蛋白質lmm5.1在調控植物抗病性與超敏反應性中的應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了蛋白質LMM5.1在調控植物抗病性與超敏反應性中的應用。本發(fā)明公開的應用中，蛋白質LMM5.1所述蛋白質LMM5.1是如下A1)、A2)或A3)：A1)氨基酸序列是序列2的蛋白質；A2)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白質；A3)在A1)或A2)的N端或/和C端連接標簽得到的融合蛋白質。實驗證明，本發(fā)明的LMM5.1與植物的抗病性相關，還可以調控植物的超敏反應性，可以利用LMM5.1及其編碼基因調控植物的抗病性與超敏反應性。CGMCC No.1194720160527
【專利說明】
蛋白質LMM5.1在調控植物抗病性與超敏反應性中的應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術領域中蛋白質LMM5.1在調控植物抗病性與超敏反應性中的 應用。
【背景技術】
[0002] 為了應對自然環(huán)境中病原菌的進攻，植物進化出復雜的防御機制。其中，最有效的 方式之一是超敏反應(Hypersensitive response，HR)。超敏反應是指當植物受到非親和病 原菌侵染后，被侵染部位細胞迅速死亡，從而限制病原菌增殖的一種防衛(wèi)反應，屬于細胞程 序性死亡（programmed cell death，PCD)(Greenberg, 1997)。類病變突變體（lesion mimic mutants)在沒有病原菌侵染的情況下，就能自發(fā)的形成類似超敏反應的壞死斑（lesion)， 因此類病變突變體是研究植物細胞死亡、超敏反應和防衛(wèi)反應的重要材料。類病變突變體 最早在玉米中報道(Hoisington et al.，1982)，隨后在大麥(Wolter et al.，1993)、擬南 芥（Dietrich et al.，1994;Greenberg and Ausubel，1993;Greenberg et al.,1994)、水 稻(Takahashi et al. ,1999)等物種中均有發(fā)現(xiàn)。水稻作為重要的糧食作物和模式植物，對 其細胞死亡和抗病機制的研究具有重要的意義。

【發(fā)明內容】

[0003] 本發(fā)明所要解決的技術問題是如何調控植物的抗病性與超敏反應性。
[0004] 為解決上述技術問題，本發(fā)明首先提供了蛋白質LMM5.1在調控植物抗病性和/或 調控植物超敏反應性中的應用;所述蛋白質LMM5.1是如下Al)、A2)或A3):
[0005] A1)氨基酸序列是序列2的蛋白質；
[0006] A2)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或 缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白質；
[0007] A3)在A1)或A2)的N端或/和C端連接標簽得到的融合蛋白質。
[0008] 其中，序列2由655個氨基酸殘基組成。
[0009] 為了使A1)中的蛋白質便于純化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的 蛋白質的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標簽。
[0010] 表1、標簽的序列
[0011]
[0012]
[0013] 上述A2)中，所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過10 個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。
[0014] 上述A2)中LMM5.1可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。
[0015] 上述A2)中LMM5.1的編碼基因可通過將序列1或序列3的第1490-6521位所示的DNA 序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變， 和/或在其5'端和/或3'端連上表1所示的標簽的編碼序列得到。
[0016] 為解決上述技術問題，本發(fā)明還提供了與LMM5.1相關的生物材料在調控植物抗病 性和/或調控植物超敏反應性中的應用;所述生物材料為下述B1)至B16)中的任一種：
[0017] B1)編碼LMM5.1的核酸分子；
[0018] B2)含有B1)所述核酸分子的表達盒；
[0019] B3)含有B1)所述核酸分子的重組載體；
[0020] B4)含有B2)所述表達盒的重組載體；
[0021 ] B5)含有B1)所述核酸分子的重組微生物；
[0022] B6)含有B2)所述表達盒的重組微生物；
[0023] B7)含有B3)所述重組載體的重組微生物；
[0024] B8)含有Μ)所述重組載體的重組微生物；
[0025] Β9)含有Β1)所述核酸分子的轉基因植物細胞系；
[0026] Β10)含有Β2)所述表達盒的轉基因植物細胞系；
[0027] Β11)含有Β1)所述核酸分子的轉基因植物組織；
[0028] Β12)含有Β2)所述表達盒的轉基因植物組織；
[0029] Β13)含有Β1)所述核酸分子的轉基因植物器官；
[0030] Β14)含有Β2)所述表達盒的轉基因植物器官；
[0031] Β15)降低LMM5.1表達的核酸分子；
[0032] Β16)含有Β15)所述核酸分子的表達盒、重組載體、重組微生物或轉基因植物細胞 系。
[0033] 上述應用中，Β1)所述核酸分子為如下bl)_b4)中任一種：
[0034] bl)編碼序列是序列表中序列3的第1490-6521位核苷酸的cDNA分子或DNA分子；
[0035] b2)核苷酸序列是序列表中序列1的cDNA分子或DNA分子；
[0036] b3)與bl)或b2)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且編碼LMM5.1的 cDNA分子或基因組DNA分子；
[0037] b4)在嚴格條件下與bl)或b2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼LMM5.1的cDNA分子 或基因組DNA分子；
[0038] B2)所述表達盒為序列3所示的DNA分子；
[0039] B15)所述核酸分子為與序列3的第1490-6521位或序列1所不的DNA分子中任一片 段反向互補的DNA分子。
[0040] 其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA;所述核酸分子也可 以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
[0041]其中，序列1由1968個核苷酸組成，編碼序列2所示的蛋白質。序列3的第1-1489位 所示的DNA分子可以啟動LMM5.1基因的轉錄，序列3的第6522-8075位所示的DNA分子可以終 止LMM5.1基因的轉錄，序列3的第1490-6521位為LMM5.1基因的基因組序列。
[0042]本領域普通技術人員可以很容易地采用已知的方法，例如定向進化和點突變的方 法，對本發(fā)明的編碼LMM5.1的核苷酸序列進行突變。那些經(jīng)過人工修飾的，具有與本發(fā)明分 離得到的LMM5.1的核苷酸序列75%或者更高同一性的核苷酸，只要編碼11^5.1且具有 LMM5.1功能，均是衍生于本發(fā)明的核苷酸序列并且等同于本發(fā)明的序列。
[0043]這里使用的術語"同一性"指與天然核酸序列的序列相似性。"同一性"包括與本發(fā) 明的編碼序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質的核苷酸序列具有75%或更高，或85%或 更高，或90%或更高，或95%或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或計算機軟件 進行評價。使用計算機軟件，兩個或多個序列之間的同一性可以用百分比（％ )表示，其可以 用來評價相關序列之間的同一性。
[0044] 上述應用中，所述嚴格條件是在2 X SSC，0.1 % SDS的溶液中，在68°C下雜交并洗膜 2次，每次5min，又于0.5 X SSC，0.1 % SDS的溶液中，在68 °C下雜交并洗膜2次，每次15min; 或，0.1 X SSPE(或0.1 X SSC)、0.1 % SDS的溶液中，65°C條件下雜交并洗膜。
[0045] 上述75%或75%以上同一性，可為80%、85%、90%或95%以上的同一性。
[0046] 上述應用中，B2)所述的含有編碼LMM5.1的核酸分子的表達盒(LMM5.1基因表達 盒），是指能夠在宿主細胞中表達LMM5.1的DNA，該DNA不但可包括啟動LMM5.1基因轉錄的啟 動子，還可包括終止LMM5.1基因轉錄的終止子。進一步，所述表達盒還可包括增強子序列。 可用于本發(fā)明的啟動子包括但不限于:組成型啟動子，組織、器官和發(fā)育特異的啟動子，和 誘導型啟動子。啟動子的例子包括但不限于：花椰菜花葉病毒的組成型啟動子35S:來自西 紅柿的創(chuàng)傷誘導型啟動子，亮氨酸氨基肽酶（〃1^^〃，〇1 &〇等人（1999)?1&的？1^以〇1120: 979-992);來自煙草的化學誘導型啟動子，發(fā)病機理相關1(PR1)(由水楊酸和BTH(苯并噻二 唑-7-硫代羥酸S-甲酯)誘導）；西紅柿蛋白酶抑制劑II啟動子(PIN2)或LAP啟動子(均可用 茉莉酮酸甲酯誘導）；熱休克啟動子(美國專利5，187,267);四環(huán)素誘導型啟動子(美國專利 5,057,422);種子特異性啟動子，如谷子種子特異性啟動子?？128(0價010631398(中國專利 [0047] 200710099169.7))，種子貯存蛋白質特異的啟動子（例如，菜豆球蛋白、napin， oleosin和大豆beta conglycin的啟動子(Beachy等人（1985)EMB0 J.4:3047-3053))。它們 可單獨使用或與其它的植物啟動子結合使用。此處引用的所有參考文獻均全文引用。合適 的轉錄終止子包括但不限于：農桿菌胭脂堿合成酶終止子(N0S終止子）、花椰菜花葉病毒 CaMV 35S終止子、tml終止子、豌豆rbcS E9終止子和胭脂氨酸和章魚氨酸合酶終止子（參 見，例如：Odell等人（I985)Nature 313:810;Rosenberg等人（1987)Gene，56:125;Guerineau 等人（1991)Mol .Gen.Genet,262:141 ;Proudfoot(1991)Cell ,64:671 ;Sanfacon等人Genes Dev.，5:141;Mogen等人（1990)Plant Cell，2:1261 ;Munroe等人（1990)Gene，91:151; Ballad等人（1989)Nucleic Acids Res.l7:7891;Joshi等人（1987)Nucleic Acid Res·， 15:9627)。
[0048]可用現(xiàn)有的表達載體構建含有LMM5.1基因表達盒的重組載體。所述植物表達載體 包括雙元農桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、 pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb (CAMBIA公司）等。所述植物表達載體還可包含外源基因的3'端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷 酸信號和任何其它參與mRNA加工或基因表達的DNA片段。所述聚腺苷酸信號可引導聚腺苷 酸加入到mRNA前體的3'端，如農桿菌冠癭瘤誘導(Ti)質?；颍ㄈ珉僦瑝A合成酶基因 Nos)、 植物基因（如大豆貯存蛋白基因）3'端轉錄的非翻譯區(qū)均具有類似功能。使用本發(fā)明的基因 構建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉錄增強子，這些增強子區(qū)域可 以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整 個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可 以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉錄起始區(qū)域或結構基因。為了便于對轉基因植物細 胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行加工，如加入可在植物中表達的編 碼可產生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等）、抗生素的標記基 因（如賦予對卡那霉素和相關抗生素抗性的nptll基因，賦予對除草劑膦絲菌素抗性的bar 基因，賦予對抗生素潮霉素抗性的hph基因，和賦予對氨甲喋呤抗性的dhfr基因，賦予對草 甘磷抗性的EPSPS基因）或是抗化學試劑標記基因等(如抗除莠劑基因）、提供代謝甘露糖能 力的甘露糖-6-磷酸異構酶基因。從轉基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標記基 因，直接以逆境篩選轉化植株。
[0049]上述應用中，所述載體可為質粒、黏粒、噬菌體或病毒載體。所述質粒具體可為 PCAMBIA1300或pTCK303。
[0050] B3)所述重組載體可含有序列3的第1490-6521位或序列1所示的用于編碼LMM5.1 的DNA序列;進一步B3)所述重組載體具體可為pLMM5.1: : LMM5.1。所述pLMM5.1: : LMM5.1為 將PCAMBIA1300的BamH I和Hindm識別位點間的DNA序列替換為序列3所示的DNA序列得到 的表達序列2所示的LMM5.1的重組載體。
[0051] B16)所述重組載體可含有降低LMM5.1表達的核酸分子。在本發(fā)明的一個實施例 中，所述重組載體為pTCK303-RNAi，所述pTCK303-RNAi為在BamHI和ΚρηΙ識別位點間反向插 入序列表中序列1的第515bp至第840bp所示的核苷酸序列，并在內含子之后的Spel和SacI 識別位點間正向插入序列表中序列1第515bp至第840bp所示的核苷酸序列得到的重組載 體。
[0052]上述應用中，所述微生物可為酵母、細菌、藻或真菌。所述細菌具體可為農桿菌，如 農桿菌EHA105。
[0053]上述應用中，所述轉基因植物細胞系、轉基因植物組織和轉基因植物器官均不包 括繁殖材料。
[0054]上述應用中，B15)所述核酸分子具體可為與序列表中序列1的第515-840位核苷酸 所示的DNA片段反向互補的DNA分子。
[0055] 為解決上述技術問題，本發(fā)明還提供了 LMM5.1或所述生物材料的下述任一應用：
[0056] H1、在培育抗病性降低或增加植物中的應用；
[0057] H2、在制備降低或提高植物抗病性產品中的應用；
[0058] H3、在培育超敏反應性降低或增加植物中的應用；
[0059] H4、在制備降低或提尚植物超敏反應性廣品中的應用；
[0060] H5、在制備類病變突變體中的應用。
[0061] 為解決上述技術問題，本發(fā)明還提供了調控植物抗病性或超敏反應性產品，所述 產品含有LMM5.1或所述生物材料。
[0062]上述產品中，所述產品可以以LMM5.1或所述生物材料作為活性成分，還可以將 LMM5.1或所述生物材料與其它抗病性物質進行組合得到的組合物作為活性成分。
[0063] 為解決上述技術問題，本發(fā)明還提供了下述Ml)-M4)中的任一種：
[0064] Ml)培育抗病性轉基因植物的方法，包括降低目的植物中LMM5.1的編碼基因的表 達，得到抗病性高于所述目的植物的轉基因植物；
[0065] M2)培育超敏反應性增強轉基因植物的方法，包括降低目的植物中LMM5.1的編碼 基因的表達，得到超敏反應高于所述目的植物的轉基因植物；
[0066] M3)培育抗病性降低的轉基因植物的方法，包括向受體植物中導入下述1)或2)得 到轉基因植物；
[0067] 1)LMM5.1的編碼基因；
[0068] 2)含有LMM5.1的編碼基因的表達盒；
[0069] 所述轉基因植物與所述受體植物相比抗病性降低；
[0070] M4)培育超敏反應性降低的轉基因植物的方法，包括向受體植物中導入所述1)或 所述2)得到轉基因植物;所述轉基因植物與所述受體植物相比超敏反應性降低。
[0071 ]上述方法中，降低目的植物中LMM5.1的編碼基因的表達是通過將B15)所述核酸分 子導入所述目的植物實現(xiàn)的；
[0072]所述LMM5.1的編碼基因為B1)所述核酸分子;所述表達盒為B2)所述表達盒。
[0073] 在本發(fā)明的實施例中，所述LMM5.1的編碼基因（即序列3的第1490-6521位核苷酸 所示的DNA分子)通過含有LMM5.1基因表達盒的LMM5.1基因重組表達載體導入目的植物中。 所述LMM5.1基因表達盒中，啟動LMM5.1基因轉錄的啟動子為序列3的第1 -1489位所示的DNA 分子，終止LMM5.1基因轉錄的終止子為序列3的第6522-8075位所示的DNA分子。
[0074] 上述方法中，其中所述LMM5.1基因可先進行如下修飾，再導入受體種子植物中，以 達到更好的表達效果：
[0075] 1)根據(jù)實際需要進行修飾和優(yōu)化，以使基因高效表達;例如，可根據(jù)受體植物所偏 愛的密碼子，在保持本發(fā)明所述LMM5.1基因的氨基酸序列的同時改變其密碼子以符合植物 偏愛性;優(yōu)化過程中，最好能使優(yōu)化后的編碼序列中保持一定的GC含量，以最好地實現(xiàn)植物 中導入基因的高水平表達，其中GC含量可為35%、多于45%、多于50%或多于約60% ;
[0076] 2)修飾鄰近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻譯有效起始;例如，利用在植物中已 知的有效的序列進行修飾；
[0077] 3)與各種植物表達的啟動子連接，以利于其在植物中的表達;所述啟動子可包括 組成型、誘導型、時序調節(jié)、發(fā)育調節(jié)、化學調節(jié)、組織優(yōu)選和組織特異性啟動子；啟動子的 選擇將隨著表達時間和空間需要而變化，而且也取決于靶物種；例如組織或器官的特異性 表達啟動子，根據(jù)需要受體在發(fā)育的什么時期而定;盡管證明了來源于雙子葉植物的許多 啟動子在單子葉植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，選擇雙子葉植物啟動子用于 雙子葉植物中的表達，單子葉植物的啟動子用于單子葉植物中的表達；
[0078] 4)與適合的轉錄終止子連接，也可以提高本發(fā)明基因的表達效率；例如來源于 CaMV的tml，來源于rbcS的E9;任何已知在植物中起作用的可得到的終止子都可以與本發(fā)明 基因進行連接；
[0079] 5)引入增強子序列，如內含子序列（例如來源于Adhl和bronzel)和病毒前導序列 (例如來源于TMV，MCMV和AMV)。
[0080] 所述LMM5.1基因表達載體可通過使用T i質粒、Ri質粒、植物病毒載體、直接DNA轉 化、顯微注射、電導、農桿菌介導、基因槍等常規(guī)生物學方法轉化植物細胞或組織，并將轉化 的植物組織培育成植株。
[0081] 所述方法還包括從導入序列3的第1490-6521位或序列1所示的LMM5.1的編碼區(qū)序 列的植株中篩選表達所述編碼基因的植株，得到轉基因植物。
[0082]在本發(fā)明的一個實施例中，與序列表中序列1的第515-840位核苷酸所示的DNA片 段反向互補的DNA分子通過pTCK303載體導入所述目的植物中。
[0083]本發(fā)明中，所述轉基因植物理解為不僅包含將所述LMM5.1基因轉化目的植物得到 的第一代轉基因植物和降低LMM5.1表達的轉基因植物，也包括其子代。對于轉基因植物，可 以在該物種中繁殖該基因，也可用常規(guī)育種技術將該基因轉移進入相同物種的其它品種， 特別包括商業(yè)品種中。所述轉基因植物包括種子、愈傷組織、完整植株和細胞。
[0084] 本發(fā)明中，所述植物可為單子葉植物或雙子葉植物;所述目的植物和所述受體植 物均可為單子葉植物或雙子葉植物。所述單子葉植物為禾本科植物，如水稻。
[0085] 本發(fā)明中，所述抗病性可為抗白葉枯病或稻瘟病。所述白葉枯病可由白葉枯病菌 引起，所述稻瘟病可由稻瘟病菌引起。所述白葉枯病菌可為白葉枯病生理小種PX0145,所述 稻瘟病菌可為稻瘟病生理小種JL062401、JL021605、G9、G11、B8和/或823。
[0086] 實驗證明，本發(fā)明的LMM5.1與植物的抗病性相關。1 )LMM5.1基因的表達抑制后植 物的抗病性增強：用白葉枯病生理小種PX0145侵染LMM5.1基因的表達受到抑制的植物 (Nip. LMM5.u轉基因植株），Nip.LMM5.u轉基因植株的白葉枯病斑長度(0.7±0.6cm)顯著短于 野生型植物(6.5± 1.6cm)。2)11^5.1可以降低植物的抗病性：用白葉枯病生理小種PX0145 侵染轉LMM5.1基因植物，轉LMM5.1基因植物的白葉枯病斑長度(6.8 ± 1.7cm)顯著長于未轉 LMM5.1基因植物（1.3 ±0.8cm)。本發(fā)明的LMM5.1可以調控植物的超敏反應性。LMM5.1基因 的表達抑制后植物的超敏反應性增強:LMM5.1基因的表達受到抑制的植物葉片與葉鞘形成 褐色的斑點，并且臺酚藍染色發(fā)現(xiàn)植株上的斑點部位的細胞已經(jīng)死亡或正在死亡的進行 中；轉空載體植株與日本晴的表型基本無差異，均無褐色斑點。LMM5.1可以降低植物的超敏 反應性:將LMM5.1基因轉至發(fā)生超敏反應的植物中，超敏反應性下降。實驗證明，可以利用 LMM5.1及其基因調控植物的抗病性與超敏反應性。
[0087] 生物材料保藏說明
[0088] 生物材料的分類命名：水稻(Oryza sativa)
[0089] 生物材料的菌株編號：lmm5
[0090] 生物材料的保藏單位名稱：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 [0091 ] 生物材料的保藏單位簡稱:CGMCC
[0092]生物材料的保藏單位地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物 研究所，郵政編碼:100101
[0093]生物材料的保藏日期:2016年05月27日
[0094] 生物材料的保藏中心登記入冊編號:CGMCC No. 11947
【附圖說明】
[0095] 圖1為pTCK300-RNAi的LB與RB間的結構示意圖。
[0096] 圖2為lmm5在RNAi抑制轉基因植株中的表達。
[0097] 圖3為突變體1_5的表型鑒定。其中，A為整株表型，B為葉片表型，C為葉鞘表型。
[0098] 圖4為臺酸藍染色結果。
[0099] 圖5為RNAi抑制轉基因植株Nip. ^*5上的表型。
[0100] 圖6為RNAi抑制轉基因植株的白葉枯病斑長度。
[0101 ]圖7為日本晴和lmm5對稻瘟病的抗性調查。
[0102]圖8為日本晴和lmm5對5個白葉枯病小種的抗性調查。
[0103] 圖9為表達載體pLMM5.1: :LMM5.1的LB與RB間的結構。
[0104] 圖10為表達載體pUbi: :LMM5.4的LB與RB間的結構。
[0105] 圖11為轉基因植株的表型。
[0106] 圖12為轉基因植株的白葉枯病斑長度。
[0107] 其中，Nip.表示日本晴。
【具體實施方式】
[0108] 下面結合【具體實施方式】對本發(fā)明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡 明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。
[0109] 下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0110] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0111] 下述實施例中的pTCK303(Wang，M.，Chen，C.，Xu，Y.Y.，Jiang，R.X.，Han，Y.，Xu， Z.H.,and Chong,K.(2004).A practical vector for efficient knockdown of gene expression in rice(0ryza sativa L.).Plant Molecular Biology Reporter 22,409-417.)公眾可從
【申請人】處獲得該生物材料，該生物材料只為重復本發(fā)明的相關實驗所用，不 可作為其它用途使用。
[0112] 下述實施例中的白葉枯病生理小種PX0145(Chen，H.，Li，C.，Liu，L.，Zhao，J.， Cheng,X.,Jiang,G.,and Zhai,ff.(2016).The Fd-G0GATlmutant gene lc7 confers resistance to Xanthomonas oryzae pv.Oryzae in rice.Scientific reports 6.)公眾 可從
【申請人】處獲得，該生物材料只為重復本發(fā)明的相關實驗所用，不可作為其它用途使用。 [0113]下述實施例中的稻瘟病生理小種B23 (孫雁，王云月，何月秋，李成云，周江鴻，朱有 勇，候選抗病基因在水稻品種多樣性研究中的應用，中國農業(yè)科學，2005,38(11):2227-2232)公眾可從
【申請人】處獲得，該生物材料只為重復本發(fā)明的相關實驗所用，不可作為其它 用途使用。
[0114] 實施例1、抑制LMM5.1基因的表達可以提高水稻的抗病性
[0115] 一、LMM5. lRNAi質粒pTCK303-LMM5. li的構建
[0116] 1、提取水稻品種日本晴的總RNA，反轉錄為cDNA。
[0117] 2、根據(jù)LMM5.1的CDS序列設計引物RNAi-F和RNAi-R，其中在RNAi-F的5'端加入Spe Ι/Κρη I酶切位點，在RNAi-R的5'端加入Sac I/BamH I酶切位點。
[0118] RNAi-F:5 '-actagtggtaccAGAATGAGGATGTGGCCCAG-3 '
[0119] RNAi-R:5 '-gagctcggatccTTCACTGCTTTCATCCATAGCC-3 '
[0120] 3、以步驟1的cDNA為模板，用RNAi-F和RNAi-R組成的引物對進行PCR擴增，得到擴 增產物。
[0121] 4、回收擴增產物，與pEASY-Blunt載體(北京全式金生物技術有限公司)連接，獲得 重組載體 PEASY-LMM5.1 i。
[0122] 5、用限制性內切酶Κρη I和BamH I酶切質粒pEASY-LMM5.1i，回收338bp左右的酶 切產物；用限制性內切酶Κρη I和BamH I酶切RNAi雙元載體pTCK303,回收骨架載體;將上述 兩種回收產物相連，測序，將序列正確的載體命名為中間載體pTCK303-LMM5.1i-re VerSe。
[0123] 6、用限制性內切酶Spe I和Sac I酶切pEASY-LMM5.1i，回收350bp左右的酶切產 物；用限制性內切酶Spe I和Sac I酶切中間載體pTCK303-LMM5. li-reverse;將上述兩種回 收產物相連，測序，將序列正確的載體命名為PTCK303-LMM5.1 i。
[0124] 根據(jù)測序鑒定，對pTCK303_RNAi的結構描述如下:在植物玉米Ubiquitin啟動子后 的BamHI和ΚρηΙ識別位點間反向插入序列表中序列1的第515bp至第840bp所示的核苷酸序 列，其后是一個載體自帶的水稻內含子，在內含子之后的Spel和SacI識別位點間正向插入 序列表中序列1第515bp至第840bp所示的核苷酸序列。重組質粒pTCK300-RNAi的LB與RB間 的結構示意圖見圖1。
[0125] 二、轉基因植物的獲得
[0126] 將pTCK303-RNAi導入農桿菌EHA105中，利用得到的重組農桿菌與農桿菌介導的轉 基因方法(Kumar et al. ,2005)轉化日本晴，獲得了47個To代陽性轉基因植株(Nip.?ΜΜ5·η)。
[0127] 將pTCK303導入農桿菌ΕΗΑ105中，轉化日本晴，得到轉空載體植株。
[0128] 在47個To代陽性轉基因植株(Ν?ρ···η)中隨機選取15株（linel-linel5)，利用引 物對（LMM-F: CTTGACTCTCCAGGCCATAAA 和 LMM-R: GTCCATGCCAGCTTCAAATG)在 RNA 水平上對 LMM5.1基因的表達量進行檢測，結果如2所示，結果顯示，與野生型相比（Nip.)，各 Nip.^*5·11株系中的LMM5.1基因的表達量均顯著下降。
[0129] 三、轉基因植株的表型鑒定和抗病性鑒定
[0130] 突變體lmm5從苗期開始，該突變體葉片上自發(fā)形成褐色的斑點，當完全葉抽出以 后，葉鞘上也會出現(xiàn)類似的斑點，這些斑點呈散發(fā)狀獨立存在，并且一直持續(xù)到植株自然死 亡（圖3)。
[0131] 用臺酸藍(Trypan Blue)染色法檢測lmm5葉片上褐色斑點處的細胞是否死亡。臺 酚藍是一種細胞活性染料，正常的活細胞胞膜結構完整，臺酚藍不能進入胞內，細胞無法被 染色;而細胞死亡或細胞膜出現(xiàn)不可逆損傷時，胞膜的通透性增加，細胞可以被臺酚藍染成 藍色。經(jīng)臺酚藍染色后發(fā)現(xiàn)，日本晴的葉片上無藍色斑點的生成，而突變體lmm5葉片上斑點 處及斑點周圍有深藍色著色點，說明該部位的細胞已經(jīng)死亡或正在死亡的進程中（圖4)。
[0132] 而在47個To代Nip._·η陽性轉基因植株中，43株的葉片與葉鞘均表現(xiàn)出與lmm5相 同的表型（圖5)，葉片與葉鞘形成褐色的斑點，并且臺酚藍染色發(fā)現(xiàn)植株上斑點處及斑點周 圍有深藍色著色點，表明斑點部位的細胞已經(jīng)死亡或正在死亡的進行中；轉空載體植株與 日本晴的表型基本無差異，均無褐色斑點。
[0133] 將上述43株To代Nip.^?5·11陽性轉基因植株進行自交，得到不再發(fā)生性狀分離的 Nip .LMM5'U T2代陽性轉基因植株（即純合轉基因植株），用白葉枯病生理小種PX0145進行侵 染，以日本晴、轉空載體植株和1_5為對照，具體侵染方法如下：
[0134] 將保存于-70°C的白葉枯病生理小種ΡΧ0145接種到PSA培養(yǎng)基（馬鈴薯300g/L，Ca (NOS)〗· 4H20 0.5g/L，Na2HP〇4 · 12H20 2.0g/L，蔗糖 15g/L，瓊脂粉 15g/L)上復蘇，保存至4 °C冰箱內備用。經(jīng)在鑒定水稻品種上檢測其具有標準毒性后，于接種前在PSA培養(yǎng)基上劃 線，28 °C培養(yǎng)72小時。待細菌長的濃密而均勻，用純凈水洗脫細菌，調節(jié)濃度至109cfu/ml進 行接種。接菌（菌侵染）方法采用人工剪葉接種法（Kauffman，H.，Reddy，A.，Hsiek, S. and Merca,S.(1973).An improved technique for evaluating resistance of rice varieties to Xanthomonas oryzae pv.oryzae.Plant Dis.Rep.57,537_541 ·)，每株接種 3-5個葉片，每個葉片減去頂端l-2cm。接種兩周后，當病斑長度明顯且穩(wěn)定時進行調查，每 一植株測量3-5個葉片，最少調查10株，求其平均值并計算正負偏差作為抗性指標。
[0135] 兩周后調查病情。結果顯示，Nip. L·5·11轉基因植株的白葉枯病斑長度（0.7 土 0.6cm)與lmm5(l · 3±0.8cm)無顯著差異，但顯著短于日本晴(6.5± 1.6cm)(圖6)，轉空載體 植株的白葉枯病斑長度與日本晴無顯著差異。
[0136] 以上結果說明，通過對日本晴中LMM5.1的表達進行干擾，轉基因植株無論在表型 上還是在抗病性上，均與lmm5突變體一致，LMM5.1的表達受到干擾后水稻的抗病性增強。
[0137] 上文中，lmm5 ( 1 e s i on mimi c mutan t 5 )是由日本晴（Ory za sat i va 8 8口.」3口〇11；^3)得到的一個性狀穩(wěn)定的類病變突變體，11]11115已于2016年05月27日保藏于中 國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏中心登記入冊編號:CGMCC No. 11947。 利用苗期噴霧法和分蘗期注射法對日本晴和lmm5接種6個稻瘟病生理小種幾062401、 幾021605、69、611、88和823，分別于三天和一周后進行抗性調查。結果顯示，無論在苗期還 是在分蘗期，接過菌的日本晴葉片上都有明顯的稻瘟病病斑，說明這六個小種是日本晴的 親和小種;在接過菌的1_5葉片上，雖然有自發(fā)形成的褐色壞死斑，卻幾乎沒有稻瘟病菌侵 染的痕跡（圖7)。因此，lmm5對所有用于檢測的稻瘟病小種均有較高的抗性。用剪葉法在分 蘗期對日本晴和lmm5接種5個白葉枯病生理小種PX086、PX071、PX099、PX0145和PX0280，接 種兩周后進行病情調查。結果顯示，日本晴對這5個小種均有不同程度的感病，而lmm5卻對 每個小種都表現(xiàn)出高抗（圖8)。以上結果顯示，lmm5對所有用于接種的稻瘟病和白葉枯病小 種抗性均顯著提高。
[0138] 實施例2、LMM5.1和LMM5.4可以降低水稻的抗病性
[0139] -、表達載體pLMM5.1: :LMM5.1 的構建
[0140] 1、提取水稻品種日本晴的DNA。
[0141] 2、以步驟1的DNA為模板，用LMM5. lcoml-F和LMM5. lcoml-R組成的引物對進行PCR 擴增，得到5181bp的擴增產物"片段a"。
[0142] LMM5.lcoml-F:5'-GGTTAATGTTGGCGCCGCTGGTGGTATTCATC-3'
[0143] LMM5.lcoml-R:5'-CCAGGTAACAGATGAATCTTTGAAGTTGCATG-3'
[0144] 回收擴增產物，與pEASY-Blunt載體連接，構建重組質粒pEASY-a。
[0145] 3、以步驟1的DNA為模板，用LMM5.1com2-F和LMM5.1com2-R組成的引物對進行PCR 擴增，得到3196bp的擴增產物"片段b"，其中5'端加入一個Xba I酶切位點。
[0146] LMM5.lcom2-F:5，-tctagaAGACTTTGGTGGTGACCCTGAGATA-3'
[0147] LMM5·1com2-R:5 '-CAAATAACTAAAAGAGTGACGG-3 '
[0148] 回收擴增產物，與pEASY-Blunt載體連接，構建重組質粒pEASY-b。
[0149] 4、以步驟1的DNA為模板，用LMM5.1com3-F和LMM5.1com3-R組成的引物對進行PCR 擴增，得到3342bp的擴增產物"片段c"，其中3'端加入一個Hindm酶切位點。
[0150] LMM5.lcom3-F:5'-AAGCTTCGGCGTTGAACAGCTTATTGTT-3'
[0151] LMM5·1com3-R:5 '-aagcttTGATCCCTCAACACCCCGATGAAAGAACAG-3 '
[0152] 回收擴增產物，與pEASY-Blunt載體連接，構建重組質粒pEASY-c。
[0153] 5、用限制性內切酶Pst I和Hindm酶切步驟4中的重組質粒pEASY-c，回收1742bp 的插入片段；用限制性內切酶Pst I和Hindm酶切雙元表達載體PCAMBIA1300,回收骨架片 段;將上述兩種回收產物相連，得到中間質粒pCAMBIAl 300-c。
[0154] 6、用限制性內切酶Xba I和Pst I酶切步驟3中的重組質粒pEASY-b，回收3057bp的 插入片段;用限制性內切酶Xba I和Pst I酶切步驟5中的中間載體pCAMBIA1300-c，回收酶 切產物;將上述兩種回收產物相連，得到中間質粒pCAMBIA1300-(b+c)。
[0155] 7、用限制性內切酶BamH I和Mfe I酶切步驟2中的重組質粒pEASY-a，回收3905bp 的插入片段;用限制性內切酶BamH I和Mfe I酶切步驟6中的中間質粒pCAMBIA1300-(b+c)， 回收酶切產物;將上述兩種回收產物相連，得到重組質粒pCAMBIA1300-(a+b+c)，即互補表 達載體PLMM5.1: : LMM5.1。
[0156] 根據(jù)測序鑒定，對pLMM5.1: :LMM5.1的結構描述如下:pLMM5.1: :LMM5.1為在雙元 載體pCAMBIA1300的BamH I和HindΙΠ 酶切位點之間插入了序列3所示的DNA分子得到的重組 載體，重組質粒PLMM5.1: : LMM5.1的LB與RB間結構示意圖見圖9。
[0157] 序列3的第1490-6521位為LMM5.1基因的序列，編碼序列2所示的LMM5.1蛋白質， LMM5.1基因的CDS序列如序列1所示。重組質粒pLMM5.1: :LMM5.1中，序列3的第1-1489位啟 動LMM5.1基因的表達，序列3的第6522-8075位終止LMM5.1基因的表達。
[0158] 二、表達載體pUbi: :LMM5.4的構建
[0159 ] 1、提取水稻品種明恢63的總RNA，反轉錄為cDNA。
[0160] 2、以步驟1的cDNA為模板，用LMM5.40E1-F和LMM5.40E1-R組成的引物對進行PCR擴 增，得到1988bp的擴增產物"片段d"，其中通過引物在5'端和3'端分別加入Κρη I和Spe I酶 切位點以及保護堿基。
[0161] LMM5·40E1-F:5 '-CGGggtaccATGCCACGCAAGGTTGTCTC-3 '
[0162] LMM5·40E1-R:5 '-GGactagtTCAGTTCTGATCTTGCCGGAGTAC-3 '
[0163] 3、用限制性內切酶Κρη I和Spe I酶切步驟2中的"片段d"，回收產物。
[0164] 4、用限制性內切酶Κρη I和Spe I酶切pTCK303,回收酶切骨架載體。
[0165] 5、將步驟3和步驟4中的回收產物連接，獲得重組載體，將得到的重組載體命名為 pUbi::LMM5.4〇
[0166] 根據(jù)測序鑒定，對pUbi: :LMM5.4的結構描述如下：pUbi: :LMM5.4為在雙元載體 PTCK303的Ubiquitin啟動子之后的Spe I和Κρη I識別位點間插入序列表中序列4所示的 197lbp LMM5.4基因得到的重組載體。重組質粒pUbi : : LMM5.4的LB與RB間的結構示意圖見 圖10，pUbi: :LMM5.4能表達序列5所示的LMM5.4蛋白質。
[0167] 三、轉基因植物的獲得
[0168] 將pLMM5.1: :LMM5.1導入農桿菌EHA105中，利用得到的重組農桿菌與農桿菌介導 的轉基因方法(Kumar et al.，2005)轉化Imm5(lmm5已于2016年05月27日保藏于中國微生 物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏中心登記入冊編號:CGMCC No. 11947)，獲得 了 41個To代陽性轉基因植株·1)。
[0169] 將植物雙元載體pCAMBIA1300導入農桿菌EHA105中，利用得到的重組農桿菌與農 桿菌介導的轉基因方法(Kumar et al.，2005)轉化1_5,得到轉空載體水稻，作為轉基因水 稻的對照。共獲得40個T0代陽性轉基因植株(lmm513QQ)。
[0170] 將pLMM5.1: :LMM5.1導入農桿菌EHA105中，利用得到的重組農桿菌與農桿菌介導 的轉基因方法（Kumar et al. ,2005)轉化lmm5,獲得了33個To代陽性轉基因植株 (lmm5LMM5'40E)〇
[0171] 將pTCK303導入農桿菌EHA105中，利用得到的重組農桿菌與農桿菌介導的轉基因 方法(Kumar et al.，2005)轉化lmm5,得到轉空載體水稻，作為轉基因水稻的對照。共獲得 40個T0代陽性轉基因植株(其名稱為l_5 13QQUbi)。
[0172] 四、轉基因植株的表型鑒定和抗病性鑒定
[0173] 實驗重復三次：
[0174] 所有41個Ιπιπιδ?5·1和33個lmm5LMM5'4QE To代植株葉片和葉鞘上均無類病斑的發(fā)生 (圖11)，表型與日本晴相同。Ιπιπιδ··1和Ιπιπιδ··41^^!代和T 2代的陽性轉基因植株也無類 病斑的發(fā)生。而40個lmm513QQ和lmm513_ bi與lmm5的表型無明顯不同，均有斑點，并且經(jīng)臺酚 藍染色，發(fā)現(xiàn)斑點處及斑點周圍有深藍色著色點，說明該部位的細胞已經(jīng)死亡或正在死亡 的進程中，lmm5 13QQ和lmm513_bi與Nip ·LMM5·u仍然保持類病變表型（圖11)。說明LMM5 · 1和 LMM5.4均可以功能互補LMM5.1基因的表達受抑制而引起的細胞死亡表型。
[0175] 將上述To代Ιπιπιδ^Μ5·1和Ιπιπιδ^Μ5·4?陽性轉基因植株進行自交，得到不再發(fā)生形狀 分離的1πιπι5?ΜΜ5 · 代陽性轉基因植株(即純合轉基因植株)與1πιπι5?ΜΜ5 · 4C)ET2代陽性轉基因植 株（即純合轉基因植株），用白葉枯病生理小種PX0145侵染進行侵染，以日本晴、Nip.^胃 5·11、 和l_513(K)Ubl為對照，具體侵染方法如下：
[0176] 將保存于_70°C的白葉枯病生理小種PX0145接種到PSA培養(yǎng)基（馬鈴薯300g/L，Ca (NOS)〗· 4H20 0.5g/L，Na2HP〇4 · 12H20 2.0g/L，蔗糖 15g/L，瓊脂粉 15g/L)上復蘇，保存至4 °C冰箱內備用。經(jīng)在鑒定水稻品種上檢測其具有標準毒性后，于接種前在PSA培養(yǎng)基上劃 線，28 °C培養(yǎng)72小時。待細菌長的濃密而均勻，用純凈水洗脫細菌，調節(jié)濃度至109cfu/ml進 行接種。接菌（菌侵染）方法采用人工剪葉接種法（Kauffman，H.，Reddy，A.，Hsiek, S. and Merca,S.(1973).An improved technique for evaluating resistance of rice varieties to Xanthomonas oryzae pv.oryzae.Plant Dis.Rep.57,537-541 ·)，每株接種 3-5個葉片，每個葉片減去頂端l-2cm。接種兩周后，當病斑長度明顯且穩(wěn)定時進行調查，每 一植株測量3-5個葉片，最少調查10株，求其平均值并計算正負偏差作為抗性指標。
[0177] 兩周后調查病情。結果顯示，兩種轉基因植株的白葉枯病斑長度均與日本晴基本 無顯著差異，并且均分別顯著長于lmm5和lmm5 13QQ(圖代陽性轉基因植株、 lmm5LMM5'4QET2代陽性轉基因植株、日本晴、lmm5和lmm5 13QQ的白葉枯病斑長度分別為6 · 8 土 1.7cm、6.6±1.7cm、6.5±l. 6cm、1 · 3±0 · 8cm和1 · 0±0 · 6cm，代陽性轉基因植株 的白葉枯病斑長度分別為日本晴、lmm5和lmm513QQ的1 · 0倍、5 · 2倍和6 · 8倍，lmm5LMM5'4QET2代 陽性轉基因植株的白葉枯病斑長度分別為日本晴、1_5和1_5 13()()的1.0倍、5.1倍和6.5倍。 說明LMM5.1和LMM5.4均能回復由LMM5.1基因的表達受抑制而引起的植株抗病性增強表型， LMM5.1和LMM5.4均可以降低水稻的抗病性。
【主權項】
1. 蛋白質LMM5.1在調控植物抗病性和/或調控植物超敏反應性中的應用;所述蛋白質 1^麗5.1是如下厶1)^2)或八3) : A1)氨基酸序列是序列2的蛋白質； A2)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失 和/或添加且具有相同功能的蛋白質； A3)在A1)或A2)的N端或/和C端連接標簽得到的融合蛋白質。2. 與權利要求1中所述蛋白質LMM5.1相關的生物材料在調控植物抗病性和/或調控植 物超敏反應性中的應用;所述生物材料為下述B1)至B16)中的任一種： B1)編碼權利要求1中所述蛋白質LMM5.1的核酸分子； B2)含有B1)所述核酸分子的表達盒； B3)含有B1)所述核酸分子的重組載體； B4)含有B2)所述表達盒的重組載體； B5)含有B1)所述核酸分子的重組微生物； B6)含有B2)所述表達盒的重組微生物； B7)含有B3)所述重組載體的重組微生物； B8)含有Μ)所述重組載體的重組微生物； Β9)含有Β1)所述核酸分子的轉基因植物細胞系； Β10)含有Β2)所述表達盒的轉基因植物細胞系； Β11)含有Β1)所述核酸分子的轉基因植物組織； Β12)含有Β2)所述表達盒的轉基因植物組織； Β13)含有Β1)所述核酸分子的轉基因植物器官； Β14)含有Β2)所述表達盒的轉基因植物器官； Β15)降低權利要求1中所述蛋白質LMM5.1表達的核酸分子； Β16)含有Β15)所述核酸分子的表達盒、重組載體、重組微生物或轉基因植物細胞系。3. 根據(jù)權利要求2所述應用，其特征在于:Β1)所述核酸分子為如下bl )-b4)中任一種： bl)編碼序列是序列表中序列3的第1490-6521位核苷酸的cDNA分子或DNA分子； b2)核苷酸序列是序列表中序列1的cDNA分子或DNA分子； b3)與bl)或b2)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且編碼權利要求1中所 述蛋白質LMM5.1的cDNA分子或基因組DNA分子； b4)在嚴格條件下與bl)或b2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼權利要求1中所述蛋白質 LMM5.1的cDNA分子或基因組DNA分子； B2)所述表達盒為序列3所示的DNA分子； B15)所述核酸分子為與序列3的第1490-6521位或序列1所不的DNA分子中任一片段反 向互補的DNA分子。4. 權利要求1中所述蛋白質LMM5.1或權利要求2或3中所述生物材料的下述任一應用： H1、在培育抗病性降低或增加植物中的應用； H2、在制備降低或提高植物抗病性產品中的應用； H3、在培育超敏反應性降低或增加植物中的應用； H4、在制備降低或提尚植物超敏反應性廣品中的應用； H5、在制備類病變突變體中的應用。5. 調控植物抗病性或超敏反應性產品，含有權利要求1中所述蛋白質LMM5.1或權利要 求2或3中所述生物材料。6. 下述Ml) -M4)中的任一種： Ml)培育抗病性轉基因植物的方法，包括降低目的植物中權利要求1中所述蛋白質 LMM5.1的編碼基因的表達，得到抗病性高于所述目的植物的轉基因植物； M2)培育超敏反應性增強轉基因植物的方法，包括降低目的植物中權利要求1中所述蛋 白質LMM5.1的編碼基因的表達，得到超敏反應高于所述目的植物的轉基因植物； M3)培育抗病性降低的轉基因植物的方法，包括向受體植物中導入下述1)或2)得到轉 基因植物； 1) 權利要求1中所述蛋白質LMM5.1的編碼基因； 2) 含有權利要求1中所述蛋白質LMM5.1的編碼基因的表達盒； 所述轉基因植物與所述受體植物相比抗病性降低； M4)培育超敏反應性降低的轉基因植物的方法，包括向受體植物中導入所述1)或所述 2)得到轉基因植物;所述轉基因植物與所述受體植物相比超敏反應性降低。7. 根據(jù)權利要求6所述的方法，其特征在于：降低目的植物中權利要求1中所述蛋白質 LMM5.1的編碼基因的表達是通過將權利要求2或3中B15)所述核酸分子導入所述目的植物 實現(xiàn)的； 權利要求1中所述蛋白質LMM5.1的編碼基因為權利要求2或3中B1)所述核酸分子;所述 表達盒為權利要求2或3中B2)所述表達盒。8. 根據(jù)權利要求1-4中任一所述應用、權利要求5所述產品或權利要求6或7所述方法， 其特征在于:權利要求1-5中任一所述植物為單子葉植物或雙子葉植物;權利要求6或7中所 述目的植物和所述受體植物均為單子葉植物或雙子葉植物。9. 根據(jù)權利要求8所述應用、所述產品或所述方法，其特征在于:所述單子葉植物為禾 本科植物。10. 根據(jù)權利要求1-4中任一所述應用，權利要求5所述產品，權利要求6或7所述方法， 或權利要求8或9所述應用、所述產品或所述方法，其特征在于： 所述抗病性為抗白葉枯病或稻痕病； 和/或，所述白葉枯病由白葉枯病菌引起，所述稻瘟病由稻瘟病菌引起。
【文檔編號】C07K14/415GK106084022SQ201610460806
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月22日
【發(fā)明人】江光懷, 趙紀瑩, 翟文學
【申請人】中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所