專利名稱：檢測羥基自由基的近紅外熒光探針及其合成方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物檢測技術(shù)及臨床醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域，尤其涉及用于羥基自由基檢測的近紅外熒光分子探針；本發(fā)明還涉及該熒光分子探針的合成方法；另外，本發(fā)明還涉及該熒光分子探針的用途。
背景技術(shù)：
生物新陳代謝過程中產(chǎn)生眾多的活性氧自由基，包括超氧陰離子自由基(O2-)、過氧化氫(H2O2)、羥基自由基(HO·)、一氧化氮(NO)、過氧亞硝基(ONOO-)等，這些自由基與癌癥和炎癥的發(fā)病、組織過氧化、蛋白質(zhì)交聯(lián)變性、核酸損傷和信號傳導(dǎo)(Wiseman，H.；Halliwell，B.Biochem.J.1996，313，17-29；McCord，J.M.；Science.1974，185，529-531；Dobashi，K.；Ghosh，B.；Orak，J.K.；Singh，I.Biochem.2000，205，1-11；Nishida，M.；Maruyama，Y.；Tanaka，R.；Kontani，K.；Nagao，T.Hoshi，T.Nature.2000，408，492-495.)等有直接的關(guān)系，被統(tǒng)一稱為對機(jī)體的氧化脅迫。然而，這些活性氧在體內(nèi)的產(chǎn)生和作用，以及過量時的致病機(jī)制尚有待于進(jìn)一步探究；生物體內(nèi)活性氧的壽命非常短，導(dǎo)致通常情況下穩(wěn)態(tài)濃度極低，意味著活性氧的測定非常困難。·OH作為一種生命活動過程中產(chǎn)生的目前已知氧化性最強(qiáng)的自由基，其檢測尤為重要。熒光法由于靈敏度高于其它方法而顯示出較強(qiáng)的優(yōu)越性，并且結(jié)合了共聚焦顯微成像技術(shù)和微區(qū)光譜檢測技術(shù)，是唯一使活體細(xì)胞和組織內(nèi)的活性氧“實(shí)時、可見、定量”的檢測方法。在600-1000nm的近紅外光區(qū)，生物基體光吸收或熒光強(qiáng)度很小，且致密介質(zhì)(如組織)的光散射大大降低，激發(fā)光的穿透性更大，因而自發(fā)熒光的背景干擾大大降低，且能量較低減少光照對細(xì)胞的損傷，所以近紅外熒光探針擁有良好的發(fā)展前景。目前已有用于細(xì)胞內(nèi)NO和H2O2檢測并成像的近紅外熒光探針(Sasaki，E.；Kojima，H.；Nishimatsu，H.；Urano，Y.；Kikuchi，K.；Hirata，Y.；Nagano，T.J.Am.Chem.Soc.2005，127，3684-3685；Xu，K H.；Tang，B.；Huang，H.；Yang，G.W.；Chen，Z.Z.；Li，P.；An，L.G.；Chem.Commun.2005，48，5974-5976)，而用于針對細(xì)胞內(nèi)HO·檢測成像的近紅外熒光探針尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供性能優(yōu)良、適用于生物體內(nèi)羥基自由基檢測成像的檢測羥基自由基的近紅外熒光探針，為生物樣品中低含量的羥基自由基檢測、探討人類疾病及老化的機(jī)制以及某些重大疾病的早期診斷與預(yù)防，提供良好的輔助手段；目的之二是提供工藝簡單、成本低、操作方便的該熒光探針的合成方法；目的之三是提供該熒光探針的用途。
本發(fā)明的目的之一可通過如下技術(shù)措施來實(shí)現(xiàn)該熒光探針具有如下結(jié)構(gòu)通式 R＝CH2CH2CH3，CH2CH3，CH2CH2SO3Na，CH2CH2SO3，CH2CH2CH2SO3Na，CH2CH2CH2SO3；X＝I，SO3。
本發(fā)明的目的之二可通過如下技術(shù)措施來實(shí)現(xiàn)該合成方法按如下步驟進(jìn)行a.按照2，2，6，6-四甲基哌啶醇∶強(qiáng)堿＝1∶0.5～2.5的摩爾比分別加入無水N，N-二甲基甲酰胺至完全溶解，然后將兩溶解液混合均勻，在惰性氣體保護(hù)和冰水浴條件下反應(yīng)25～40分鐘，后恢復(fù)至室溫；；b.將與2，2，6，6-四甲基哌啶醇等摩爾比的花菁7(Cy.7.Cl)染料加入無水N，N-二甲基甲酰胺至完全溶解，得花菁7溶液；然后將a工序所得混合液在惰性氣體保護(hù)下于10～20分鐘緩慢加入花菁7溶液中，在干的碎冰中反應(yīng)25～35分鐘；c.將b工序所得產(chǎn)物減壓蒸干，蒸除N，N-二甲基甲酰胺，然后用乙醚洗滌，真空干燥得到粗品；d.用硅膠柱層析分離得藍(lán)紫色固體純品。
本發(fā)明的目的之二還可通過如下技術(shù)措施來實(shí)現(xiàn)
b工序中所述的緩慢加入時間一般控制為10～20分鐘；c工序中所述的減壓蒸干是采用油泵減壓，35～45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的方式來實(shí)現(xiàn)；d工序中所述的硅膠柱層析分離是采用甲醇-三氯甲烷(3∶7～5∶5v/v)為洗脫劑，35～45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑后真空干燥的方式來實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明的目的之三可通過如下技術(shù)措施來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的檢測羥基自由基的近紅外熒光探針用于化學(xué)體系、化學(xué)模擬生物體系中羥基自由基的檢測，生物活細(xì)胞和活組織內(nèi)的羥基自由基的分析檢測和熒光成像檢測，以及臨床醫(yī)學(xué)上病變組織中羥基自由基的檢測。
本發(fā)明具有如下積極效果探針分子能夠?qū)Ｒ恍圆东@化學(xué)和生物體系內(nèi)的甲基自由基，而甲基自由基是由體系內(nèi)的羥基自由基和加入的二甲亞砜快速定量生成的，因此，反應(yīng)等同于探針分子定量、專一性捕獲羥基自由基。為了簡便起見，本發(fā)明以下敘述均描述為測定羥基自由基的探針分子。
1.本發(fā)明探針分子激發(fā)和發(fā)射光譜在近紅外光區(qū)，屬于近紅外熒光探針，激發(fā)位于780nm，發(fā)射位于802nm，可以有效避免細(xì)胞自發(fā)熒光的干擾，提高檢測方法的選擇性和靈敏度，減少對生命體的損傷，有利于活體檢測。
2.本發(fā)明探針分子的設(shè)計(jì)基于哌啶氮氧自由基自旋標(biāo)記使熒光基團(tuán)熒光猝滅，探針分子捕獲由羥基自由基和二甲亞砜定量快速生成的甲基自由基后熒光恢復(fù)的原理。熒光探針分子表現(xiàn)出良好的選擇性，其它活性氧自由基不能使其熒光增強(qiáng)。另外熒光探針分子對pH不敏感，在pH6.80到8.00范圍內(nèi)，pH變化對熒光發(fā)射沒有影響。
3.本發(fā)明探針分子對羥基自由基的檢測范圍為3.0×10-5～5.0×10-6M，可以檢測納摩爾濃度的細(xì)胞內(nèi)羥基自由基。探針分子細(xì)胞滲透性好，對細(xì)胞本身沒有毒副作用，適于細(xì)胞內(nèi)羥基自由基濃度變化的檢測。
本發(fā)明的花菁染料探針?biāo)苄院芎?，通常，可以將探針分子溶解在生理鹽水、緩沖液或二甲亞砜中，然后加入含有細(xì)胞組織的適當(dāng)緩沖液中進(jìn)行測試，避免了體系中大量有機(jī)溶劑的使用。
本發(fā)明的熒光探針的具體特征如下探針由近紅外熒光基團(tuán)花菁7和哌啶氮氧自由基通過共價鍵結(jié)合構(gòu)成，激發(fā)發(fā)射波長在近紅外波段，能夠提高方法的靈敏度，降低方法的檢測限。在pH值范圍為6.80到8.00的范圍內(nèi)，探針使用不受環(huán)境酸堿度影響，適用于生物體內(nèi)使用。體內(nèi)存在的其它種類的活性氧和還原性酶不對檢測造成干擾。激光共聚焦顯微鏡成像實(shí)驗(yàn)證明探針分子的細(xì)胞滲透性好，對細(xì)胞本身沒有毒副作用，并且能夠?qū)?xì)胞內(nèi)微摩爾級的HO·含量變化進(jìn)行檢測。
細(xì)胞內(nèi)羥基自由基檢測的一般方法是將培養(yǎng)好的細(xì)胞分成兩部分，將一部分用佛波醇豆蔻酸鹽(PMA)刺激，使細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的O2-·，之后的自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)能夠生成HO·，用培養(yǎng)液沖洗后，進(jìn)行激光共聚焦顯微成像。未刺激的細(xì)胞用激光共聚焦顯微鏡成像得到空白對比圖像。
本發(fā)明涉及的探針分子具有極其重要的應(yīng)用價值。特別是該探針分子其激發(fā)波長位于近紅外區(qū)，對pH變化極不敏感，響應(yīng)時間短，測定靈敏度極高，對細(xì)胞的滲透性好，毒副作用小，使得這類探針作為測定生物體內(nèi)羥基自由基的試劑有很好的實(shí)際利用價值。另外該系列探針分子結(jié)構(gòu)簡單，合成方法更簡單，設(shè)備投入和生產(chǎn)運(yùn)行成本均很低、操作方便且生產(chǎn)效率高，適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。


圖1是本發(fā)明的熒光探針分子與自由基結(jié)合后產(chǎn)物的激發(fā)發(fā)射譜圖，以及實(shí)驗(yàn)體系組分兩兩加入時的激發(fā)發(fā)射譜圖。橫坐標(biāo)為波長(nm)，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度。
圖2是本發(fā)明的熒光探針分子與自由基結(jié)合后產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度與pH變化關(guān)系。橫坐標(biāo)為pH，縱坐標(biāo)為相對熒光強(qiáng)度。
圖3是本發(fā)明的熒光探針分子與自由基結(jié)合后產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度與反應(yīng)時間的關(guān)系。橫坐標(biāo)為時間，縱坐標(biāo)為相對熒光強(qiáng)度。
圖4是本發(fā)明的熒光探針分子與自由基結(jié)合后產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度與探針濃度的關(guān)系。橫坐標(biāo)為探針濃度，縱坐標(biāo)為相對熒光強(qiáng)度。
圖5是本發(fā)明的熒光探針分子研究小鼠腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)HO·的激光共聚焦顯微成像。
具體實(shí)施例方式
參照附圖1～5和表1作進(jìn)一步說明探針對羥基自由基選擇性對比了探針對HO·以及其它自由基和生物體內(nèi)物質(zhì)的反應(yīng)。將探針在pH 7.4的HEPES緩沖中(0.1mM)配制成10μM的10％的二甲亞砜溶液，探針激發(fā)波長為780nm，發(fā)射波長為802nm，測試結(jié)果顯示于表1中。從表中可以看出，探針與自由基結(jié)合后產(chǎn)生很大的熒光強(qiáng)度，而其它種類的活性氧熒光背景干擾極低。
通過表1顯示本發(fā)明的熒光探針分子對羥基自由基具有良好的選擇性。
表1

探針在生理pH下的適用性評價探針在生理pH下的適用性。從圖3中可以看出在pH6.80到8.00范圍內(nèi)，pH變化對熒光強(qiáng)度基本沒有影響。因此探針可用于生理?xiàng)l件下鋅離子的檢測。
細(xì)胞培養(yǎng)將收集的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞用含10％小牛血清蛋白的培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個/ml。在37℃，CO2濃度為5％的條件下使細(xì)胞貼壁孵育12小時，取出用培養(yǎng)液沖洗未貼壁細(xì)胞，用探針溶液孵育20min，將細(xì)胞分成兩部分，一部分用佛波醇豆蔻酸鹽(PMA)(2ng/ml)刺激。將未刺激的細(xì)胞作為空白，用激光共聚焦成像拍攝熒光顯微照片。
激光共聚焦成像從圖5可以看出，未經(jīng)佛波醇豆蔻酸鹽(PMA)刺激的巨噬細(xì)胞內(nèi)部含有的HO·的量微乎其微，難以進(jìn)行熒光顯像(Fig.5a)，用探針孵育的巨噬細(xì)胞經(jīng)過佛波醇豆蔻酸鹽(PMA)刺激后發(fā)出強(qiáng)烈的熒光(Fig.5b)，表明細(xì)胞內(nèi)刺激生成的HO·轉(zhuǎn)變成·CH3后被成功捕獲。Fig.5c為亮場下的細(xì)胞圖像。
實(shí)施例1
探針的合成 花菁7(Cy.7.Cl) 探針(Cy.7.TEMPO)氮?dú)獗Ｗo(hù)下將382.7mg(2.15mmol)2，2，6，6-四甲基哌啶醇加入到100ml三口燒瓶，冰水浴冷卻下10ml無水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)攪拌溶解。漿狀的氫氧化鈉65mg(2.15mol，80％，保存于煤油中，用正己烷清洗)溶于5ml無水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，攪拌下加入燒瓶中，反應(yīng)于30分鐘后恢復(fù)至室溫?；ㄝ?(Cy.7.Cl)378mg(2.15mmol)溶于50ml無水N，N-二甲基甲酰胺DMF中，將上述所得溶液在室溫氮?dú)獗Ｗo(hù)下逐滴加入到花菁7(Cy.7.Cl)的無水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，15分鐘完成加料，30分鐘后反應(yīng)在干的碎冰中結(jié)束。油泵減壓，40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)將N，N-二甲基甲酰胺(DMF)蒸干，將所得物用乙醚洗滌，真空干燥，用硅膠柱分離組分，洗脫劑為甲醇-三氯甲烷(3∶7v/v)，40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，真空干燥，得藍(lán)紫色固體(C45H59O8S2N3)，1.486g，產(chǎn)率83％。元素分析結(jié)果(理論值)C，64.6(64.8)；H，6.9(7.1)；N，5.1(5.0)；。1H NMR(DMSO-d6，300MHz)δ8.00(d，2H)，7.52(d，2H)，7.42(d，2H)，7.37(t，2H)，7.21(t，2H)，6.27(d，2H)，4.17(t，4H)，3.80(m，1H)，1.96(m，2H)，1.76(m，8H)，1.62(m，2H)，1.32(s，12H)，1.08(t，12H)，0.86(d，4H)。
權(quán)利要求
1.檢測羥基自由基的近紅外熒光探針，其特征在于該熒光探針具有如下結(jié)構(gòu)通式 R＝CH2CH2CH3，CH2CH3，CH2CH2SO3Na，CH2CH2SO3，CH2CH2CH2SO3Na，CH2CH2CH2SO3；X＝I，SO3。
2.檢測羥基自由基的近紅外熒光探針的合成方法，其特征在于該合成方法按如下步驟進(jìn)行a.按照2，2，6，6-四甲基哌啶醇∶強(qiáng)堿＝1∶0.5～2.5的摩爾比分別加入無水N，N-二甲基甲酰胺溶解，然后將兩溶解液混勻，在惰性氣體保護(hù)和冰水浴條件下反應(yīng)25～40分鐘；b.將與2，2，6，6-四甲基哌啶醇等摩爾比的花菁7加入無水N，N-二甲基甲酰胺溶解，得花菁7溶液；然后將a工序所得混合液在惰性氣體保護(hù)下緩慢加入花菁7溶液中并在干碎冰中反應(yīng)25～35分鐘；c.將b工序所得產(chǎn)物減壓蒸干，蒸除N，N-二甲基甲酰胺，然后用乙醚洗滌，真空干燥得到粗品；d.用硅膠柱層析分離得藍(lán)紫色固體純品。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的合成方法，其特征在于b工序中所述的緩慢加入時間一般控制為10～20分鐘；c工序中所述的減壓蒸干是指油泵減壓，35～45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)；d工序中所述的硅膠柱層析分離是指以甲醇-三氯甲烷為洗脫劑，35～45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑后真空干燥。
4.權(quán)利要求1所述的檢測羥基自由基的近紅外熒光探針用于化學(xué)體系、化學(xué)模擬生物體系中羥基自由基的檢測，生物活細(xì)胞和活組織內(nèi)的羥基自由基的分析檢測和熒光成像檢測，以及臨床醫(yī)學(xué)上病變組織中羥基自由基的檢測。
全文摘要
本發(fā)明提供檢測羥基自由基的近紅外熒光探針及其合成方法和用途，該合成方法按如下步驟進(jìn)行a、按照2，2，6，6－四甲基哌啶醇∶強(qiáng)堿＝1∶0.5～2.5的摩爾比分別加入無水N，N－二甲基甲酰胺溶解，然后將兩溶解液混勻，在惰性氣體保護(hù)和冰水浴條件下反應(yīng)25～40分鐘；b、將與2，2，6，6－四甲基哌啶醇等摩爾比的花菁7加入無水N，N－二甲基甲酰胺溶解，得花菁7溶液；然后將a工序所得混合液在惰性氣體保護(hù)下于10～20分鐘緩慢加入花菁7溶液中，在干的碎冰中反應(yīng)25～35分鐘；c、將b工序所得產(chǎn)物減壓蒸發(fā)，蒸除N，N－二甲基甲酰胺，然后用乙醚洗滌，真空干燥得到粗品；d、用硅膠柱層析分離得藍(lán)紫色固體純品。
文檔編號C09K11/06GK1837789SQ20061004356
公開日2006年9月27日 申請日期2006年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月7日
發(fā)明者唐波, 王晶 申請人:山東師范大學(xué)