產(chǎn)生胞外多糖的真菌，如糙皮側(cè)耳(Pleurotus ostreatus)、香菇(Lentinula edodes)、靈芝(Ganoderma lucidum)、木耳(Auricularia auricula)和猴頭菇(Hericium erinaceus)等作為合成菌株，采用改良高氏培養(yǎng)基(蛋白胨0.25％，葡萄糖1.5％，酵母膏0.25％，KH₂PO₄0.005％，MgSO₄0.0025％)，在25-35℃下，搖床培養(yǎng)制備富含胞外多糖的菌絲體懸液。

(2)量子點(diǎn)合成

在富含真菌多糖的菌絲體懸液中，按0.15-0.2g/L的添加量添加亞碲酸鈉(或其他非金屬元素供體，如亞硒酸鈉或亞硫酸鈉)，按0.8g/L的添加量添加氯化鎘(或其他金屬元素供體，如其他Ⅱ族或Ⅲ族金屬元素化合物)，充分混勻。隨后按1.5-2g/L的添加量添加巰基乙酸(或其他含巰基化合物)作為穩(wěn)定劑，按1-1.5g/L的添加量添加硼氫化鈉作為還原劑，充分混勻。將混合體系置于搖床中，通過(guò)改變培養(yǎng)溫度(20-37℃)與培養(yǎng)時(shí)間(4-8d)，得到不同粒徑與不同熒光發(fā)射光譜的量子點(diǎn)。

(3)量子點(diǎn)分離

采用乙醇沉淀法，以反應(yīng)液與乙醇比例為1：3的劑量，往步驟(2)反應(yīng)液中添加無(wú)水乙醇或工業(yè)酒精，混勻后靜置，使多糖包覆的量子點(diǎn)充分沉淀。棄上清，室溫干燥或冷凍真空干燥，得到目的產(chǎn)物真菌多糖包覆量子點(diǎn)干粉。

本發(fā)明方法制備的量子點(diǎn)可用于生物檢測(cè)、細(xì)胞成像、動(dòng)植物活體熒光著色和量子點(diǎn)敏化太陽(yáng)能電池中。

所述生物檢測(cè)如病原真菌臨床檢測(cè)，具體方法如下：采用微孔濾膜過(guò)濾所使用的過(guò)濾裝置為微型組裝式正壓濾器；即采用2ml醫(yī)用注射器吸取待測(cè)患者尿液標(biāo)本1.0ml，注射器乳頭連接組裝式正壓濾器，過(guò)濾尿液，濾膜直徑與濾器內(nèi)徑相同；在過(guò)濾尿液后，將濾膜取出，倒扣于載玻片，熱固定包被后進(jìn)行菌體-多糖包被量子點(diǎn)反應(yīng)、水沖洗、熒光檢測(cè)，此方法可有效避免檢測(cè)結(jié)果的假陰性，檢測(cè)濃度可達(dá)10²個(gè)菌/mL樣品。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：

本發(fā)明方法具有操作便捷、對(duì)設(shè)備要求低、反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)物分離簡(jiǎn)單、回收率高、產(chǎn)物性質(zhì)穩(wěn)定等特點(diǎn)，能夠有效降低量子點(diǎn)合成過(guò)程中的能耗及劇毒氣體的污染，降低合成成本，從而產(chǎn)生良好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。

附圖說(shuō)明

圖1是香菇多糖包覆CdTe量子點(diǎn)制備的技術(shù)路線(xiàn)。

圖2是真菌多糖包覆量子點(diǎn)的透射電鏡表征圖。

圖3是真菌多糖包覆量子點(diǎn)的熒光光譜圖。

圖4是真菌多糖包覆量子點(diǎn)檢測(cè)尿液真菌的熒光觀察圖。

下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說(shuō)明。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例一：真菌多糖包覆CdTe量子點(diǎn)的生物合成與應(yīng)用

真菌多糖包覆量子點(diǎn)生物合成的技術(shù)路線(xiàn)見(jiàn)附圖1。

下面以香菇菌株合成真菌多糖包覆CdTe量子點(diǎn)為例進(jìn)行介紹：

(1)菌體培養(yǎng)

從斜面試管中挑取糙皮側(cè)耳(Pleurotus ostreatus)菌株f1(南開(kāi)大學(xué)菌種保藏中心)，接種于改良高氏培養(yǎng)基(蛋白胨0.25％，葡萄糖1.5％，酵母膏0.25％，KH₂PO₄0.005％，MgSO₄0.0025％)平板。將平板置于28℃培養(yǎng)箱中避光靜置培養(yǎng)，5-7d后形成發(fā)育良好的菌絲體。

將活化的菌絲體轉(zhuǎn)接至盛有改良高氏培養(yǎng)基的三角瓶。將平板置于恒溫?fù)u床中，在28℃、180rpm條件下避光培養(yǎng)，5-7d后形成均勻的菌絲發(fā)酵液，其中含有大量胞外多糖。

(2)CdTe量子點(diǎn)合成

從搖床中取出菌絲發(fā)酵液，添加0.2g/L的亞碲酸鈉，0.8g/L的氯化鎘，立即充分混勻。隨后再加入1.5g/L的巰基乙酸(或其他含巰基化合物)，以及1g/L的硼氫化鈉，立即充分混勻。將混合體系置于搖床中，設(shè)置搖床轉(zhuǎn)速為180rpm，在一定培養(yǎng)溫度下恒溫?fù)u床培養(yǎng)48h，分別得到一定粒徑(一定熒光發(fā)射光譜)量子點(diǎn)的懸液：培養(yǎng)溫度與粒徑對(duì)應(yīng)關(guān)系：25℃，1.0-1.6nm(藍(lán)色)；30℃，1.5-2.0nm(綠色)；33℃，2.0-2.5nm(黃色)；37℃，3.5-4.0nm(紅色)。

(3)CdTe量子點(diǎn)分離

將合成體系轉(zhuǎn)移至200mL離心瓶中，在3000-5000rpm條件下離心，所得上清液轉(zhuǎn)移至1L燒杯。按上清液與無(wú)水乙醇(或工業(yè)酒精)比例為1：3的劑量，往燒杯中加入無(wú)水乙醇(或工業(yè)酒精)，輕輕攪拌，使多糖包覆的CdTe量子點(diǎn)形成絮狀物并充分沉淀。移去上清，所得沉淀于室溫條件下自然干燥(或真空冷凍干燥)，得到真菌多糖包覆CdTe量子點(diǎn)成品。含乙醇的上清液可反復(fù)用于量子點(diǎn)的分離。

分離得到的量子點(diǎn)用蒸餾水溶解，供后續(xù)使用。不同培養(yǎng)溫度條件下制備的CdTe量子點(diǎn)水溶液透射電鏡表征結(jié)果見(jiàn)附圖2，熒光光譜圖及熒光發(fā)射照片見(jiàn)附圖3。

(4)多糖包覆CdTe量子點(diǎn)在尿液真菌檢測(cè)中的應(yīng)用

經(jīng)測(cè)定，所制備的多糖包覆CdTe量子點(diǎn)能夠與多糖進(jìn)行特異性結(jié)合。對(duì)于尿液、原料乳及其他不存在可溶性多糖的樣品而言，所制備的多糖包覆量子點(diǎn)可用于這些樣品的真菌檢測(cè)。在尿液真菌檢測(cè)過(guò)程中：

①用2ml注射器吸取1ml待測(cè)尿液樣品，經(jīng)直徑1cm組裝式濾器(內(nèi)裝有0.22微米濾膜一片)過(guò)濾。取出濾膜，倒扣于載玻片，使濾膜上的菌體充分粘附于載玻片表面，在酒精燈上快速烘烤(熱固定)，使菌體固定在膜片上。

②加熒光免疫診斷試劑：在膜片上滴加100μl多糖包被CdTe量子點(diǎn)，37℃孵育10-30min。

③洗滌：用PBS洗滌載玻片3次，以洗去未結(jié)合的多余量子點(diǎn)。

④觀察：將膜片置于熒光顯微鏡下，以相應(yīng)激發(fā)波長(zhǎng)觀察熒光發(fā)光情況。真菌陰性、陽(yáng)性尿液樣品的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)附圖4。其中真菌多糖包覆QD為真菌多糖包覆CdTe量子點(diǎn)，Im-FAb為真菌特異性免疫熒光抗體的對(duì)照。也可應(yīng)用熒光檢測(cè)儀，以及可激發(fā)不同波長(zhǎng)的便攜式激發(fā)光源儀器，如紫外顯示器等，對(duì)量子點(diǎn)染色后的樣品進(jìn)行檢測(cè)。

⑤結(jié)論：結(jié)果證實(shí)，針對(duì)真菌菌培陰性的樣品，真菌多糖包覆QD與Im-FAb均顯示陰性；針對(duì)真菌菌培陽(yáng)性的樣品，真菌多糖包覆QD與Im-FAb均顯示為陽(yáng)性。三種檢測(cè)方法結(jié)果一致，表明陽(yáng)性樣品為真菌感染陽(yáng)性。

⑥臨床檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。表中樣品真菌檢測(cè)采用菌培、真菌多糖包覆QD及Im-FAb三種方法進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果表明三種檢測(cè)結(jié)果基本一致，而真菌多糖包覆QD與Im-FAb檢測(cè)結(jié)果完全一致，表明真菌多糖包覆QD能夠代替真菌特異性免疫熒光抗體檢測(cè)真菌。

表1

實(shí)施例二：真菌多糖包覆CdSe量子點(diǎn)的生物合成與應(yīng)用

下面以平菇菌株合成真菌多糖包覆CdSe量子點(diǎn)為例進(jìn)行介紹：

(1)菌體培養(yǎng)

從斜面試管中挑取靈芝(Ganoderma lucidum)菌株f6(南開(kāi)大學(xué)菌種保藏中心)，接種于改良高氏培養(yǎng)基平板。將平板置于25℃培養(yǎng)箱中避光靜置培養(yǎng)，7-10d后形成發(fā)育良好的菌絲體。

將活化的菌絲體轉(zhuǎn)接至盛有改良高氏培養(yǎng)基的三角瓶。將平板置于恒溫?fù)u床中，在25℃、180rpm條件下避光培養(yǎng)，5-7d后形成均勻的菌絲發(fā)酵液，其中含有大量平菇胞外多糖。

(2)CdSe量子點(diǎn)合成

從搖床中取出菌絲發(fā)酵液，添加0.2g/L的亞硒酸鈉，1g/L的氯化鎘，立即充分混勻。隨后再加入2g/L的巰基丁酸(或其他含巰基化合物)，以及1.5g/L的硼氫化鈉，立即充分混勻。將混合體系置于搖床中，設(shè)置搖床轉(zhuǎn)速為180rpm，在一定培養(yǎng)溫度下恒溫?fù)u床培養(yǎng)48h，分別得到一定粒徑量子點(diǎn)懸液：培養(yǎng)溫度與粒徑對(duì)應(yīng)關(guān)系：25℃，1.0-2.0nm(藍(lán)色)；30℃，2.0-3.0nm(黃色)；35℃，3.5-4.0nm(紅色)。

(3)CdSe量子點(diǎn)分離

將合成體系用三層濾紙進(jìn)行過(guò)濾，所得濾液轉(zhuǎn)移至1L燒杯。按濾液與無(wú)水乙醇(或工業(yè)酒精)比例為1：3的劑量，往燒杯中加入無(wú)水乙醇(或工業(yè)酒精)，輕輕攪拌，使多糖包覆的CdSe量子點(diǎn)形成絮狀物并充分沉淀。移去上清，所得沉淀于室溫條件下自然干燥(或真空冷凍干燥)，得到真菌多糖包覆CdSe量子點(diǎn)成品。含乙醇的上清液可反復(fù)用于量子點(diǎn)的分離。分離得到的量子點(diǎn)用蒸餾水溶解，供后續(xù)使用。

(4)多糖包覆CdSe量子點(diǎn)在細(xì)胞成像中的應(yīng)用

將多糖包覆CdSe量子點(diǎn)溶于生理鹽水，得到1mg/ml CdSe量子點(diǎn)溶液。以1:1000比例加入巨噬細(xì)胞RAW264.7培養(yǎng)孔中。孵育3-6h后，采用熒光顯微鏡觀察，可以觀察到胞內(nèi)有明顯的熒光分布。表明多糖包覆CdSe量子點(diǎn)具有良好的生物相容性，能夠有效穿透巨噬細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞成像。