一種合成卡貝縮宮素的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及醫(yī)藥合成領(lǐng)域，公開了一種合成卡貝縮宮素的方法。本發(fā)明所述方法選擇保護(hù)基tBu替換現(xiàn)有工藝中使用的Alloc以及HOCH2CH2CN來保護(hù)(CH2)3COOH，并采用全新的氨基樹脂、脫保護(hù)劑、酸解劑等完成整個(gè)合成過程，在保證總收率的前提下，提高了卡貝縮宮素的純度，顯著降低了單一雜質(zhì)的含量。
【專利說明】
一種合成卡貝縮宮素的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥合成領(lǐng)域，具體涉及一種合成卡貝縮宮素的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 卡貝縮宮素(Carbetocin)是丹麥輝凌制藥有限公司研發(fā)的一種合成的具有激動(dòng) 劑性質(zhì)的長效催產(chǎn)素8肽類似物，其臨床和藥理特性與天然產(chǎn)生的催產(chǎn)素類似。像催產(chǎn)素一 樣，卡貝縮宮素與子宮平滑肌的催產(chǎn)素受體結(jié)合，引起子宮的節(jié)律性收縮，在原有的收縮基 礎(chǔ)上，增加其頻率和增加子宮張力。在非妊娠狀態(tài)下，子宮的催產(chǎn)素受體含量很低，在妊娠 期間增加，分娩時(shí)達(dá)高峰。因此卡貝縮宮素對(duì)非妊娠的子宮沒有作用，但是對(duì)妊娠的子宮和 剛生產(chǎn)的子宮具有有效的子宮收縮作用。
[0003] 不論是靜脈注射還是肌肉注射卡貝縮宮素后，子宮迅速收縮，可在2分鐘內(nèi)達(dá)到一 個(gè)明確強(qiáng)度。單劑量靜脈注射卡貝縮宮素對(duì)子宮的活性作用可持續(xù)大約1個(gè)小時(shí)，因此足以 預(yù)防剛生產(chǎn)后的產(chǎn)后出血。產(chǎn)后給予卡貝縮宮素后，在收縮的頻率與幅度方面都比催產(chǎn)素 為長。
[0004] 研究表明，當(dāng)硬膜外或腰麻下剖腹產(chǎn)術(shù)后立即單劑量靜脈給予卡貝縮宮素 lOOyg， 在預(yù)防子宮張力不足和減少產(chǎn)后出血方面，卡貝縮宮素明顯優(yōu)于安慰劑。在產(chǎn)后的早期給 予卡貝縮宮素也可以促進(jìn)子宮的恢復(fù)。
[0005] 卡貝縮宮素具有以下的結(jié)構(gòu)：
[0006] [Tyr(Me)1-Ile2-Gln3-Asn 4-Cys((CH2)3C00)]5-Pro6-Leu 7-GIy8-NH2
[0007] 國內(nèi)外已有關(guān)于卡貝縮宮素制備報(bào)道，歐洲專利ES2115543,采用固液結(jié)合合成 法，其原理為:先通過常規(guī)固相多肽合成法，得到4-Cl-Butyl-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys (1'1'1:)-?1'〇-1^11-617-1?;[111<:氨基樹脂，酸解后得到線形4-(]1-131^71-15^(]\16)-116-6111-厶811-Cys-Pr〇-Leu-Gly-NH2，線性肽經(jīng)環(huán)化得到卡貝縮宮素。
[0008] 捷克專利CS8605461，同樣是采用固液結(jié)合合成法，先用固相多肽合成方法合成冗-Ile-Gln-Asn_Cys(Bzl )-Pr〇-Leu-Gly-〇-羥基樹脂，然后裂解得到Z_I le-GIn-Asn-Cys (Bzl)-Pr〇-Leu-GIy-NH2,氫化后再跟 4-溴丁酸反應(yīng)，得到 Ile-Gln-Asn-Cys((CH2)3COOH)-Pr〇-Leu_Gly-NH2再跟X-Tyr(Me)-〇H反應(yīng)，脫保護(hù)，環(huán)化得到卡貝縮宮素。
[0009] 但是，在上述兩個(gè)專利方法中，均以液相進(jìn)行環(huán)化環(huán)合，制備過程繁瑣，環(huán)化收率 低，制備成本高，產(chǎn)生大量廢液，不適合商業(yè)化制備。
[0010]中國專利CN101555272A，采用固相合成法，先通過常規(guī)固相多肽合成法，得到4_ Br-Butyl-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys(Alloc)-P;r〇-Leu-Gly-Rink 氨基樹脂，在四三苯基勝 鈀催化下去 A1 loc 保護(hù)，得到 4-Br-Buty l_Tyr (Me) -I le-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-Rink 氨 基樹脂，在氯化鋰催化下進(jìn)行固相環(huán)化，酸解后得到卡貝縮宮素。但該方法Cys(All〇c)在去 Alloc保護(hù)后SH裸露，易使四三苯基膦鈀催化劑中毒而失效，從而嚴(yán)重影響去保護(hù)反應(yīng)的效 率，同時(shí)在去All保護(hù)過程中引入了大量的重金屬鹽，增加了純化難度。
[0011] 針對(duì)此問題，中國專利CN102260326A，同樣采用固相合成法，先通過常規(guī)固相多肽 合成法，得到15^(]^)-116-6111(1'1'1:)-厶811(1'1'1:)-〇5^((012)3(1)(^11)-?1'〇-1^11-617-1?;[111<:氨 基樹脂，在四三苯基膦鈀催化下去Alloc保護(hù)，得到Tyr(Me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys ((CH2)3COOH)-Pr0-LeU-Gly-Rink氨基樹脂，用常偶聯(lián)試劑進(jìn)行固相環(huán)化，酸解后得到卡貝 縮宮素。該方法雖然克服了四三苯基膦鈀催化劑因中毒而失效的問題，但Fm 0c-CyS((CH2) 3C00A11)制備過程復(fù)雜，生產(chǎn)成本高，其次同樣會(huì)在去All保護(hù)過程中引入了大量的重金屬 鹽，增加了純化難度，導(dǎo)致最大單一雜質(zhì)偏高，為0.2%，純度也僅有99.4%，同時(shí)去Al 1保護(hù) 時(shí)間長以及去All保護(hù)不完全等不利的因素都會(huì)影響產(chǎn)品的質(zhì)量和收率。
[0012] 中國專利CN102796178A公開了一種卡貝宮縮素的固相合成方法，其改變了 CN102260326A中保護(hù)（CH2)3⑶0H羧基的保護(hù)基Alloc為HOCH2CH 2CN，雖然脫保護(hù)劑成本降 低，利于大規(guī)模生產(chǎn)，但是保護(hù)基選擇不當(dāng)造成該專利方法中卡貝縮宮素最終的總收率只 有51%，而單雜也偏高，純度為99.3%。
[0013] 目前卡貝縮宮素的純度最高水平也未超過99.5%，而單一雜質(zhì)的含量最低也僅是 0.2%，工藝水平的原因限制我國卡貝縮宮素產(chǎn)品品質(zhì)難以有一個(gè)較明顯的提升，目前急需 要對(duì)現(xiàn)有工藝進(jìn)彳丁改進(jìn)，以期提尚廣品的整體品質(zhì)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014] 有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種新的合成卡貝縮宮素的方法，使得本發(fā)明 所述方法在保證卡貝縮宮素的總收率前提下顯著降低最大單一雜質(zhì)，提高其純度。
[0015] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
[0016] 步驟1、保護(hù)的Gly在縮合試劑和活化試劑作用下和式1所示氨基樹脂的氨基進(jìn)行 偶聯(lián)反應(yīng)，得到肽樹脂1;
[0017] 步驟2、按照卡貝縮宮素氨基酸序列C端到N端的順序，從肽樹脂1出發(fā)，在縮合試劑 和活化試劑作用下，將保護(hù)的Leu、保護(hù)的Pro、保護(hù)的Cys ((CH2)3C00tBu)、保護(hù)的Asn、保護(hù) 的Gln、保護(hù)的lie和保護(hù)的Tyr進(jìn)行逐一延伸偶聯(lián)，得肽樹脂2;
[0018] 步驟3、去除肽樹脂2中Cy s ((CH2) 3C00tBu)中的保護(hù)基tBu，得肽樹脂3;
[0019] 步驟4、肽樹脂3在縮合試劑和活化試劑作用下，進(jìn)行分子內(nèi)偶聯(lián)反應(yīng)環(huán)化，得卡貝 縮宮素肽樹脂；
[0020] 步驟5、卡貝縮宮素肽樹脂經(jīng)酸解劑酸解后得卡貝縮宮素粗品；
[0021] 步驟6、卡貝縮宮素粗品純化轉(zhuǎn)鹽后得卡貝縮宮素純品；
[0022]
[0023]其中，式1左側(cè)圓球表示聚苯乙烯樹脂。在傳統(tǒng)合成過程中，一般都是采用常規(guī)的 Rink Amide系列樹脂，本發(fā)明在原有的MBHA樹脂上進(jìn)行改進(jìn)，提供出一種全新的載體樹脂 Μ0ΒΗΑ樹脂，即式1所示樹脂，所述式1氨基樹脂可購自西安藍(lán)曉科技新材料股份有限公司。 本發(fā)明經(jīng)過合成本品發(fā)現(xiàn)，該樹脂不僅在成本上低于RinkAmide系列樹脂，而且合成后的產(chǎn) 品總收率可達(dá)到70%以上。MBHA樹脂的結(jié)構(gòu)式如下，左側(cè)的圓球表示聚苯乙烯樹脂：
[0024]
[0025] 卡貝縮宮素主鏈氨基酸有8個(gè)，組成如下：
[0026] [Tyr(Me)1-Ile2-Gln3-Asn 4-Cys((CH2)3C00)]5-Pro6-Leu 7-GIy8-NH2〇
[0027] 其中，卡貝縮宮素 C端的氨基為采用酸解劑從氨基樹脂上裂解下來的氨基，其并不 屬于氨基酸上的氨基。
[0028] 本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有合成工藝中總收率和純度較低、單一雜質(zhì)含量較高的問題，本發(fā) 明選擇保護(hù)基tBu替換現(xiàn)有工藝中使用的A1 loc以及HOCH2CH2CN來保護(hù)(CH2) 3C00H，并采用 適宜的氨基樹脂、脫保護(hù)劑、酸解劑等完成整個(gè)合成過程，在保證總收率的前提下，提高了 卡貝縮宮素的純度，顯著降低了單一雜質(zhì)的含量。
[0029] 本發(fā)明所述保護(hù)基是在氨基酸合成領(lǐng)域需要保護(hù)氨基酸主鏈以及側(cè)鏈上氨基、羧 基等干擾合成的基團(tuán)的保護(hù)基團(tuán)，防止氨基、羧基等在制備目標(biāo)產(chǎn)物過程中發(fā)生反應(yīng)，生成 雜質(zhì)，如本發(fā)明通過Ttr保護(hù)基保護(hù)Asn和Gin的側(cè)鏈酰胺基，通過tBu保護(hù)基保護(hù)Cys((CH2) 3C00H)的側(cè)鏈羧基。此外，在本發(fā)明所述方法涉及的保護(hù)的氨基酸中，N端優(yōu)選通過Fmoc或 Boc保護(hù)基進(jìn)行保護(hù)。被保護(hù)基保護(hù)的氨基酸統(tǒng)稱為保護(hù)的氨基酸。作為優(yōu)選，所述保護(hù)的 Gly、保護(hù)的Leu、保護(hù)的Pro、保護(hù)的Cys ((CH2)3C00tBu)、保護(hù)的Asn、保護(hù)的Gin、保護(hù)的11 e 和保護(hù)的Tyr如下：
[0030] Fomc-Gly或Boc-Gly;Fmoc_Leu或Boc-Leu;Fmoc-Pro或Boc-Pro;Fmoc_Cys((CH2) 3C00tBu);Fmoc-Asn(Trt);Fmoc-Gln(Trt);Fmoc_Ile;Fmoc-Tyr(0Me)〇
[0031] 作為優(yōu)選，所述保護(hù)的Gly和式1氨基樹脂的摩爾比為1-6:1，更優(yōu)選為2.5-3.5:1。 [0032]作為優(yōu)選，所述式1氨基樹脂的取代值為0.2-1.8mm 〇l/g氨基樹脂，更優(yōu)選為0.5_ 1.0mmol/g氨基樹脂。
[0033] 作為優(yōu)選，所述縮合試劑優(yōu)選為N，N-二異丙基碳二亞胺(DIC)、N，N-二環(huán)己基碳二 亞胺(DCC)，六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷/有機(jī)堿(PyBOP/有機(jī)堿）、2-(7_氮 雜-1H-苯并三氮唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯/有機(jī)堿(HATU/有機(jī)堿）、苯并三 氮唑-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸鹽/有機(jī)堿(HBTU/有機(jī)堿）、0-苯并三氮唑-N，N，N'，N'_ 四甲基脲四氟硼酸酯/有機(jī)堿(TBTU/有機(jī)堿）中的一種。所述縮合試劑的摩爾用量優(yōu)選為多 肽樹脂中氨基總摩爾數(shù)的1~6倍，更優(yōu)選為2.5~3.5倍。
[0034] 需要說明的是，所述PyBOP/有機(jī)堿、HATU/有機(jī)堿、HBTU/有機(jī)堿、TBTU/有機(jī)堿，在 本發(fā)明中屬于四種雙體系的縮合試劑，即PyBOP、HATU、HBTU在使用時(shí)需要分別和有機(jī)堿組 合在一起成為一種縮合試劑使用，其中所述有機(jī)堿和?780?、撤1'1]、冊(cè)1'1]381'1]的摩爾比優(yōu)選 為為1.3-3.0:1，更優(yōu)選為1.3-2:1。
[0035]作為優(yōu)選，所述縮合試劑中的有機(jī)堿優(yōu)選為N，N-二異丙基乙胺(DIPEA)、三乙胺 (TEA)或N-甲基嗎啡啉(NMM)，更優(yōu)選為DIPEA。
[0036]作為優(yōu)選，所述活化試劑為1-羥基苯并三唑(HOBt)或N-羥基-7-氮雜苯并三氮唑 (HOAt)。所述活化試劑的用量優(yōu)選為肽樹脂中氨基總摩爾數(shù)的1~6倍，更優(yōu)選為2.5~3.5 倍。
[0037] 作為優(yōu)選，合成過程中所述各反應(yīng)的反應(yīng)溶劑均采用DMF。
[0038] 本發(fā)明所述延伸偶聯(lián)是指在第一個(gè)氨基酸與氨基樹脂偶聯(lián)后，剩余氨基酸按照卡 貝縮宮素氨基酸的C端到N端的順序逐個(gè)和前一個(gè)偶聯(lián)的氨基酸發(fā)生縮合反應(yīng)(主鏈氨基和 羧基的縮合反應(yīng))進(jìn)行偶聯(lián)。本發(fā)明偶聯(lián)時(shí)，每次延伸偶聯(lián)時(shí)所述保護(hù)的氨基酸和對(duì)應(yīng)肽樹 脂的摩爾比優(yōu)選為1-6:1，更優(yōu)選為2.5-3.5:1;所述偶聯(lián)反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選為60~300分鐘，更 優(yōu)選為120~180分鐘。需要說明的是，本發(fā)明所述肽樹脂指任意個(gè)數(shù)氨基酸按照卡貝縮宮 素氨基酸順序和氨基樹脂相連接形成的肽樹脂，這其中也包括肽樹脂1和肽樹脂2。所述對(duì) 應(yīng)的肽樹脂是指保護(hù)的Gly和氨基樹脂偶聯(lián)形成的肽樹脂1、肽樹脂1就是保護(hù)的Leu進(jìn)行偶 聯(lián)的對(duì)應(yīng)肽樹脂，偶聯(lián)了保護(hù)的Leu的肽樹脂是保護(hù)的Pro進(jìn)行延伸偶聯(lián)時(shí)對(duì)應(yīng)的肽樹脂， 以此類推、保護(hù)的Cys ((CH2)3C00tBu)、保護(hù)的Asn、保護(hù)的Gin、保護(hù)的11 e、保護(hù)的Tyr等分別 和其上一個(gè)保護(hù)氨基酸偶聯(lián)后的肽樹脂形成偶聯(lián)時(shí)的對(duì)應(yīng)關(guān)系。
[0039] 在延伸偶聯(lián)中，由于每個(gè)氨基酸N端都有保護(hù)基，因此需要先脫除N端保護(hù)基再偶 聯(lián)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知常識(shí)。本發(fā)明優(yōu)選用PIP/DMF(哌啶/N，N-二甲基甲酰 胺)混合溶液脫除N端Fomc保護(hù)基，混合溶液中含哌啶為10~30% (V)，其余為DMF。去N端保 護(hù)基時(shí)間優(yōu)選為10~60分鐘，優(yōu)選的為15~25分鐘。去N端保護(hù)基試劑的用量優(yōu)選為每 10mL/g肽樹脂;本發(fā)明優(yōu)選用TFA/DCM(三氟醋酸/二氯甲烷)混合溶液脫除N端Boc保護(hù)基， 混合溶液中含三氟醋酸為20~60% (V/V)，優(yōu)選為25~35% (V/V)，去N端保護(hù)基時(shí)間優(yōu)選為 10~50分鐘，優(yōu)選的為25~35分鐘，去N端保護(hù)基試劑的用量優(yōu)選為10mL/克肽樹脂。
[0040] 作為優(yōu)選，所述酸解劑為溴化氫三氟醋酸(TFA)溶液，其中：溴化氫的質(zhì)量百分比 濃度優(yōu)選為5~10 % wt，更優(yōu)選濃度為6~7 % wt;所述酸解劑的用量為5~15mL酸解劑/克肽 樹脂，優(yōu)選酸解劑的用量為7~12mL酸解劑/克肽樹脂;所述酸解的時(shí)間為1~6小時(shí)，優(yōu)選的 為3~4小時(shí)。
[0041] 作為優(yōu)選，所述純化轉(zhuǎn)鹽具體為：
[0042] 卡貝縮宮素粗品，0.1%TFA/水溶液溶解，溶液用0.45μπι微孔濾膜過濾，純化備用；
[0043] 采用高效液相色譜法進(jìn)行純化，純化用色譜填料為ΙΟμπι的反相C18,流動(dòng)相系統(tǒng)為 0.1 %TFA/水溶液-0.1 %TFA/乙腈溶液，77mm*250mm的色譜柱流速為90mL/min，采用梯度系 統(tǒng)洗脫，循環(huán)進(jìn)樣純化，取粗品溶液上樣于色譜柱中，啟動(dòng)流動(dòng)相洗脫，收集主峰蒸去乙腈 后，得卡貝縮宮素純化中間體濃縮液；
[0044] 取卡貝縮宮素純化中間體濃縮液，用0.45μπι濾膜濾過備用；
[0045] 采用高效液相色譜法進(jìn)行換鹽，流動(dòng)相系統(tǒng)為1%醋酸/水溶液-乙腈，純化用色譜 填料為lOwn的反相C18，77mm*250mm的色譜柱流速為90mL/min，采用梯度洗脫，循環(huán)上樣方 法，上樣于色譜柱中，啟動(dòng)流動(dòng)相洗脫，采集圖譜，觀測吸收度的變化，收集換鹽主峰并用分 析液相檢測純度，合并換鹽主峰溶液，減壓濃縮，得到卡貝縮宮素醋酸水溶液，冷凍干燥，得 卡貝縮宮素純品。
[0046]由本發(fā)明所述方法合成的卡貝縮宮素經(jīng)HPLC檢測，純度在99.5%以上，最大單一 雜質(zhì)小于0.1%，總收率高于70%，相比當(dāng)下現(xiàn)有的卡貝縮宮素合成工藝，本發(fā)明工藝能夠 同時(shí)在純度、總收率和最大單一雜質(zhì)三方面達(dá)到較優(yōu)水準(zhǔn)。
[0047]由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明選擇合適的合成方案，以HOCH2CH2CN來保護(hù)（CH 2) 3C00H，配合全新的氨基樹脂、脫保護(hù)劑、酸解劑等，在優(yōu)化了整個(gè)合成工藝的基礎(chǔ)上，顯著 地提高了卡貝縮宮素的純度，具有較高的總收率，并且顯著降低了產(chǎn)品最大單一雜質(zhì)的含 量。
【具體實(shí)施方式】
[0048] 本發(fā)明公開了一種合成卡貝縮宮素的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容， 適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來 說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了 描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述方法進(jìn)行改動(dòng)或適 當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0049] 在本發(fā)明【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明中的保護(hù)氨基酸購自于成都暉蓉生物科技有限 公司，所用樹脂購自于天津南開和成科技有限公司，申請(qǐng)文件中所用英文縮寫對(duì)應(yīng)的中文 含義見表1。
[0050] 表1英文縮寫釋義
[0051]
[0052]下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
[0053] 實(shí)施例1:肽樹脂1的合成
[0054] 取〇.15mol Fmoc-Gly和0.15mol HOBt，用適量DMF溶解；另取0.15mol DIC，攪拌下 慢慢加入至保護(hù)氨基酸DMF溶液中，于室溫環(huán)境中攪拌反應(yīng)30分鐘，得到活化后的保護(hù)氨基 酸溶液，備用。
[0055] 取0 · 05mol的Μ0ΒΗΑ樹脂（取代值約0 · 6mmol/g)，DMF溶脹25分鐘，洗滌過濾，加入活 化后的Fmoc-Gly溶液，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)3小時(shí)，抽掉反應(yīng)液，DMF洗滌3次后，DCM洗滌3次，每次 洗滌時(shí)間為3min，得到Fmoc-Gly-MBHA樹脂，即肽樹脂1，在進(jìn)行下一次偶聯(lián)反應(yīng)前用20 % PIP/DMF溶液去Fmoc保護(hù)25分鐘，洗滌過濾得到Gly-MOBHA樹脂。
[0056] 實(shí)施例2:肽樹脂1的合成
[0057] 取〇.15mol Boc-Gly和0.15mol HOBt，用適量DMF溶解；另取0.15mol DIC，攪拌下 慢慢加入至保護(hù)氨基酸DMF溶液中，于室溫環(huán)境中攪拌反應(yīng)30分鐘，得到活化后的保護(hù)氨基 酸溶液，備用。
[0058] 取0 · 05mol的Μ0ΒΗΑ樹脂（取代值約0 · 6mmol/g)，DMF溶脹25分鐘，洗滌過濾，加入活 化后的Fmoc-Gly溶液，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)3小時(shí)，抽掉反應(yīng)液，DMF洗滌3次后，DCM洗滌3次，每次 洗滌時(shí)間為3min，得到Boc-Gly-MOBHA樹脂，即肽樹脂1，在進(jìn)行下一次偶聯(lián)反應(yīng)前用30% TFA/DCM溶液去Boc保護(hù)30分鐘，經(jīng)DIEA/DCM溶液中和，用DMF、DCM洗滌過濾，得到Gly-MOBHA 樹脂。
[0059] 實(shí)施例3:肽樹脂2的合成
[0060] 取0.15mol Fmoc-Leu和0.15mol HOBt，用適量DMF溶解；另取0.15mol DIC，攪拌下 慢慢加入至保護(hù)氨基酸DMF溶液中，于室溫環(huán)境中攪拌反應(yīng)30分鐘，得到活化后的保護(hù)氨基 酸溶液。
[0061 ]將上述活化后的保護(hù)氨基酸溶液加入到實(shí)施例1制得的Gly-MOBHA樹脂，室溫?cái)嚢?反應(yīng)3小時(shí)，抽掉反應(yīng)液，DMF洗滌3次后，DCM洗滌3次，每次洗滌時(shí)間為3min，再用20%PIP/ DMF溶液去Fmoc保護(hù)25分鐘，洗滌過濾，完成Leu的接入。
[0062] 同法接入Fmoc-Pro，F(xiàn)moc_Cys( (CH2)3COOtBu)、Fmoc-Asn(Trt)、Fmoc-Gln(Trt)、 Fmoc-Ile和Fmoc-Tyr (OMe)，F(xiàn)moc脫除采用20 %PIP/DMF溶液，洗滌過濾得到得肽樹脂2，Tyr (OMe) -11 e-G In (Tr t) -Asn (Tr t) -Cy s ((CH2) 3C00tBu) -Pro-Leu-Gl y-M0BHA 樹脂。
[0063] 實(shí)施例4:肽樹脂2的合成
[0064] 取〇.15mol Boc-Leu和0.15mol HOBt，用適量DMF溶解；另取0.15mol DIC，攪拌下 慢慢加入至保護(hù)氨基酸DMF溶液中，于室溫環(huán)境中攪拌反應(yīng)30分鐘，得到活化后的保護(hù)氨基 酸溶液。
[0065] 將上述活化后的保護(hù)氨基酸溶液加入到實(shí)施例2制得的肽樹脂1，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)3 小時(shí)，抽掉反應(yīng)液，DMF洗滌3次后，DCM洗滌3次，每次洗滌時(shí)間為3min，再用30 % TFA/DCM溶 液去保護(hù)30分鐘，經(jīng)DIEA/DCM溶液中和，用DMF、DCM洗滌過濾，完成Leu的接入。
[0066] 同法接入Boc-Pro，F(xiàn)moc_Cys ((CH2)3COOtBu)、Fmoc-Asn(Trt)、Fmoc-Gln(Trt)、 Fmoc-Ile 和?111〇^71((1^)^111〇(3脫除采用20%?1?/01^溶液，8〇(3脫除采用30%了?4/^?11溶 液，洗滌過濾得到得肽樹脂2，15^(016)-116-6111(1'1'1:)-八811(1'1'1:)-〇5^((〇12)3(1)(允1311)-?1'〇-Leu-Gly-MOBHA 樹脂）。
[0067] 實(shí)施例5:肽樹脂3的合成
[0068] 取0.05mol實(shí)施例3得肽樹脂2,用30%TFA/DCM溶液去保護(hù)30分鐘，經(jīng)DIEA/DCM溶 液中和，用DMF、DCM 洗滌過濾，得肽樹脂 3(Tyr(0Me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys((CH2) 3C00H)-Pr〇-Leu-Gly-M0BHA樹脂）〇
[0069] 實(shí)施例6:肽樹脂3的合成
[0070] 取0.05mol實(shí)施例4得肽樹脂2，用30 %TFA/DCM溶液去保護(hù)30分鐘，經(jīng)DIEA/DCM溶 液中和，用DMF、DCM 洗滌過濾，得肽樹脂 3(Tyr(0Me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys((CH2) 3C00H)-Pr〇-Leu-Gly-M0BHA樹脂）〇 [0071]實(shí)施例7:卡貝縮宮素肽樹脂的合成
[0072] 取0.2mol HOBt，用適量DMF溶解；另取0.2mol DIC，加入至DMF溶液中，所得溶液加 入到實(shí)施例5制得的肽樹脂3，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)6小時(shí)，抽掉反應(yīng)液，DMF洗滌3次后，DCM洗滌3 次，每次洗滌時(shí)間為3min，得卡貝縮宮素肽樹脂：（[Tyr(OMe)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys ((CH2) 3C00) ] -Pro-Leu-Gly-M0BHA樹脂）〇 [0073]實(shí)施例8:卡貝縮宮素肽樹脂的合成
[0074] 取0.2mol HOBt，用適量DMF溶解；另取0.2mol DIC，加入至DMF溶液中，所得溶液加 入到實(shí)施例6制得的肽樹脂3，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)6小時(shí)，抽掉反應(yīng)液，DMF洗滌3次后，DCM洗滌3 次，每次洗滌時(shí)間為3min，得卡貝縮宮素肽樹脂：（[Tyr(OMe)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys ((CH2)3COO)] -Pro-Leu-Gly-M0BHA樹脂）〇
[0075]實(shí)施例9:卡貝縮宮素粗品的制備
[0076]取實(shí)施例7制得的卡貝縮宮素肽樹脂，加入8%的HBr/TFA溶液(酸解液10mL/克卡 貝縮宮素肽樹脂），攪拌反應(yīng)6小時(shí)，過濾收集濾液，樹脂再用少量TFA洗滌3次，合并濾液后 減壓濃縮，加入無水乙醚沉淀，再用無水乙醚洗沉淀3次，抽干、得類白色粉末即為卡貝縮宮 素粗品，粗品純度為82.7%。
[0077] 實(shí)施例10:卡貝縮宮素粗品的制備
[0078] 取實(shí)施例8制得的卡貝縮宮素肽樹脂，加入8%的HBr/TFA溶液(酸解液10mL/克卡 貝縮宮素肽樹脂），攪拌反應(yīng)6小時(shí)，過濾收集濾液，樹脂再用少量TFA洗滌3次，合并濾液后 減壓濃縮，加入無水乙醚沉淀，再用無水乙醚洗沉淀3次，抽干、得類白色粉末即為卡貝縮宮 素粗品，粗品純度為85.1%。
[0079] 實(shí)施例11:卡貝縮宮素粗品純化轉(zhuǎn)鹽
[0080] 取實(shí)施例9所得卡貝縮宮素粗品，用20%醋酸溶液溶解，溶液用0.45μπι微孔濾膜過 濾，純化備用；
[0081] 采用高效液相色譜法進(jìn)行純化，純化用色譜填料為ΙΟμπι的反相C18,流動(dòng)相系統(tǒng)為 0.1 %TFA/水溶液-0.1 %TFA/乙腈溶液，77mm*250mm的色譜柱流速為90mL/min，采用梯度系 統(tǒng)洗脫，循環(huán)進(jìn)樣純化，取粗品溶液上樣于色譜柱中，啟動(dòng)流動(dòng)相洗脫，收集主峰蒸去乙腈 后，得卡貝縮宮素純化中間體濃縮液；
[0082]取卡貝縮宮素純化中間體濃縮液，用0.45μπι濾膜濾過備用；
[0083]采用高效液相色譜法進(jìn)行換鹽，流動(dòng)相系統(tǒng)為1%醋酸/水溶液-乙腈，純化用色譜 填料為lOwn的反相C18，77mm*250mm的色譜柱流速為90mL/min，采用梯度洗脫，循環(huán)上樣方 法，上樣于色譜柱中，啟動(dòng)流動(dòng)相洗脫，采集圖譜，觀測吸收度的變化，收集換鹽主峰并用分 析液相檢測純度，合并換鹽主峰溶液，減壓濃縮，得到卡貝縮宮素醋酸水溶液，冷凍干燥，得 卡貝縮宮素純品34.8g
[0084] 總收率為70.4%，分子量:989.2，純度:99.6%，最大單一雜質(zhì)0.07%。
[0085]實(shí)施例12:卡貝縮宮素粗品純化轉(zhuǎn)鹽
[0086]取實(shí)施例10所得卡貝縮宮素粗品，用純化流動(dòng)相A溶解，溶液用0.45μπι微孔濾膜過 濾，純化備用；
[0087]采用高效液相色譜法進(jìn)行純化，純化用色譜填料為ΙΟμπι的反相C18,流動(dòng)相系統(tǒng)為 0.1 %TFA/水溶液-0.1 %TFA/乙腈溶液，77mm*250mm的色譜柱流速為90mL/min，采用梯度系 統(tǒng)洗脫，循環(huán)進(jìn)樣純化，取粗品溶液上樣于色譜柱中，啟動(dòng)流動(dòng)相洗脫，收集主峰蒸去乙腈 后，得卡貝縮宮素純化中間體濃縮液；
[0088]取卡貝縮宮素純化中間體濃縮液，用0.45μπι濾膜濾過備用；
[0089]采用高效液相色譜法進(jìn)行換鹽，流動(dòng)相系統(tǒng)為1%醋酸/水溶液-乙腈，純化用色譜 填料為lOwn的反相C18，77mm*250mm的色譜柱流速為90mL/min，采用梯度洗脫，循環(huán)上樣方 法，上樣于色譜柱中，啟動(dòng)流動(dòng)相洗脫，采集圖譜，觀測吸收度的變化，收集換鹽主峰并用分 析液相檢測純度，合并換鹽主峰溶液，減壓濃縮，得到卡貝縮宮素醋酸水溶液，冷凍干燥，得 卡貝縮宮素純品35. lg。
[0090] 總收率為71.1 %，分子量:989.0，純度:99.7 %，最大單一雜質(zhì)0.05%。
[0091]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng) 視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種合成卡貝縮宮素的方法，其特征在于，包括W下步驟： 步驟1、保護(hù)的Gly在縮合試劑和活化試劑作用下和式1所示氨基樹脂的氨基進(jìn)行偶聯(lián) 反應(yīng)，得到膚樹脂1; 步驟2、按照卡貝縮宮素氨基酸序列C端到N端的順序，從膚樹脂1出發(fā)，在縮合試劑和活 化試劑作用下，將保護(hù)的Leu、保護(hù)的Pro、保護(hù)的切s((C此）3C(X)tBu)、保護(hù)的Asn、保護(hù)的 Gin、保護(hù)的lie和保護(hù)的Tyr進(jìn)行逐一延伸偶聯(lián)，得膚樹脂2; 步驟3、去除膚樹脂2中切s((CH2)3COOtBu)中的保護(hù)基巧U，得膚樹脂3; 步驟4、膚樹脂3在縮合試劑和活化試劑作用下，進(jìn)行分子內(nèi)偶聯(lián)反應(yīng)環(huán)化，得卡貝縮宮 素膚樹脂； 步驟5、卡貝縮宮素膚樹脂經(jīng)酸解劑酸解后得卡貝縮宮素粗品； 步驟6、卡貝縮宮素粗品純化轉(zhuǎn)鹽后得卡貝縮宮素純品；其中，式1左側(cè)圓球表示聚苯乙締樹脂。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述保護(hù)的Gly、保護(hù)的Leu、保護(hù)的Pro、保護(hù) 的Cys((C出)3CO〇tBu)、保護(hù)的Asn、保護(hù)的Gin、保護(hù)的lie和保護(hù)的Tyr如下： Fomc-Gly或Boc-Gly;Fmoc-Leu或Boc-Leu;Fmoc-Pro或Boc-Pro;Fmoc-Cys((邸2) sCOOtBu) ;Fmoc-Asn(T;rt) ;Fmoc-Gln(T;rt) ;Fmoc-Ile ;Fmoc-Ty;r(OMe)。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述縮合試劑為N，N-二異丙基碳二亞胺、N, N-二環(huán)己基碳二亞胺，六氣憐酸苯并Ξ挫-1-基-氧基Ξ化咯烷基憐/有機(jī)堿、2-(7-氮雜- 1H-苯并Ξ氮挫-1-基)-1，1，3,3-四甲基脈六氣憐酸醋/有機(jī)堿、苯并Ξ氮挫-N，N，N'，N'-四 甲基脈六氣憐酸鹽/有機(jī)堿、0-苯并Ξ氮挫-Ν,Ν,Ν'，Ν'-四甲基脈四氣棚酸醋/有機(jī)堿中的 一種。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述方法，其特征在于，所述有機(jī)堿為N，N-二異丙基乙胺、Ξ乙胺或 N-甲基嗎啡嘟。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述活化試劑為1-徑基苯并Ξ挫或N-徑基- 7-氮雜苯并Ξ氮挫。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，步驟3為： 用TFA/DCM混合溶液去除膚樹脂2中切S ((C出)3〇X)tBu)中的保護(hù)基巧U，得膚樹脂3。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述方法，其特征在于，所述TFA/DCM混合溶液中TFA體積百分比為20 ~60%，余量為DCM。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述酸解劑為漠化氨的Ξ氣醋酸溶液。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述方法，其特征在于，所述酸解劑中漠化氨質(zhì)量百分比濃度為5- 10%。
【文檔編號(hào)】C07K1/08GK106084015SQ201610728294
【公開日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年8月25日
【發(fā)明人】黃璜, 郭德文, 曾德志, 文永均
【申請(qǐng)人】成都圣諾生物制藥有限公司