豬繁殖與呼吸綜合征病毒gp5基因重組乳酸菌的構(gòu)建與表達(dá)的制作方法
【專(zhuān)利摘要】一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5基因重組乳酸菌的構(gòu)建與表達(dá)，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，其特征是：將豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5基因克隆、測(cè)序，對(duì)重組質(zhì)粒pMD19(simple)?dGP5和載體pNZ8149均以Nco Ⅰ、Xba Ⅰ雙酶切，酶切產(chǎn)物純化后以T4DNA連接酶連接；連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化至lacF基因缺失型的乳酸菌感受態(tài)NZ3900中，在LM17恢復(fù)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，經(jīng)Ellike平板篩選獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pNZ8149?dGP5；其有益效果是：豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5基因可在乳酸乳球菌表達(dá)載體pNZ8149中進(jìn)行重組，通過(guò)檢測(cè)，表明外源基因GP5可以通過(guò)表達(dá)載體pNZ8149在乳酸菌中表達(dá)并具有反應(yīng)原性，為下一步開(kāi)發(fā)安全、有效、廉價(jià)的口服制劑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5基因重組乳酸菌的構(gòu)建與表達(dá)
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是屬于一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5基因重 組乳酸菌的構(gòu)建與表達(dá)的生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種高度接觸性傳染病，該病可引起母 豬的繁殖障礙以及仔豬和育成豬嚴(yán)重的呼吸道疾病，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。 豬繁殖與呼吸綜合征病毒粒子呈球形，直徑為48-83nm，有囊膜，屬于尼多病毒目動(dòng)脈炎病 毒科動(dòng)脈炎病毒屬。PRRSV為單股、正鏈RNA病毒，基因組長(zhǎng)約15kb，5 '端具有帽子結(jié)構(gòu)，3 '端 非編碼區(qū)后存在多聚腺苷酸的P〇ly(A)尾巴。編碼9個(gè)ORFs，基因分別為0RFla、0RFlb、 01^2 &、01^213、01^3-7，分別編碼病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白（118?1€[、11叩比和11叩2~8)和結(jié)構(gòu)蛋白 (GP2、E、GP3、GP4和GP5、M、N)。其中GP5是由0RF5基因編碼的糖基化囊膜蛋白，分子量大小約 為25kDa，其N(xiāo)端是由約31個(gè)氨基酸組成的可切割的信號(hào)肽。引導(dǎo)蛋白形成3次跨膜結(jié)構(gòu)。GP5 含有6個(gè)抗原決定簇，可以誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體，且其中和活性在全部結(jié)構(gòu)蛋白中最強(qiáng)，是在 機(jī)體免疫應(yīng)答過(guò)程中具有重要意義的結(jié)構(gòu)蛋白。而PRRS目前沒(méi)有特效藥物治療，主要采取 以預(yù)防為主，綜合性的治療措施。國(guó)內(nèi)外均已研制出多種商品化弱毒疫苗和滅活苗，常見(jiàn)的 毒株包括此財(cái)4112、01-11?、1?98、幾41-1?等不同毒株。通常認(rèn)為弱毒疫苗免疫效果比滅活疫 苗較好，能在細(xì)胞內(nèi)繁殖，同時(shí)刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫，但可能存在滅活不徹底 和毒力返強(qiáng)的危險(xiǎn)。滅活疫苗不能在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制，免疫應(yīng)答不強(qiáng)，需要多次免疫才能達(dá) 到有效的抗體水平，免疫效果不理想。近幾年，包括云南省在內(nèi)的國(guó)內(nèi)豬場(chǎng)的PRRS和由此引 發(fā)的繼發(fā)感染以及多種病原的混合感染普遍存在，因此研制一種安全、高效的新型疫苗顯 得尤為重要。
[0003] 乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)是一類(lèi)可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生乳酸的非病 原性、革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。在機(jī)體的腔道內(nèi)，如□腔、胃、腸、陰道中都存在多種乳酸菌，分泌有 益于機(jī)體的生物活性物質(zhì)并有效地抑制有害菌的生長(zhǎng)。這對(duì)于維持機(jī)體健康具有很大的作 用，被公認(rèn)為是安全級(jí)(generally recognized as safe,GRAS)的微生物。乳酸菌與大腸桿 菌、酵母菌相比，其分子遺傳學(xué)的研究起步較晚，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，乳酸菌相關(guān)的代謝 機(jī)制、調(diào)控組件、遺傳信息已逐步被研究清楚，并建立了包括一系列的乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)。 [0004] 乳酸菌NICE表達(dá)系統(tǒng)即乳酸菌乳鏈菌肽表達(dá)(Nisin controlled expression, NICE)系統(tǒng)，該系統(tǒng)最早由Kuipers等提出。NICE表達(dá)系統(tǒng)是以Nisin生物合成相關(guān)基因（包 括結(jié)構(gòu)基因 nisA)的啟動(dòng)子nisA和雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)基因 nisRK為基礎(chǔ)，經(jīng)Nisin誘導(dǎo)表達(dá)的 系統(tǒng)。其具體調(diào)控機(jī)制為:NisK是組氨酸蛋白激酶，它存在細(xì)胞膜表面并且作為Nisin分子 的受體。Ni s in和Ni sK結(jié)合后，Ni sK自身磷酸化并將磷酸基團(tuán)傳遞給細(xì)胞內(nèi)的Ni sR(Ni sR是 反應(yīng)調(diào)控元件），NisR通過(guò)NisK的磷酸化作用而被激活，從而作為轉(zhuǎn)錄激活物激活下游的誘 導(dǎo)性啟動(dòng)子nisA的基因表達(dá)。1928年，Rogerst Whittier首先發(fā)現(xiàn)了Nisin，直到1944年 Mattick和Hirsch證明該物質(zhì)可對(duì)許多革蘭氏陽(yáng)性菌具有抑制作用，并將該物質(zhì)命名為 Nisin<a953年Nisin作為商品進(jìn)入市場(chǎng)。1988年，美國(guó)食品及藥品管理局(FDA)確定Nisin可 作為天然的抗菌物質(zhì)被廣泛地應(yīng)用。1990年1月19日，我國(guó)衛(wèi)生部批準(zhǔn)作為食品的抗菌保藏 劑，公認(rèn)對(duì)人和動(dòng)物安全、無(wú)毒害。
[0005] 目前，常見(jiàn)的NICE表達(dá)系統(tǒng)包括Lactococcus lactisNZ9000和NZ3900。似3900/ PNZ8149表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)包括:乳酸乳球菌NZ3900分子遺傳背景清晰，調(diào)控機(jī)制得到深入的 研究，本身為食品級(jí)、可鑒定、性質(zhì)穩(wěn)定的微生物;質(zhì)粒PNZ8149上不攜帶抗性基因，采用了 食品級(jí)的篩選標(biāo)記代替了抗生素抗性基因，安全穩(wěn)定;誘導(dǎo)物Nisin為食品級(jí)，早已廣泛應(yīng) 用于食品防腐，對(duì)人體安全無(wú)害;乳酸菌安全無(wú)毒素，表達(dá)的蛋白無(wú)需經(jīng)過(guò)純化，可直接與 菌體一起服用，為蛋白表達(dá)后進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究提供極大的便利。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是:根據(jù)云南省豬繁殖與呼吸綜合征的流行情況，本研究從云南省 某豬場(chǎng)采集的病料中提取RNA，采用RT-PCR方法擴(kuò)增GP5基因，利用了乳酸菌NZ3900生長(zhǎng)迅 速、易于操作，不含有抗性基因，缺失乳糖操縱子，將PRRSV GP5基因克隆到含有該操縱子的 乳酸乳球菌PNZ8149表達(dá)載體中，從而構(gòu)建pNZ8149-GP5乳酸乳球菌表達(dá)載體，并使得PRRSV GP5獲得表達(dá)。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案是：
[0008] -段用于豬繁殖與呼吸綜合征病毒重組乳酸菌表達(dá)的基因，本發(fā)明該基因段為豬 繁殖與呼吸綜合征病毒基因組中的GP5基因。
[0009] -對(duì)擴(kuò)增豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5基因用的引物，從豬繁殖與呼吸綜合征病 毒中提取總RNA為模版，用特異性引物GP5-F/GP5-R，RT-PCR方法擴(kuò)增出其GP5基因，本發(fā)明 的引物基因?yàn)?，GP5-F: 5' CATGAGGTGGGCAACTGTT 3'，GP5-R: 5' GTCATGTACCCGAAGGTGA 3'。
[0010] -對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒分析用的酶切插入位點(diǎn)，其酶切插入位點(diǎn)為Ncol和 Xbal 〇
[0011] 一對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5基因克隆用的引物，該引物對(duì)為，dGP5-F: 5'
[0012] CATGCCATGGGCAACAACAACAGCTCTCATATTCA 37
[0013] dGPS-R^^CTCTAGACTAGAGACGACCCCATCGTTCC 37 〇
[0014] 一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5基因重組乳酸菌的構(gòu)建方法，包括以下步驟： (1)以從豬繁殖與呼吸綜合征病料中提取的總RNA為模版，用引物GP5-F/GP5-R，RT-PCR方法 擴(kuò)增出GP5基因，并將其克隆至pMD19-T載體中，進(jìn)行核苷酸序列分析;所述的引物：
[0015] GPS-F^^ATGAGGTGGGCAACTGTT 37 ,GP5-R： 57 GTCATGTACCCGAAGGTGA 37 ；
[0016] (2)以上述克隆得到的質(zhì)粒pMD19-GP5為模版，用帶有Ncol和Xbal酶切位點(diǎn)的一對(duì) 擴(kuò)增缺失信號(hào)肽的GP5基因（dGP5)表達(dá)引物:dGP5-F/dGP5-R擴(kuò)增dGP5基因，將其克隆至丁-Vector pMD19(simple)后測(cè)序，充分培養(yǎng)陽(yáng)性重組菌，提取質(zhì)粒pMD19(simple)_dGP5;所述 的引物：
[0017] dGP5-F：57 CATGCCATGGGCAACAACAACAGCTCTCATATTCA 37
[0018] dGPS-R^^CTCTAGACTAGAGACGACCCCATCGTTCC 37 ；
[0019] (3)將上述提取得到的質(zhì)粒pMD19(simple)-dGP5用NcoI、XbaI雙酶切后與用同種 酶雙酶切的載體連接，乙醇沉淀法純化濃縮連接產(chǎn)物，電轉(zhuǎn)化感受態(tài)乳酸乳球菌NZ3900，所 述載體為PNZ8149;
[0020] (4)篩選陽(yáng)性乳酸乳球菌，提取陽(yáng)性乳酸菌中重組質(zhì)粒酶切鑒定并對(duì)插入序列進(jìn) 行測(cè)序。
[0021] -種豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5基因重組乳酸菌的構(gòu)建的表達(dá)方法，本發(fā)明將 步驟4)篩選到的陽(yáng)性克隆，經(jīng)Ni s in誘導(dǎo)后，采用SDS-PAGE進(jìn)行鑒定，可見(jiàn)約19kDa的融合蛋 白，經(jīng)Western blotting和IFA分析表明該蛋白具有與PRRSV克隆抗體結(jié)合具有免疫反應(yīng) 性。
[0022] l.PRRSV GP5蛋白0RF5基因的克隆與序列分析
[0023] 參考661^&1^中的美洲型毒株￥1?-23322(1]87392)、1乂41^?112445)、!111財(cái) (EF635006)等基因序列應(yīng)用Primer5軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增GP5全長(zhǎng)基因的引物:GP5-F/GP5-R，應(yīng)用 RT-PCR方法擴(kuò)增出GP5基因，將其克隆至pMD19-T載體中并進(jìn)行測(cè)序和序列分析。根據(jù)測(cè)序 結(jié)果和SignalP 4.1服務(wù)器設(shè)計(jì)去除信號(hào)肽的GP5基因（dGP5)表達(dá)引物dGP5-F/dGP5-R。其 中dGP5-F引物中酶切位點(diǎn)為Ncol:序列CCATGGdGPS-R引物中酶切位點(diǎn)Xbal，序列:TCTAGA。 dGP5-F/dGP5-R擴(kuò)增片段用于乳酸乳球菌表面表達(dá)載體pNZ8149的重組構(gòu)建；根據(jù)從 GenBank中選取的考序列采用DNAStar生物學(xué)軟件將測(cè)序結(jié)果與參考毒株基因序列進(jìn)行分 析。結(jié)果表明：6?5基因片段大小為835匕？，該基因與美洲代表株￥1?-2332同源性為88.4%~ 89.7 %，而與歐洲型代表株LV同源性?xún)H為62.9 %~63.5 %。
[0024] (2) PRRSV重組表達(dá)載體pNZ8149-dGP5的構(gòu)建
[0025] 以陽(yáng)性質(zhì)粒pMD19-GP5為模板，用缺失信號(hào)肽的亞克隆引物dGP5-F/dGP5-R進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后進(jìn)行膠回收純化測(cè)序。對(duì)測(cè)序正確的PCR產(chǎn)物與載體 T-Vector pMD19(simple)進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化到DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，通過(guò)藍(lán)白斑篩選，挑取白色 單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，從而得到陽(yáng)性質(zhì)粒pMD19(simple)-dGP5。分別用NcoI、XbaI雙 酶切質(zhì)粒pMD19(simple)-dGP5和乳酸乳球菌表面表達(dá)載體pNZ8149,對(duì)雙酶切片段進(jìn)行膠 回收，將回收的dGP5基因和pNZ8149載體進(jìn)行連接，把連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化到乳酸菌NZ3900感受 態(tài)細(xì)胞中，通過(guò)LM17恢復(fù)培養(yǎng)基培養(yǎng)后篩選擴(kuò)大培養(yǎng)得到陽(yáng)性重組質(zhì)粒pNZ8149-dGP5。
[0026] (3)重組質(zhì)粒pNZ8149-dGP5在乳酸乳球菌中的表達(dá)
[0027]將保存的pNZ8149-dGP5/NZ3900菌種接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使其活化，將活化 的細(xì)菌，再次接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)到0D600 = 0.6后用Nisin誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析，可見(jiàn)約19kDa的融合蛋白。經(jīng)Western blotting分析表明該蛋白具有與PRRSV克 隆抗體具有免疫反應(yīng)性。
[0028] 本發(fā)明的有益效果是：本研究首次構(gòu)建了PRRSV GP5基因乳酸菌表達(dá)載體，用 Nisin誘導(dǎo)表達(dá)后，經(jīng)過(guò)SDS-PAGE、Western blotting和IFA分析，表明外源基因 GP5成功地 在乳酸乳球菌中獲得了表達(dá)，并且具用反應(yīng)原性，這為開(kāi)發(fā)安全、有效、廉價(jià)的口服疫苗奠 定基礎(chǔ)，同時(shí)利用這一平臺(tái)也可將其它引起豬類(lèi)高度接觸性傳染病的病原微生物的保護(hù)性 抗原基因轉(zhuǎn)入益生的乳酸乳球菌中，使其表達(dá)。
【附圖說(shuō)明】
[0029]圖 1 PRRSV GP5基因 RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果M:DL5000Marker;l-4:部分分離株RT-PCR產(chǎn) 物。
[0030] 圖2 dGP5PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果M:DL2000Marker; 1 :YN03-2012分離株P(guān)CR產(chǎn)物。
[0031] 圖3 pNZ8149-dGP5的雙酶切（NcoI、XbaI)鑒定M:DL5000Marker;l:pNZ8149-dGP5 質(zhì)粒；2pNZ8149-dGP5雙酶切產(chǎn)物。
[0032] 圖4不同濃度誘導(dǎo)重組菌的SDS-PAGE分析M:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1 :NZ39002:未誘 導(dǎo)重組菌3_6: 5、15、20、25ng/mL的Nisin誘導(dǎo)表達(dá)菌。
[0033] 圖5表達(dá)產(chǎn)物的間接免疫熒光分析(200 X)A:誘導(dǎo)的空載體乳酸乳球菌B:誘導(dǎo)的 重組乳酸乳球菌。
【具體實(shí)施方式】
[0034] -段用于豬繁殖與呼吸綜合征病毒重組乳酸菌表達(dá)的基因，本發(fā)明該基因段為豬 繁殖與呼吸綜合征病毒基因組中的GP5基因。
[0035] -對(duì)擴(kuò)增豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5基因用的引物，從豬繁殖與呼吸綜合征病 毒中提取總RNA為模版，用特異性引物GP5-F/GP5-R，RT-PCR方法擴(kuò)增出其GP5基因，本發(fā)明 的引物基因?yàn)?，GP5-F: 5' CATGAGGTGGGCAACTGTT 3'，GP5-R: 5' GTCATGTACCCGAAGGTGA 3'。
[0036] -對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒分析用的酶切插入位點(diǎn)，其酶切插入位點(diǎn)為Ncol和 Xbal 〇
[0037] 一對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5基因克隆用的引物，該引物對(duì)為，dGP5-F: 5'
[0038] CATGCCATGGGCAACAACAACAGCTCTCATATTCA 37
[0039] dGP5-R:5'GCTCTAGACTAGAGACGACCCCATCGTTCC 3'。
[0040] -種豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5基因重組乳酸菌的構(gòu)建方法，包括以下步驟： (1)以從豬繁殖與呼吸綜合征病料中提取的總RNA為模版，用引物GP5-F/GP5-R，RT-PCR方法 擴(kuò)增出GP5基因，并將其克隆至pMD19-T載體中，進(jìn)行核苷酸序列分析;所述的引物：
[0041] GPS-F^^ATGAGGTGGGCAACTGTT 37 ,GP5-R： 57 GTCATGTACCCGAAGGTGA 37 ；
[0042] (2)以上述克隆得到的質(zhì)粒pMD 19-GP5為模版，用帶有Nco I和Xba I酶切位點(diǎn)的一對(duì) 擴(kuò)增缺失信號(hào)肽的GP5基因（dGP5)表達(dá)引物:dGP5-F/dGP5-R擴(kuò)增dGP5基因，將其克隆至丁-Vector pMD19(simple)后測(cè)序，充分培養(yǎng)陽(yáng)性重組菌，提取質(zhì)粒pMD19(simple)_dGP5;所述 的引物：
[0043] dGP5-F：57 CATGCCATGGGCAACAACAACAGCTCTCATATTCA 37
[0044] dGP5-R:5'GCTCTAGACTAGAGACGACCCCATCGTTCC 3';
[0045] (3)將上述提取得到的質(zhì)粒pMD19(simple)-dGP5用NcoI、XbaI雙酶切后與用同種 酶雙酶切的載體連接，乙醇沉淀法純化濃縮連接產(chǎn)物，電轉(zhuǎn)化感受態(tài)乳酸乳球菌NZ3900，所 述載體為PNZ8149;
[0046] (4)篩選陽(yáng)性乳酸乳球菌，提取陽(yáng)性乳酸菌中重組質(zhì)粒酶切鑒定并對(duì)插入序列進(jìn) 行測(cè)序。
[0047] 一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5基因重組乳酸菌的構(gòu)建的表達(dá)方法，本發(fā)明將 步驟4)篩選到的陽(yáng)性克隆，經(jīng)Ni s in誘導(dǎo)后，采用SDS-PAGE進(jìn)行鑒定，可見(jiàn)約19kDa的融合蛋 白，經(jīng)Western blotting和IFA分析表明該蛋白具有與PRRSV克隆抗體結(jié)合具有免疫反應(yīng) 性。
[0048] 實(shí)施例1
[0049] ( - )豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5基因的克隆及序列分析
[0050] 1.主要試驗(yàn)材料及分子生物學(xué)試劑
[0051] (1)樣品來(lái)源
[0052]從我國(guó)云南省各個(gè)不同地區(qū)采集疑似PRRSV病料，取肺臟、脾臟、淋巴結(jié)等組織樣 品，分裝凍存管中并保存于_80°C。
[0053] (2)菌種與質(zhì)粒
[0054] 大腸桿菌DH5a及PMD19-T Vector均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。
[0055] (3)主要材料與試劑
[0056] RNAiso Plus、PrimeScript Reverse Transcriptase、RT_PCR反應(yīng)試劑、DNA Marker均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；DNA膠回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有 限公司，普通質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。
[0057] (4)自制試劑
[0058] 100mg/mL氨芐青霉素、0· 1%的DEPC水溶液。
[0059] (5)培養(yǎng)基
[0060] LB 培養(yǎng)液、LB (Amp/X-ga 1 /1PTG)培養(yǎng)基。
[0061] 2.引物的設(shè)計(jì)與合成
[0062] 參考661^&1^中的美洲型毒株￥1?-23322(1]87392)、1乂六1^?112445)、!111財(cái) (EF635006)等基因序列應(yīng)用Primer5軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增GP5全長(zhǎng)基因的引物:GP5-F/GP5-R，引物 序列如下：
[0063] GP5-F:5'CATGAGGTGGGCAACTGTT 3'
[0064] GP5-R:5'GTCATGTACCCGAAGGTGA 3'
[0065] 3.樣品RNA的提取及RT-PCR擴(kuò)增
[0066] 按照RNAiso Plus試劑操作說(shuō)明書(shū)，從樣品（病料組織和弱毒疫苗）中提取RNA，主 要操作步驟：
[0067] (1)對(duì)超低溫保存的病料組織稱(chēng)重后迅速移至液氮預(yù)冷的研缽中，使用配套的研 杵研磨組織，研磨過(guò)程中不斷加入液氮直至研磨結(jié)束(粉末狀）。弱毒疫苗樣品的處理:使用 DEPC水溶解疫苗瓶?jī)?nèi)的凍干粉配制成弱毒疫苗稀釋液。
[0068] (2)將研磨好的組織粉末轉(zhuǎn)移至DEPC處理過(guò)的1.5mL的離心管中，加入lmL RNAiso Plus(或者吸取300yL弱毒疫苗稀釋液加入700yL RNAiso Plus中），反復(fù)震蕩，室溫靜置 5min，使其充分裂解。
[0069] (3)加入氯仿(RNAiso Plus的1/5體積量），蓋緊離心管蓋，混合至溶液乳化呈乳白 色。
[0070] (4)4°C低溫離心機(jī)12,000g離心10min。從離心機(jī)中小心取出離心管，液體分為三 層，即：無(wú)色的上清液(含RNA)、中間的白色蛋白層（大部分為DNA)及帶有顏色的下層有機(jī) 相。
[0071] (5)小心吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一新的1.5mL離心管中。向上清中加入等體積的異丙 醇，上下顛倒離心管充分混勻后，_20°C靜置10min。
[0072] (6) 12，000g 4°C離心10min。棄去上清，用lmL預(yù)冷的75 %的乙醇清洗沉淀，并離心 棄去上清，在超凈工作臺(tái)內(nèi)打開(kāi)離心管蓋，揮發(fā)掉殘留的乙醇。
[0073] (7)用DEPC 水溶解 RNA，-80 Γ 保存。
[0074]以提取的RNA為模板，按表1-1在冰盒上配好體系后，輕輕混勻，42°C水浴lh，產(chǎn)物 于-20°C保存。取2yL cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系見(jiàn)表1 -2。
[0075] 表1-lcDNA合成體系
[0076]
[0077]
[0078]
[0079]
[0080] PCR反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性4min;94°C變性40s，58°C退火45s，72°C延伸50s，共30 個(gè)循環(huán)；72°C終延伸8min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后的產(chǎn)物用1 %的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，120V恒壓 20min，電泳結(jié)束后凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果并拍照記錄。獲得的目的片段與預(yù)期大小相符， 大小為835bp結(jié)果見(jiàn)圖1。
[0081 ] 4. GP5基因的克隆與測(cè)序
[0082]按照天根普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒的操作說(shuō)明對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收操作， 回收產(chǎn)物在16°C條件下與PMD19-T載體連接4h以上，連接體系見(jiàn)表1-3。
[0083] 表1-3連接反應(yīng)體系
[0084]
[0085] 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，主要步驟為：
[0086] (1)于超低溫冰箱中取出凍存的E.coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞置于冰盒上使其融化。 [0087] (2)將10yL的連接產(chǎn)物全部加入到100yL的感受態(tài)細(xì)胞中輕輕混勻冰浴30min。 [0088] (3) 42 Γ熱應(yīng)激90s，置于冰盒中5min。
[0089] (4)加入800yL的LB培養(yǎng)基，37 Γ震蕩培養(yǎng)2h。
[0090] (5)取100yL菌液無(wú)菌操作均勻涂布在事先配置好的LB(Amp/X-gal/IPTG)培養(yǎng)基 上，37 °C恒溫培養(yǎng)12h以上。
[0091] (6)挑取白色菌落接種于2mL LB(Amp+)培養(yǎng)基中，37°C震蕩搖菌后提取質(zhì)粒并作 PCR鑒定。
[0092]質(zhì)粒提取主要步驟為：離心待處理的菌液lmL，棄去上清，加入無(wú)色溶液RB(含 Rnase A)，吹打使細(xì)菌懸浮;加入藍(lán)色溶液LB溫和地上下翻轉(zhuǎn)4-8次，使菌體充分裂解，溶液 變?yōu)橥该鞯乃{(lán)色，最長(zhǎng)裂解時(shí)間不能超過(guò)5min;加入黃色溶液NB，輕柔上下顛倒4-8次，形成 緊實(shí)的黃色凝集塊，室溫下靜置2min;12000g離心5min，小心吸取上清加入吸附柱中， 12000g離心lmin，棄去流出液;加入650yL溶液WB，12000g離心lmin，棄去流出液；12000g離 心2min，徹底除去殘留的WB;將離心柱置于干凈的1.5mL的離心管中，在柱中央小心的加入 預(yù)熱至55°C的30-50yL EB或去離子水（pH>7.0)，室溫靜置2min;12000g離心2min，洗脫 DNA，產(chǎn)物于-20°C保存。
[0093] 以提取出的質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR鑒定，體系與程序步驟與上述相同，將陽(yáng)性克隆送 華大基因公司測(cè)序。
[0094] 5.GP5基因序列分析
[0095] 從GenBank中選取參考序列，其中包括美洲型代表株、歐洲型代表株采用DNAStar 生物學(xué)軟件將測(cè)序結(jié)果與參考毒株基因序列進(jìn)行分析。得到片段大小為835bp的GP5基因， 該基因與美洲代表株VR-2332同源性為88.4%~89.7%，而與歐洲型代表株LV同源性?xún)H為 62.9% ~63.5%〇
[0096](二）乳酸菌重組表達(dá)質(zhì)粒pNZ8149-dGP5的構(gòu)建
[0097] 1.主要試驗(yàn)材料及分子生物學(xué)試劑
[0098] (1)菌種與質(zhì)粒
[0099] 大腸桿菌DH5a及T-Vector pMD19(simple)均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；乳 酸乳球菌表達(dá)載體PNZ8149及Lactococcus lactis NZ3900及Lactococcus lactis NZ3900 由愛(ài)爾蘭科克大學(xué)惠贈(zèng)。
[0100] (2)酶和試劑
[0101] 限制性?xún)?nèi)切酶NcoI和XbaI為T(mén)aKaRa公司產(chǎn)品；DNA Marker購(gòu)自寶生物工程(大連） 有限公司;DNA膠回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司，普通質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自 北京全式金生物技術(shù)有限公司。
[0102] (3)培養(yǎng)基
[0103] M17培養(yǎng)基(無(wú)碳源）、LM17培養(yǎng)基、LM17恢復(fù)培養(yǎng)基、GSGM17培養(yǎng)基、Ellike培養(yǎng) 基。
[0104] ⑷自制試劑
[0105] 0.5mol/L EDTA(pH 8.0)、10%甘油。
[0106] 2.引物設(shè)計(jì)及合成
[0107]根據(jù)華大基因公司測(cè)序結(jié)果和SignalP 4.1服務(wù)器設(shè)計(jì)去除信號(hào)肽的GP5基因 (dGP5)表達(dá)引物dGP5-F/dGP5-R。其中dGP5-F引物中酶切位點(diǎn)為NcoI:序列CCATGG。dGP5-R 引物中酶切位點(diǎn)Xbal，序列：TCTAGA，dGP5-F/dGP5-R擴(kuò)增片段用于乳酸乳球菌表面表達(dá)載 體PNZ8149的重組構(gòu)建。引物由寶生物(大連)有限公司合成。
[0108] dGP5-F:5 ' CATGCCATGGGCAACAACAACAGCTCTCATATTCA 3'
[0109] dGP5~R：5；GCTCTAGACTAGAGACGACCCCATCGTTCC 3'
[0110] 3.dGP5基因的PCR擴(kuò)增
[0111] (1)以PMD19-GP5陽(yáng)性質(zhì)粒為模板，用缺失信號(hào)肽的亞克隆引物dGP5-F/dGP5-R進(jìn) 行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性4min; 94°C變性40s，60°C退火45s，72°C延伸50s，共 35個(gè)循環(huán);72°C終延伸SmiruPCR反應(yīng)體系同表1-2。擴(kuò)增得到513bp的特異性條帶，與預(yù)期目 的片段大小相符。結(jié)果如圖2。
[0112] (2)PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后進(jìn)行膠回收純化，純化產(chǎn)物送華大基因 公司測(cè)序。對(duì)測(cè)序正確的PCR產(chǎn)物與載體T-Vector pMD19(simple)進(jìn)行連接，該載體消除了 多克隆酶切位點(diǎn)，方便進(jìn)行雙酶切并準(zhǔn)確獲得目的片段。水浴16°C連接4h以上，并轉(zhuǎn)化DH5a 感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)藍(lán)白斑篩選，挑取白色單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，將陽(yáng)性質(zhì)粒命名為 pMD19(simple)-dGP5，-2(TC 保存。
[0113] 4.pMD19-dGP5及乳酸乳球菌表面表達(dá)載體pNZ8149的雙酶切
[0114] 按照普通質(zhì)粒提取試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行提取操作，提取完畢后，用Ncol和Xbal雙 酶切，pMD19(simple)-dGP5雙酶切操作。乳酸乳球菌表面表達(dá)載體pNZ8149的雙酶切體系同 表1-4。37°(：水浴6h。將pMD19(simple)-dGP5和乳酸乳球菌表面表達(dá)載體pNZ8149大量雙酶 切的產(chǎn)物分別用1%的瓊脂糖電泳后，再次進(jìn)行膠回收操作，回收產(chǎn)物_20°C保存。酶切完畢 后取5yL酶切產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切效果。對(duì)提取的乳酸菌重組表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行 Ncol和Xbal雙酶切，得到與預(yù)期結(jié)果一致的約513bp的片段（圖3)。本發(fā)明的重組乳酸菌在 曲靖市千村農(nóng)牧科技有限公司、云南農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院生豬綜合試驗(yàn)示范場(chǎng)等一些養(yǎng)殖單 位進(jìn)行了贈(zèng)送推廣，效果十分顯著。
[0115] 表l-4Nco I、Xba I雙酶切反應(yīng)體系
[0116]
[0117] 5.乳酸乳球菌NZ3900感受態(tài)的制備
[0118] 按照Mobitec公司的說(shuō)明書(shū)提供的感受態(tài)制備方法進(jìn)行操作：
[0119] (1)將-80°C保存的菌株接種到5mL的GSGM17中，30°C靜置培養(yǎng)過(guò)夜。
[0120] (2)取5mL培養(yǎng)好的菌液轉(zhuǎn)接到50mL GSGM17中，30°C靜置培養(yǎng)過(guò)夜。
[0121] (3)將50mL菌液稀釋到400mL GSGM17中。培養(yǎng)到0D600 = 0.2-0.3(大約31〇。4°(：離 心機(jī)離心，6000g 20min，棄上清收集沉淀。
[0122] (4)用400mL0.5M蔗糖，10%甘油（4°C)清洗細(xì)菌，然后離心（6000g)10min，棄上清 收集沉淀。
[0123] (5)細(xì)菌重懸于200mL 0.5M蔗糖，10%甘油，50mM EDTA(4°C)，重懸后的細(xì)菌置于 冰上15min，然后離心10min，棄上清收集沉淀。
[0124] (6)用100mL0.5M蔗糖，10%甘油（4°C)清洗細(xì)菌，然后離心(6000g)10min，棄上清 收集沉淀。
[0125] (7)細(xì)菌重懸于4mL 0.5M蔗糖，10%甘油(4°C)。
[0126] (8)每管100yL分裝于1.5mL的無(wú)菌離心管中，置于-80°C保存。
[0127] 6.PRRSV dGP5基因乳酸乳球菌表達(dá)載體的構(gòu)建及電轉(zhuǎn)化
[0128] (1)將雙酶切后回收的dGP5基因和pNZ8149載體進(jìn)行連接，連接體系見(jiàn)表1-5，16°C 連接過(guò)夜。
[0129] 表1-5連接反應(yīng)體系
[0132] (2)連接產(chǎn)物的純化(采用乙醇沉淀法）：準(zhǔn)備1.5mL的離心管，在反應(yīng)液中加入1 /
[0130]
[0131] 10體積的3M CH3⑶ONa (pH5.2)和2.5倍體積的無(wú)水乙醇。-20 °C靜置20min或-80 °C靜置 lOmin。然后4°C離心10min，棄去上清，加入lmL的70%冷乙醇清洗沉淀，離心后棄去上清并 干燥2min，加入10yL ddH2〇溶解。
[0133] (3)連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化入乳酸菌NZ3900:從-80 °C冰箱中取出感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上 溶解。溶解后輕輕加入1 〇yL的連接產(chǎn)物混勻，轉(zhuǎn)入2mm預(yù)冷的電擊杯中準(zhǔn)備電擊。電擊參數(shù)： 電壓2.5KV，電容25yF，電阻200Ω。電擊時(shí)間5ms，電擊后加入lmL預(yù)冷的LM17恢復(fù)培養(yǎng)基，將 菌液轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，冰上靜置5min，30°C靜置培養(yǎng)2h。取100yL菌液涂布于Ellike平 板，30°C靜置培養(yǎng)24h，觀察有無(wú)黃色菌落。結(jié)果在紫色的背景上可以看到黃色的單菌落，挑 取黃色單菌落進(jìn)一步劃線純化。
[0134] 7.乳酸乳球菌質(zhì)粒DNA的提取
[0135] 挑取黃色單菌落接種于5mL的LM17培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，30°C靜置培養(yǎng)24h后，采用 溶菌酶預(yù)處理乳酸乳球菌和普通質(zhì)粒小題試劑盒相相結(jié)合的方法提取質(zhì)粒DNA。取2mL培養(yǎng) 后的菌液，12000g離心5min，棄上清，收集菌體。取20mg/mL的溶菌酶250mL重懸菌體，37°C水 浴lh，期間多次上下顛倒樣品。然后按照普通質(zhì)粒小提試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行質(zhì)粒提取。
[0136] 8.PRRSV dGP5乳酸乳球菌的表達(dá)載體的雙酶切、PCR鑒定及序列測(cè)定
[0137] 將上述提取的質(zhì)粒，用Ncol和Xbal雙酶切，酶切體系同表1-4。
[0138] 輕輕混勻以上組分，37°C水浴4h。同時(shí)取2yL提取的質(zhì)粒作為模板，用引物dGP5-F/ dGP5-R進(jìn)行PCR鑒定，反應(yīng)體系同表1-2 JCR程序?yàn)?94 °C預(yù)變性4min; 94 °C變性40s，60 °C退 火45s，72°C延伸50s，共35個(gè)循環(huán);72°C終延伸8min。取5yL酶切產(chǎn)物及PCR產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂 糖凝膠電泳，鑒定酶切和PCR結(jié)果。鑒定為陽(yáng)性的重組表達(dá)質(zhì)粒送華大基因測(cè)序，測(cè)序正確 的質(zhì)粒命名為pNZ8149-dGP5。
[0139] (三)重組質(zhì)粒pNZ8149_dGP5在乳酸乳球菌中的表達(dá)鑒定
[0140] 1.主要試驗(yàn)材料及分子生物學(xué)試劑
[0141] (1)菌種與質(zhì)粒
[0142] 重組質(zhì)粒pNZ8149-dGP5由本人構(gòu)建、乳鏈菌肽(Nisin)購(gòu)自Sigma公司。
[0143] (2)主要材料與試劑
[0144] 蛋白Marker購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；PRRSV高免血清由本實(shí)驗(yàn)室制備， FITC標(biāo)記的兔抗豬IgG購(gòu)自廣州華拓生物科技有限公司。
[0145] (3)培養(yǎng)基:誘導(dǎo)培養(yǎng)基
[0146] ⑷自制試劑
[0147] 嚇了6(2411^/11^)、、？83緩沖液、30%丙烯酰胺混合液、1.5111〇1/11^8(?!18.8)、 1 · 0mo 1/L Tri s (pH6 · 8)、10 % SDS、10 % 過(guò)硫酸銨、電極緩沖液(pH8 · 3)、2 X SDS上樣緩沖液、 考馬斯亮藍(lán)染色液、脫色液、轉(zhuǎn)移緩沖液、1 〇 X麗春紅染液。
[0148] 2.重組乳酸乳球菌的誘導(dǎo)表達(dá)
[0149] (1)將保存的pNZ8149-dGP5/NZ3900菌種和空載體菌種以1:100的比例，接種到誘 導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，30 °C靜置培養(yǎng)8-1 Oh，使其活化。
[0150] (2)將活化的細(xì)菌，再次以1:100接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，30°C靜置培養(yǎng)到0D600 = 0.6〇
[0151] (3)采用終濃度5、15、20、25即/1^的附8丨1130°(：誘導(dǎo)611后終止培養(yǎng)，菌液置于4 1€ 保存，用于SDS-PAGE檢驗(yàn)表達(dá)效果。
[0152] 3.表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析
[0153] (1)樣品制備:取誘導(dǎo)后的菌液lmL，12000g離心3min，棄去上清并用200yL的roS緩 沖液清洗沉淀后，12000g再次離心3min并棄去上清。加入100yL 20mg/mL的溶菌酶，37°C水 浴lh，期間需多次輕輕顛倒。12000g離心3min，棄去上清，加入50yL的roS及等量的2 X SDS凝 膠上樣緩沖液，輕輕吹打混勾后，沸水中煮沸l(wèi)〇min，12000g離心lmin取上清。
[0154] (2)制膠:12 %分離膠的配制體系見(jiàn)表1-6，5 %濃縮膠的配制見(jiàn)表1-7。
[0155] 表1-6分離膠配制體系
[0156]
[0157] 混勻以上組分后沿玻璃板灌注凝膠，上層加入異丙醇封閉，室溫聚合lh以上。[0158] 表1-7濃縮膠配制體系
[0159]
[0160]
[0161]棄去分離膠上層的異丙醇，并用ddH20多次沖洗后用吸水紙吸干殘余水分。輕輕混 勻以上組分，灌入膠板，插入制膠的梳子，室溫聚合lh以上。
[0162] (3)電泳:凝膠制備完成后，輕輕取下梳子，按照蛋白垂直電泳儀說(shuō)明書(shū)組裝好電 泳裝置，加入足量的電泳緩沖液，加樣孔加入10yL樣品，120V恒壓電泳至溴酚藍(lán)接近底邊1-2cm時(shí)停止。
[0163] (4)染色脫色：用考馬斯亮藍(lán)R250染色液在水平搖床上染色2h，然后凝膠用脫色液 浸泡后放入水平搖床脫色，脫色期間多次更換脫色液至背景清晰為止。
[0164] 分別以終濃度5、15、20、25ng/mL的 Ni sin 對(duì) pNZ8149-dGP5/NZ3900進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)， 發(fā)現(xiàn)pNZ8149-dGP5/NZ3900在19kDa左右處有特異性蛋白表達(dá)（圖4)。
[0165] 4.表達(dá)產(chǎn)物的IFA檢測(cè)
[0166] (1)取誘導(dǎo)后的 pNZ8149-dGP5/NZ3900 和 pNZ8149/NZ3900 各 1 mL 菌液，4°C12000g 離心3min，收集沉淀并棄去上清，使用PBS緩沖溶液對(duì)沉淀洗滌3次。
[0167] (2)向沉淀中加入1 mL 1:50倍稀釋的豬抗PRRSV高免血清，懸浮混勻，37°C作用30 分鐘，4°C 12000g離心3min離心收集沉淀，使用PBS緩沖溶液洗滌沉淀3次。
[0168] (3)向沉淀中加入1 mL 1:200倍稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗豬熒光抗體，懸浮混勻，37 。(:避光作用30min，4°C12000g離心3min，收集沉淀，使用PBS緩沖溶液沉淀3次。
[0169] (4)菌體沉淀懸浮于300yLPBS緩沖溶液中，取適量涂在準(zhǔn)備好的無(wú)熒光載玻片黑 色濾膜上，自然干燥，冷丙酮4°C固定30min，熒光顯微鏡觀察。
[0170]重組菌在熒光顯微鏡下可以看到明顯的綠色熒光（圖5)，但是與本實(shí)驗(yàn)處理的菌 體數(shù)量相比呈現(xiàn)熒光的菌體數(shù)量偏少。空載體未出現(xiàn)綠色熒光，僅出現(xiàn)暗綠色的背景弱光。 表明重組表達(dá)的蛋白位于菌體表面，且具有反應(yīng)原性。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一段用于豬繁殖與呼吸綜合征病毒重組乳酸菌表達(dá)的基因，其特征在于，該基因段 為豬繁殖與呼吸綜合征病毒基因組中的GP5基因。2. -對(duì)擴(kuò)增豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5基因用的引物，從豬繁殖與呼吸綜合征病毒 中提取總RNA為模版，用特異性引物GP5-F/GP5-R，RT-PCR方法擴(kuò)增出其GP5基因，其特征在3. -對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒分析用的酶切插入位點(diǎn)，其特征在于，其酶切插入位 點(diǎn)為Nco I和Xba I。4. 一對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5基因克隆用的引物，其特征在于，該引物對(duì)為， dGPS-FWCATGCCATGGGCAACAACAACAGCTCTCATATTCA 37 dGP5-R ： 57 GCTCTAGACTAGAGACGACCCCATCGTTCC 37 〇5. -種豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5基因重組乳酸菌的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以 下步驟：（1)以從豬繁殖與呼吸綜合征病料中提取的總RNA為模版，用引物GP5-F/GP5-R，RT-PCR方法擴(kuò)增出GP5基因，并將其克隆至pMD19-T載體中，進(jìn)行核苷酸序列分析;所述的引物： GPS-F^^ATGAGGTGGGCAACTGTT 37 ,GP5-R： 57 GTCATGTACCCGAAGGTGA 37 ； (2) 以上述克隆得到的質(zhì)粒pMD 19-GP5為模版，用帶有Nco I和Xba I酶切位點(diǎn)的一對(duì)擴(kuò) 增缺失信號(hào)肽的GP5基因（dGP5)表達(dá)引物：dGP5-F/dGP5-R擴(kuò)增dGP5基因，將其克隆至丁-Vector pMD19(simple)后測(cè)序，充分培養(yǎng)陽(yáng)性重組菌，提取質(zhì)粒pMD19(simple)_dGP5;所述 的弓 I 物：dGPSU7 CATGCCATGGGCAACAACAACAGCTCTCATATTCA 37 dGP5-R： 57 GCTCTAGACTAGAGACGACCCCATCGTTCC 3,； (3) 將上述提取得到的質(zhì)粒pMD19(Simple)-dGP5用Nco I、Xba I雙酶切后與用同種酶 雙酶切的載體連接，乙醇沉淀法純化濃縮連接產(chǎn)物，電轉(zhuǎn)化感受態(tài)乳酸乳球菌NZ3900，所述 載體為PNZ8149; (4) 篩選陽(yáng)性乳酸乳球菌，提取陽(yáng)性乳酸菌中重組質(zhì)粒酶切鑒定并對(duì)插入序列進(jìn)行測(cè) 序。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的的一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5基因重組乳酸菌的構(gòu)建 的表達(dá)方法，其特征在于，將步驟4)篩選到的陽(yáng)性克隆，經(jīng)Nisin誘導(dǎo)后，采用SDS-PAGE進(jìn)行 鑒定，可見(jiàn)約19kDa的融合蛋白，經(jīng)Western blotting和IFA分析表明該蛋白具有與PRRSV克 隆抗體結(jié)合具有免疫反應(yīng)性。
【文檔編號(hào)】C12N15/40GK106086044SQ201610541306
【公開(kāi)日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年7月11日
【發(fā)明人】張以芳, 馬志亮, 楊潔, 周玉照, 張辰宇, 鄭錦玲, 劉旭川
【申請(qǐng)人】云南農(nóng)業(yè)大學(xué)