本發(fā)明涉及熒光探針領(lǐng)域，具體涉及一種可用于選擇性，比率型檢測人血清白蛋白的熒光探針。4-氨基-1，8-萘酐的一種包含氨基甲酸內(nèi)酯的結(jié)構(gòu)，在與人血清白蛋白作用后，出現(xiàn)熒光波長的紅移以及強度變化。并且該過程不受到其它酯酶的影響。因此能夠比率型地定量人血清白蛋白的含量。

背景技術(shù)：

人血清白蛋白(human serum albumin，簡稱HSA)是人血漿中最豐富的蛋白質(zhì)，占到了血漿蛋白質(zhì)的50％左右。在體液中人血清白蛋白可以運輸脂肪酸、膽紅素、氨基酸、類固醇激素、金屬離子和許多藥物分子等：同時維持血液正常的滲透壓。HSA作為一種下調(diào)急性期蛋白，在炎癥狀態(tài)下處于低水平。HSA也是人體血漿中重要的酯酶，可以水解碳酸酯，磷酸酯以及酰胺等。HSA對底物的偏好，以及與其它酯酶的相同與異同都是研究的熱點，可能對與疾病通路的研究有指導(dǎo)意義。另外有研究表明HSA的酯酶活性要比其它物種SA的高很多，雖然HSA/SA的三維晶體結(jié)構(gòu)并無多大差異。

熒光探針是有效檢測生命體酶類的重要手段之一，相比吸光度法具有檢測靈敏的優(yōu)勢。一個具有應(yīng)用前景的熒光探針應(yīng)具有作用前后熒光變化明顯、對目標分子響應(yīng)快、選擇性好、合成簡單等優(yōu)點。目前應(yīng)用于檢測HSA的方法主要是溴甲酚綠檢測法，主要基于白蛋白在酸性PH下帶正電荷的特性。另外基于白蛋白的酯酶活性，p-nitrophenyl acetate(PNPA)檢測方法也比較普遍。但是如上兩種方法,如溴甲酚綠法，它必須在30s內(nèi)完成檢測，否則受其他蛋白影響很大。PNPA法，它能被多種酶代謝，因此面臨著選擇性的問題。檢測HSA的熒光探針目前也都是基于白蛋白結(jié)合機制的，很難達到準確定量血漿HSA的目標。因此開發(fā)定量檢測HSA的探針具有重大意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明就是針對上述問題，提供了一種可用于選擇性檢測細胞內(nèi)HSA的熒光探針，此探針可以在生理條件下選擇性地與HSA作用，作用后熒光顯著增強。

本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：采用4-氨基-1，8-萘酐作為熒光母體，引入了一種氨基甲酸內(nèi)酯的結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)在與人血清白蛋白作用后，反應(yīng)物的熒光降低，產(chǎn)物的熒光升高，并且不受其它酯酶的影響。因此能夠比率型地定量人血清白蛋白的含量。

所述熒光探針的結(jié)構(gòu)式Ⅰ如下。

結(jié)構(gòu)式Ⅰ

所述的熒光探針的制備方法為：以4-氨基-1，8-萘酐作為熒光母體，引入了一種氨基甲酸內(nèi)酯的結(jié)構(gòu)；具體制備步驟如下，

1)在20ml乙醇中，加入4-氨基-1，8-萘酐(cas：81-86-7)0.775g與1-丁胺(cas：109-73-9)353uL，78度回流4小時。反應(yīng)完后旋干溶劑，得到產(chǎn)物1(0.97g，產(chǎn)率100％)。

2)在20ml的二氧六環(huán)中，加入0.5g(1.86mmol)產(chǎn)物1,和氯甲酸氯乙酯232uL(1.86mmol)，加入三乙胺(774uL，5.58mmol)作為縛酸劑。反應(yīng)混合液加熱到100℃，反應(yīng)兩小時。TLC跟蹤反應(yīng)進程，到原料黃點(365nm激發(fā)下)全部轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物藍點(365nm激發(fā)下)則停止反應(yīng)。反應(yīng)后旋干，簡單柱層析(CH₂Cl₂)分離。得到產(chǎn)物2(0.55g,79％yield).

3)在5ml甲醇里，加入四甲基胍65uL，加入0.1g(0.26mmol)產(chǎn)物2,常溫攪拌15min后，旋干，簡單柱層析(CH₂Cl₂)分離。得到產(chǎn)物3(0.09g，產(chǎn)率95％)。

所述的熒光探針的制備方法，其特征在于：步驟4)中所述反應(yīng)溶劑為二氧六環(huán)，反應(yīng)溫度為100℃，縛酸劑三乙胺使用量為3N；步驟5)中縛酸劑四甲基胍的使用量為2N,反應(yīng)溫度為常溫。

所述的制備方法，其特征在于：所述步驟1-5)中，所用的實驗條件均為氮氣保護；所述的步驟1)—5)中攪拌的方式為磁力攪拌。

所述的熒光探針可以用于人血清白蛋白(human serum albumin,簡稱HSA)的定性或定量檢測。所述的熒光探針應(yīng)用于檢測HSA時，其是生成具有結(jié)構(gòu)II的化合物，從而導(dǎo)致熒光變化，結(jié)構(gòu)2的名稱為4-乙醇胺基-1,8-萘酐。

結(jié)構(gòu)II

所述的熒光探針在定量檢測HSA中，與HSA作用后，512nm/460nm熒光強度正比于HSA的酯酶活性。

所述的熒光探針可用于血漿中HSA的定量檢測。

本發(fā)明的有益效果：該化合物在HSA存在下出現(xiàn)熒光波長的紅移以及強度改變，可用于高選擇性、高靈敏性地檢測HSA。尤其是，該化合物可用于中的HSA檢測，這對于深入研究HSA在生物體內(nèi)生理和病理過程的動力學(xué)機理具有重要意義。

附圖說明

圖1實施例1中提供的熒光探針NACL的合成路線圖；

圖2本發(fā)明提供的熒光探針NACL檢測HSA的原理示意圖；

圖3實施例1中合成的探針NACL的¹H NMR(a)，¹³C NMR(b)，譜圖；

圖4實施例2中熒光探針NACL水溶液的紫外可見吸收光譜(a)、熒光激發(fā)光譜(b)、發(fā)射光譜(c)；

圖5實施例3中熒光探針NACL對HSA的選擇性示意圖；

圖6實施例4中產(chǎn)物4-乙醇胺-1,8-萘酐(NAEA)的液相質(zhì)譜圖(a)/核磁H譜圖(b)；

圖7實施例5中NAEA的紫外可見吸收光譜(a)、熒光激發(fā)光譜(b)、發(fā)射光譜(c)；

圖8實施例6中NAEA發(fā)射光譜受HSA的結(jié)合影響示意圖。

圖9實施例7中熒光探針NACL對不同濃度的HSA響應(yīng)后，460nm熒光的減弱示意圖(a)及512nm熒光的增強示意圖(b)；

圖10實施例8中熒光探針NACL在HSA被抑制作用下示意圖,(a)時間動力學(xué)圖；(b)測試抑制劑FA的IC50值圖；(c)在血漿中用各種酶的抑制劑抑制，只有FA能夠明顯抑制白蛋白活性；

圖11實施例9中熒光探針NACL用于檢測血清中HSA的定量標線。

具體實施方式

下述實施例用于進一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明不限于實施例。

實施例1(探針的合成)：

如圖1所示，NACL的合成：1)在20ml乙醇中，加入4-氨基-1，8-萘酐(cas：81-86-7)0.775g與1-丁胺(cas：109-73-9)353uL，78度回流4小時。反應(yīng)完后旋干溶劑，得到產(chǎn)物1(0.97g，產(chǎn)率100％)。

2)在20ml的二氧六環(huán)中，加入0.5g(1.86mmol)產(chǎn)物1,和氯甲酸氯乙酯232uL(1.86mmol)，加入三乙胺(774uL，5.58mmol)作為縛酸劑。反應(yīng)混合液加熱到100℃，反應(yīng)兩小時。TLC跟蹤反應(yīng)進程，到原料黃點(365nm激發(fā)下)全部轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物藍點(365nm激發(fā)下)則停止反應(yīng)。反應(yīng)后旋干，簡單柱層析(CH₂Cl₂)分離。得到產(chǎn)物2(0.55g,79％yield).3)在5ml甲醇里，加入四甲基胍65uL，加入0.1g(0.26mmol)產(chǎn)物2,常溫攪拌15min后，旋干，簡單柱層析(CH₂Cl₂)分離。得到產(chǎn)物3(0.09g，產(chǎn)率95％)。MS:339.13(positiveion)。¹HNMR(400MHz,Chloroform-d)δ(ppm):δ＝8.64(d,1H,J＝7.2Hz),8.61(d,1H,J＝8.0Hz),8.28(d,1H,J＝8.6Hz),7.80(t,1H,J＝7.8Hz),7.69(d,1H,J＝7.6Hz),4.71(t,2H,J＝8.2Hz),4.20(m,4H),1.72(m,2H),1.45(m,2H),0.98(t,3H,J＝7.2Hz).¹³CNMR(100MHz,Chloroform-d)δ(ppm):163.90,163.44,156.59,140.13,131.11,129.32,127.78,127.36,123.35,123.29,122.22,62.77,48.68,40.34,30.18,20.37,13.85。

實施例2

如圖4所示，將NACL溶于10mM的PBS緩沖液中，配置成20uM的溶液。用熒光酶標儀(Thermofisher)檢測器檢測NACL水溶液的紫外可見吸收光譜(a)、熒光激發(fā)光譜(b)、發(fā)射光譜(c))；結(jié)果顯示探針NACL的最大吸收/激發(fā)/發(fā)射波長為350nm/350nm/460nm。

實施例3

配置HSA/BSA的水溶液(酶濃度為50mg/ml)CES1/CES2/PON1/PON2/AChE/BChE/ALP/ACP/IgG/A1AT酶/蛋白分別等分成若干份。配置NACL(50mM)的DMSO溶液。每個反應(yīng)在196ul 100mM的PBS緩沖液中加2ul NACL(50mM)以及2ul酶，使用全波長掃描式多功能讀數(shù)儀進行測量，探針和酶的終濃度分別為50uM和1mg/ml。測量該工作液的熒光發(fā)射光譜，λex＝450nm，光柵寬度為5nm，發(fā)射范圍從470nm-700nm。圖5表明NACL在HSA的作用下，512nm的熒光強度增加，其它酶則沒有顯著變化。

實施例4

在PBS(PH＝7.4)溶液5ml中，加入HSA 50mg/ml的溶液250ul，取NACL (50mM)的DMSO溶液50ul，在37℃下孵育2h。反應(yīng)后加入二氯甲烷溶液2ml，萃取，分出有機相，重復(fù)萃取三次，得到的有機相濃縮。用硅膠柱色譜的方法分出產(chǎn)物。如圖6，產(chǎn)物經(jīng)液相質(zhì)譜/核磁鑒定，發(fā)現(xiàn)為4-乙醇胺-1,8-萘酐(NAEA)。

實施例5

將NAEA溶于10mM的PBS緩沖液中，配置成20uM的溶液。用熒光酶標儀(Thermofisher)檢測器檢測NACL水溶液的紫外可見吸收光譜(a)、熒光激發(fā)光譜(b)、發(fā)射光譜(c))；結(jié)果顯示NAEA的最大吸收/激發(fā)/發(fā)射波長為450/450/512nm,如圖7所示。

實施例6

在濃度為20uM的NAEA溶液中(10mM的PBS緩沖液中)，分別加入5％的0.5/1/2/5/10/50mg/ml HSA溶液。如圖8所示，隨著HSA溶液的濃度增高，NAEA的發(fā)射光譜逐漸從550nm藍移到510nm，并且熒光強度有所增加。

實施例7

配置HSA不同濃度(酶濃度為50/40/30/20/10/5mg/ml)酶分別等分成若干份。配置NACL(2mM)的DMSO溶液(重要的極性非質(zhì)子溶劑)。每個反應(yīng)在178ul100mM的PBS緩沖液中加2ul NACL(2mM)以及20ul酶，使用全波長掃描式多功能讀數(shù)儀及96孔酶標板進行測量，探針和酶的終濃度分別為20uM和5/4/3/2/1/0.5mg/ml。測量該工作液的熒光發(fā)射光譜，λex1＝350nm，光柵寬度為5nm，發(fā)射范圍從370nm-600nm。λex2＝450nm，光柵寬度為5nm，發(fā)射范圍從470nm-700nm。如圖7所示，NACL與HSA作用后，隨HSA濃度增加,460nm熒光降低(a)，512nm熒光升高(b)，如圖9所示。

實施例8

配置NACL特異性抑制劑flufenamic acid儲液。每個反應(yīng)在176ul的PBS緩沖液(10mM)中加2ul NACL(2mM)以及2ul的酶(10mg/ml)以及2ul的抑制劑或2ul緩沖液(對照)。使用全波長掃描式多功能讀數(shù)儀及96孔酶標板進行測量。測量該工作液的熒光發(fā)射光譜，λex＝450nm，光柵寬度為5nm，λem＝512nm。結(jié)果顯示：如圖10，NACL被HSA的催化作用可以被500uM flufenamic acid HSA抑制劑完全抑制，再次證明NACL是HSA的探針底物。另外以NACL為底物測flufenamic acid(FA)抑制劑的IC50,得到其IC50值為88uM。用血漿孵育NACL,同時加入flufenamic acid(FA):HSA的抑制劑；phenylmethyl sulfonylfluoride(PMSF):trpsin,chymotrypsin等絲氨酸蛋白酶的抑制劑；ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA):PON的抑制劑；bis-p-nitrophenyl phosphate(BNPP):carboxylesterase的抑制劑；ISO-OMPA:cholinesterase的抑制劑；levamisole:ALP的抑制劑；發(fā)現(xiàn)只有FA能夠明顯抑制血漿中的NASA代謝，說明NASA可以用于血漿中白蛋白的檢測。

實施例9(探針NACL用于HSA的檢測的定量標線)：同實施例7，用不同濃度HSA(酶濃度為50/40/30/20/10/5mg/ml)孵育,發(fā)現(xiàn)512nm/460nm處熒光值 比值F510/460nm與濃度成線性關(guān)系(a)。(圖11)在不連續(xù)的四天內(nèi)同做標線(b)，發(fā)現(xiàn)差異不大，穩(wěn)定性很好。因此該標線可用于HSA的定量檢測中。