本發(fā)明涉及細(xì)胞探針技術(shù)領(lǐng)域，更具體的說是基于紅色熒光碳納米材料的細(xì)胞探針的合成與應(yīng)用，本發(fā)明還涉及采用所述的細(xì)胞探針進(jìn)行細(xì)胞成像的新方法。

背景技術(shù)：

熒光碳納米材料具有可調(diào)的發(fā)射光譜，被認(rèn)為是一種具有廣泛應(yīng)用前景的納米晶體材料，現(xiàn)在已經(jīng)合成出了具有較高光子產(chǎn)率的可見發(fā)射光譜熒光碳納米材料，現(xiàn)已被應(yīng)用于生物探針。熒光碳納米材料作為一種新型的熒光材料，在光學(xué)和生物分析應(yīng)用上顯示出優(yōu)異的性能。相比有機(jī)染料，熒光碳納米材料的光化學(xué)穩(wěn)定性更好，在生物體內(nèi)不發(fā)生光降解從而避免了干擾作用。相比傳統(tǒng)的量子點(diǎn)，熒光碳納米材料沒有潛在的生物毒性和光閃爍問題。熒光碳納米材料具有良好的水溶性和良好的生物相容性，到目前為止，熒光碳納米材料已經(jīng)在生物標(biāo)記、醫(yī)藥傳輸、生物成像和檢測領(lǐng)域被廣泛研究與應(yīng)用。與短波長的光激發(fā)下獲得的圖像相比，在近紅外激發(fā)波長下獲得的圖像表現(xiàn)出最好的信號(hào)與背景分離?？偟膩碚f，熒光碳納米材料具有四個(gè)明顯的優(yōu)勢:(1)激發(fā)光譜譜寬，從紫外區(qū)域一直延伸到可見光區(qū)域;(2)其熒光性質(zhì)非常穩(wěn)定，在經(jīng)過數(shù)小時(shí)的激發(fā)光照射后，其熒光強(qiáng)度仍然保持不變;(3)細(xì)胞滲透能力好;(4)生物兼容性好，毒性較低。通過體內(nèi)光學(xué)成像優(yōu)選較長的波長，特別是近紅外區(qū)域，所以碳納米材料作為光學(xué)納米探針用于生物成像有巨大的應(yīng)用潛力。

目前，熒光碳納米材料已經(jīng)成功地應(yīng)用于生物成像、藥物運(yùn)輸、環(huán)境檢測、光催化、能量轉(zhuǎn)換、光電子以及傳感領(lǐng)域。目前，熒光碳納米材料的制備方法包括激光消融法、模板法、電化學(xué)法、水熱法、和濃酸氧化有機(jī)物碳化法等等。在以上方法中，水熱法因其具有較好的可控性、易于操作以及溫和的反應(yīng)條件而受到青睞，是一種制備熒光納米材料的重要方法。通過調(diào)節(jié)反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、原料比例以及其他相關(guān)參數(shù)，可以制備大小、成分以及表面結(jié)構(gòu)可控的熒光納米顆粒，從而使得我們能夠改變其光學(xué)性質(zhì)。

水溶性的熒光碳納米材料可以更好地與生物材料結(jié)合，是現(xiàn)在水溶液和細(xì)胞質(zhì)中直接檢測，大大縮短了前期處理工作，并且可以增大熒光負(fù)載效率，使細(xì)胞成像更加清晰。近紅外激發(fā)下的熒光材料較溫和，對細(xì)胞的傷害小，基本可以在細(xì)胞正常的生長情況下進(jìn)行成像觀察。由此看來用熒光碳納米材料代替?zhèn)鹘y(tǒng)的生物染料會(huì)對活細(xì)胞的成像更具有準(zhǔn)確性和實(shí)效性，并且應(yīng)用范圍廣，可以對幾乎所有的細(xì)胞都適用。

基于以上技術(shù)，我們需要找一種廉價(jià)簡單的操作方法，合成一種高效率低成本的細(xì)胞探針，所合成的探針應(yīng)改操作簡單、可批量生產(chǎn)、可用于活細(xì)胞成像的實(shí)時(shí)監(jiān)測，從而實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞病變的檢測。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供了一種基于紅色熒光碳納米材料的細(xì)胞探針的合成與應(yīng)用。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明是通過以下措施來實(shí)現(xiàn)的：基于紅色熒光碳納米材料的細(xì)胞探針的合成與應(yīng)用，其包括以下步驟：

（1）將實(shí)驗(yàn)所需要的有機(jī)試劑進(jìn)行蒸餾純化；

（2）合成親水性的紅色熒光碳納米材料；

（3）將合成的親水性的紅色熒光碳納米材料上分別連接上聚乙二醇、精氨酸、組氨酸、葡萄糖進(jìn)行功能化；

（4）將功能化的紅色熒光碳納米材料修飾上葉酸和維生素H，細(xì)胞探針合成完畢；

（5）將培養(yǎng)好的不同細(xì)胞分別與細(xì)胞探針混合培養(yǎng)，利用細(xì)胞成像儀觀察細(xì)胞成像情況。

基于紅色熒光碳納米材料的細(xì)胞探針的合成與應(yīng)用，其特征是，所述合成與應(yīng)用包括如下步驟：

（1）將1 g抗壞血酸溶解到盛有12 mL油酰胺的三口瓶中，將溶液加熱到200℃，冷凝回流4 h，然后停止反應(yīng)冷卻至室溫，用丙酮和三氯甲烷分別洗滌有機(jī)相，得到產(chǎn)品1，即疏水性的紅色熒光碳納米材料；

（2）通過聲波降解法將20 mg聚順丁烯二酸酐溶解到1 mL三氯甲烷中，加入純化的產(chǎn)品1，聲波處理直至得到澄清的溶液，然后蒸發(fā)除去三氯甲烷，將得到的固體分散到pH為9.5的鹽酸鹽緩沖溶液中，磁力攪拌5 h，得到產(chǎn)品2，即親水性的紅色熒光碳納米材料；

（3）分別將1 mg聚乙二醇、精氨酸、組氨酸、葡萄糖加入到產(chǎn)品2中，加熱到40℃，冷凝回流12 h，分別得到聚乙二醇、精氨酸、組氨酸、葡萄糖功能化的親水性紅色熒光碳納米材料；

（4）取1 mg葉酸和1 mg N-羥基丁二酰亞胺溶解到2 mL N,N’-二甲基甲酰胺中，攪拌反應(yīng)2 h，得到溶液3葉酸/N-羥基丁二酰亞胺；

（5）取1 mg維生素H、1 mg N-羥基丁二酰亞胺和0.5 mg N,N’-二環(huán)己基碳二亞胺溶解到2 mL N,N’-二甲基甲酰胺中，攪拌反應(yīng)2 h，得到溶液4維生素H/N-羥基丁二酰亞胺；

（6）分別取1 mL步驟（3）得到的聚乙二醇、精氨酸、組氨酸、葡萄糖功能化的疏水性紅色熒光碳納米材料，分別加入30 μL步驟（4）所得的溶液3和30 μL步驟（5）所得的溶液4的混合溶液，室溫下反應(yīng)5 h，離心分離得到的懸浮液，將固體分散到pH為9.0的鹽酸鹽緩沖溶液中，保存在4℃的冰箱中，四種細(xì)胞探針合成完畢;

（7）將培養(yǎng)好的不同細(xì)胞分別與四種細(xì)胞探針混合培養(yǎng)，30 min后，利用細(xì)胞成像儀觀察細(xì)胞成像情況。

本發(fā)明的有益效果：

（1）利用紅色熒光碳納米材料以及葉酸和維生素H合成的細(xì)胞探針，具有穩(wěn)定性好、生物相容性好、毒性小、適用范圍廣的優(yōu)點(diǎn)；

（2）本發(fā)明所合成的細(xì)胞探針操作簡單、可批量生產(chǎn)、可用于幾乎所有細(xì)胞的細(xì)胞成像；

（3）本發(fā)明利用細(xì)胞成像儀的方法進(jìn)行測定操作快速簡單，反應(yīng)及結(jié)果均由儀器自動(dòng)完成和記錄，避免了主觀因素的影響，并保證有很好的重復(fù)性，便于現(xiàn)場檢測。

附圖說明

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)描述。

【圖1】細(xì)胞探針合成過程。

具體實(shí)施方式

基于紅色熒光碳納米材料的細(xì)胞探針的合成與應(yīng)用，其包括以下步驟：

（1）將實(shí)驗(yàn)所需要的有機(jī)試劑進(jìn)行蒸餾純化；

（2）合成親水性的紅色熒光碳納米材料；

（3）將合成的親水性的紅色熒光碳納米材料上分別連接上聚乙二醇、精氨酸、組氨酸、葡萄糖進(jìn)行功能化；

（4）將功能化的紅色熒光碳納米材料修飾上葉酸和維生素H，細(xì)胞探針合成完畢;

（5）將培養(yǎng)好的不同細(xì)胞分別與細(xì)胞探針混合培養(yǎng)，利用細(xì)胞成像儀觀察細(xì)胞成像情況。

基于紅色熒光碳納米材料的細(xì)胞探針的合成與應(yīng)用，其特征是，所述合成與應(yīng)用包括如下步驟：

（1）將1 g抗壞血酸溶解到盛有12 mL油酰胺的三口瓶中，將溶液加熱到200℃，冷凝回流4 h，然后停止反應(yīng)冷卻至室溫，用丙酮和三氯甲烷分別洗滌有機(jī)相，得到產(chǎn)品1，即疏水性的紅色熒光碳納米材料；

（2）通過聲波降解法將20 mg聚順丁烯二酸酐溶解到1 mL三氯甲烷中，加入純化的產(chǎn)品1，聲波處理直至得到澄清的溶液，然后蒸發(fā)除去三氯甲烷，將得到的固體分散到pH為9.5的鹽酸鹽緩沖溶液中，磁力攪拌5 h，得到產(chǎn)品2，即親水性的紅色熒光碳納米材料；

（3）分別將1 mg聚乙二醇、精氨酸、組氨酸、葡萄糖加入到產(chǎn)品2中，加熱到40℃，冷凝回流12 h，分別得到聚乙二醇、精氨酸、組氨酸、葡萄糖功能化的親水性紅色熒光碳納米材料；

（4）取1 mg葉酸和1 mg N-羥基丁二酰亞胺溶解到2 mL N,N’-二甲基甲酰胺中，攪拌反應(yīng)2 h，得到溶液3葉酸/N-羥基丁二酰亞胺；

（5）取1 mg維生素H、1 mg N-羥基丁二酰亞胺和0.5 mg N,N’-二環(huán)己基碳二亞胺溶解到2 mL N,N’-二甲基甲酰胺中，攪拌反應(yīng)2 h，得到溶液4維生素H/N-羥基丁二酰亞胺；

（6）分別取1 mL步驟（3）得到的聚乙二醇、精氨酸、組氨酸、葡萄糖功能化的疏水性紅色熒光碳納米材料，分別加入30 μL步驟（4）所得的溶液3和30 μL步驟（5）所得的溶液4的混合溶液，室溫下反應(yīng)5 h，離心分離得到的懸浮液，將固體分散到pH為9.0的鹽酸鹽緩沖溶液中，保存在4℃的冰箱中，四種細(xì)胞探針合成完畢；

（7）將培養(yǎng)好的不同細(xì)胞分別與四種細(xì)胞探針混合培養(yǎng)，30 min后，利用細(xì)胞成像儀觀察細(xì)胞成像情況。

實(shí)施例1 （Hela細(xì)胞）

（1）將實(shí)驗(yàn)所需要的有機(jī)試劑進(jìn)行蒸餾純化；

（2）將1 g抗壞血酸溶解到盛有12 mL油酰胺的三口瓶中，將溶液加熱到200℃，冷凝回流4 h，然后停止反應(yīng)冷卻至室溫，用丙酮和三氯甲烷分別洗滌有機(jī)相，得到產(chǎn)品1，即疏水性的紅色熒光碳納米材料；

（3）通過聲波降解法將20 mg聚順丁烯二酸酐溶解到1 mL三氯甲烷中，加入純化的產(chǎn)品1，聲波處理直至得到澄清的溶液，然后蒸發(fā)除去三氯甲烷，將得到的固體分散到pH為9.5的鹽酸鹽緩沖溶液中，磁力攪拌5 h，得到產(chǎn)品2，即親水性的紅色熒光碳納米材料；

（4）分別將1 mg聚乙二醇、精氨酸、組氨酸、葡萄糖加入到產(chǎn)品2中，加熱到40℃，冷凝回流12 h，分別得到聚乙二醇、精氨酸、組氨酸、葡萄糖功能化的親水性紅色熒光碳納米材料；

（5）取1 mg葉酸和1 mg N-羥基丁二酰亞胺溶解到2 mL N,N’-二甲基甲酰胺中，攪拌反應(yīng)2 h，得到溶液3葉酸/N-羥基丁二酰亞胺；

（6）取1 mg維生素H、1 mg N-羥基丁二酰亞胺和0.5 mg N,N’-二環(huán)己基碳二亞胺溶解到2 mL N,N’-二甲基甲酰胺中，攪拌反應(yīng)2 h，得到溶液4維生素H/N-羥基丁二酰亞胺；

（7）分別取1 mL步驟（3）得到的聚乙二醇、精氨酸、組氨酸、葡萄糖功能化的疏水性紅色熒光碳納米材料，分別加入30 μL步驟（4）所得的溶液3和30 μL步驟（5）所得的溶液4的混合溶液，室溫下反應(yīng)5 h，離心分離得到的懸浮液，將固體分散到pH為9.0的鹽酸鹽緩沖溶液中，保存在4℃的冰箱中，四種細(xì)胞探針合成完畢；

（8）將培養(yǎng)好的Hela細(xì)胞分別與四種細(xì)胞探針混合培養(yǎng)，30 min后，利用細(xì)胞成像儀進(jìn)行觀察細(xì)胞成像情況。

實(shí)施例2 （MCF-7細(xì)胞）

合成步驟同實(shí)施例1，不同的是（8）將培養(yǎng)好的MCF-7細(xì)胞分別與四種細(xì)胞探針混合培養(yǎng)，30 min后，利用細(xì)胞成像儀進(jìn)行觀察細(xì)胞成像情況。

實(shí)施例3 （K-562細(xì)胞）

合成步驟同實(shí)施例1，不同的是（8）將培養(yǎng)好的K-562細(xì)胞分別與四種細(xì)胞探針混合培養(yǎng)，30 min后，利用細(xì)胞成像儀進(jìn)行觀察細(xì)胞成像情況。

實(shí)施例4 （HepG2細(xì)胞）

合成步驟同實(shí)施例1，不同的是（8）將培養(yǎng)好的HepG2細(xì)胞分別與四種細(xì)胞探針混合培養(yǎng)，30 min后，利用細(xì)胞成像儀進(jìn)行觀察細(xì)胞成像情況。