一種具有抗腫瘤活性和抗炎活性的醌式查爾酮碳苷二聚體化合物及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種具有抗腫瘤活性和抗炎活性的醌式查爾酮碳苷二聚體化合物及其制備方法。本發(fā)明通過對紅花化學(xué)成分進(jìn)行系統(tǒng)深入研究，經(jīng)過波譜和質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析表明從紅花中分離得到一個(gè)新化合物(式Ⅱ)，為首次分離得到的醌環(huán)為1,5?環(huán)己二烯酮的醌式查爾酮碳苷二聚體化合物。經(jīng)過抗炎和抗腫瘤活性研究表明，本發(fā)明提供的醌式查爾酮碳苷二聚體化合物具有很好的抗炎活性，并且能抑制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I，對多種腫瘤均具有很強(qiáng)的抗腫瘤活性，且經(jīng)過毒性實(shí)驗(yàn)研究表明，本發(fā)明提供的具有抗腫瘤活性和抗炎活性的醌式查爾酮與黃酮醇結(jié)合物毒性較低，可開發(fā)成新的抗腫瘤藥物或抗炎藥物，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
【專利說明】
-種具有抗腫瘤活性和抗炎活性的釀式查爾酬碳昔二聚體化 合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及具有抗腫瘤活性的化合物，具體設(shè)及從中藥紅花中提取的得到的具有 抗腫瘤活性和抗炎活性的釀式查爾酬碳巧二聚體化合物新化合物及其在預(yù)防和治療腫瘤 疾病和炎癥疾病中的用途，屬醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 紅花為菊科植物紅花&dhamus tinctorius L.的干燥花，始載于《開寶本草》，主 產(chǎn)于新疆、河南、浙江、云南等地，味辛性苦，歸屯、、肝經(jīng)，具有活血通經(jīng)、散疲止痛的功效，作 為傳統(tǒng)活血化疲中藥治療中風(fēng)、冠屯、病和屯、絞痛已有2500多年的歷史。紅花水提物制成的 紅花注射液收載于衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑二十冊中，臨床上廣泛用于屯、血管疾病的 治療。目前已從紅花中分離得到200多種化合物，包括釀式查爾酬巧類、黃酬類、生物堿類、 有機(jī)酸類和醬體類等，而釀式查爾酬巧類是紅花水提物的主要成分，如徑基紅花黃色素 A 化SYA)、紅花黃色素 A、saff lomin C和脫水紅花黃色素 B(AHSYB)?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，紅花 及其活性成分具有抗凝血、抗氧化、抗炎、保肝、降壓等活性。
[0003] 本發(fā)明繼續(xù)對紅花化學(xué)成分系統(tǒng)深入研究，對水部位中的釀式查爾酬巧類化合物 進(jìn)行系統(tǒng)分離，研究開發(fā)其新的活性結(jié)構(gòu)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 發(fā)明目的：本發(fā)明的目的是在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)之上，對紅花化學(xué)成分系統(tǒng)深入研 究，對水部位中的釀式查爾酬巧類化合物進(jìn)行系統(tǒng)分離，研究開發(fā)出新的活性結(jié)構(gòu)，并通過 藥理實(shí)驗(yàn)篩選其在防治腫瘤疾病、炎癥疾病和抗血栓疾病中的新用途。
[0005] 技術(shù)方案:為了實(shí)現(xiàn)W上目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：
[0006] 具有抗腫瘤活性和抗炎活性的釀式查爾酬碳巧二聚體化合物，其結(jié)構(gòu)式如式Π 所 示：
[0007]
[000引具有抗腫瘤活性和抗炎活性的釀式查爾酬碳巧二聚體化合物的制備方法，包括W 下步驟：
[0009] (1)取紅花，加乙醇提取得到乙醇提取液，合并提取液，濃縮，得乙醇浸膏；
[0010] (2)取步驟（1)制得的乙醇浸膏，依次用石油酸、乙酸乙醋和水進(jìn)行萃取，萃取后濃 縮，分別得到石油酸、乙酸乙醋和水的萃取物；
[0011] (3)取步驟(2)得到的水的萃取物，上大孔吸附樹脂柱，先用水洗脫，然后分別用體 積濃度為5~95%的乙醇洗脫，收集體積濃度為30%的乙醇洗脫液，濃縮，得大孔吸附樹脂 洗脫物；
[0012] (4)取步驟（3)得到的大孔吸附樹脂洗脫物上LH-20凝膠柱層析，洗脫液為出0- MeOH(體積比為從100:0到0:100)，得到30個(gè)流分；
[0013] (5)取步驟(4)LH-20凝膠柱洗脫物，上pre-HPLC色譜進(jìn)行分離，得到式Π 所示的釀 式查爾酬碳巧二聚體化合物。
[0014] 作為優(yōu)選方案，W上具有抗腫瘤活性和抗炎活性的釀式查爾酬碳巧二聚體化合物 的制備方法，步驟(1)的提取方法為滲漉法，超聲提取法，浸泡法或回流法。
[0015] 作為優(yōu)選方案，W上所述的具有抗腫瘤活性和抗炎活性的釀式查爾酬碳巧二聚體 化合物的制備方法，步驟(5)pre-HPLC色譜分離的分離條件:X化idge? C180抓?柱（150X 30mm，5皿），流動(dòng)相為0.1%甲酸水^)和甲醇(8)，采用梯度洗脫程序:0-5111111，16%-19%8; 5-15min，19%B;15-20min，19%-44%B;20-30min，44%B;30-32min，44%-100%B。流速為 15mL/min;柱溫為室溫(25 °C)。
[0016] 本發(fā)明所述的具有抗腫瘤活性和抗炎活性的釀式查爾酬碳巧二聚體化合物在制 備抗炎藥物中的應(yīng)用。
[0017] 作為另一優(yōu)選方案，本發(fā)明所述的具有抗腫瘤活性和抗炎活性的釀式查爾酬碳巧 二聚體化合物在制備抗血栓性疾病中的應(yīng)用。
[001引作為另一優(yōu)選方案，本發(fā)明所述的具有抗腫瘤活性和抗炎活性的釀式查爾酬碳巧 二聚體化合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。所述的腫瘤為肺癌、胃癌、結(jié)腸癌、宮頸癌、乳腺 癌、肝癌或腎癌。
[0019] 本發(fā)明所述的具有抗腫瘤活性和抗炎活性的釀式查爾酬碳巧二聚體化合物，將釀 式查爾酬碳巧二聚體化合物化合物和藥學(xué)上可接受的載體制備成片劑、膠囊劑、注射劑、粉 針劑、顆粒劑、微囊、丸劑、軟膏劑或透皮控釋貼劑劑型的藥物。
[0020] 將本發(fā)明提供的釀式查爾酬碳巧二聚體化合物制成片劑時(shí)，把釀式查爾酬碳巧二 聚體化合物和乳糖或玉米淀粉，需要時(shí)加入潤滑劑硬脂酸儀，混合均勻，整粒，然后壓片制 成片劑。
[0021] 本發(fā)明提供的釀式查爾酬碳巧二聚體化合物制成膠囊劑時(shí)把釀式查爾酬碳巧二 聚體化合物和載體乳糖或玉米淀粉混合均勻，整粒，然后裝膠囊制成膠囊劑。
[0022] 本發(fā)明提供的釀式查爾酬碳巧二聚體化合物制成顆粒劑時(shí)，把釀式查爾酬碳巧二 聚體化合物和稀釋劑乳糖或玉米淀粉、混合均勻，整粒，干燥，制成顆粒劑。
[0023] 本發(fā)明提供的釀式查爾酬碳巧二聚體化合物制成粉針劑、注射液時(shí)加入載體按藥 學(xué)常規(guī)方法制備得到。
[0024] 本發(fā)明提供的釀式查爾酬碳巧二聚體化合物制成脂肪乳劑、軟膏劑或透皮控釋貼 劑等劑型時(shí)加入載體按藥學(xué)常規(guī)方法制備得到。
[0025] 有益效果:本發(fā)明提供的具有抗腫瘤活性和抗炎活性的釀式查爾酬碳巧二聚體化 合物和現(xiàn)有技術(shù)相比具有w下優(yōu)點(diǎn)：
[0026] 本發(fā)明通過對紅花化學(xué)成分進(jìn)行系統(tǒng)深入研究，經(jīng)過波譜和質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析表明從 紅花中分離得到查爾酬類化合物，式Π 所示的化合物為首次分離得到的釀環(huán)為1,5-環(huán)己二 締酬的釀式查爾酬碳巧二聚體，都為新骨架結(jié)構(gòu)化合物。且經(jīng)過抗炎和抗腫瘤活性研究表 明，本發(fā)明提供的釀式查爾酬碳巧二聚體化合物具有很好的抗炎活性，并且能抑制DNA拓?fù)?異構(gòu)酶I，對多種腫瘤均具有很強(qiáng)的抗腫瘤活性，且經(jīng)過毒性實(shí)驗(yàn)研究表明，本發(fā)明提供的 具有抗腫瘤活性和抗炎活性的釀式查爾酬碳巧二聚體化合物毒性較低，可開發(fā)成新的抗腫 瘤藥物或抗炎藥物，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
[0027] 本發(fā)明提供的制備方法，工藝設(shè)計(jì)合理，可操作性強(qiáng)，制備得到的釀式查爾酬碳巧 二聚體化合物純度高。
【附圖說明】
[00%]圖1為釀式查爾酬碳巧二聚體化合物式Π 的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0029] 圖2為釀式查爾酬碳巧二聚體化合物式Π 的iH-NMR圖；
[0030] 圖3為釀式查爾酬碳巧二聚體化合物式Π 的1化NMR圖。
【具體實(shí)施方式】
[0031] 根據(jù)下述實(shí)施例，可W更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí) 施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結(jié)果僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限 制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。
[0032] 實(shí)施例1釀式查爾酬碳巧二聚體化合物的制備
[0033] 具有抗腫瘤活性和抗炎活性的釀式查爾酬碳巧二聚體化合物的制備方法，包括W 下步驟：
[0034] (1)取紅花15kg，依次加入體積濃度為95%和70%的乙醇滲漉提取至無色，得到乙 醇提取液，合并提取液，濃縮，得乙醇浸膏1950g;
[0035] (2)取步驟（1)制得的乙醇浸膏，分散在水中，依次用石油酸和乙酸乙醋進(jìn)行萃取， 萃取后濃縮，分別得到石油酸、乙酸乙醋和水的萃取物；
[0036] (3)取步驟(2)得到的水的萃取物，上D101大孔吸附樹脂柱，先用水洗脫，然后分別 用體積濃度為5~95 %的乙醇洗脫，收集體積濃度為30 %的乙醇洗脫液，濃縮，得大孔吸附 樹脂洗脫物；
[0037] (4)取步驟（3)得到的大孔吸附樹脂洗脫物上LH-20凝膠柱層析，洗脫液為出0- MeOH(體積比為從100:0到0:100)，得到30個(gè)流分；
[0038] (5)取步驟(4化H-20凝膠柱洗脫流分第9流分和第3流分，上pre-冊LC色譜進(jìn)行分 離，pre-冊LC色譜分離的分離條件：X化idge? C180BD?柱（150 X 30mm，5μπι)，流動(dòng)相為 0.1%甲酸水^)和甲醇(8)，采用梯度洗脫程序:0-5111111，16%-19%8;5-15111111，19%8;15- 20111111，19%-44%6;20-30111111，44%6;30-32111111，44%-100%8。流速為1511117111111;柱溫為室 溫(25。〇。
[0039] 得到式Π 所示的釀式查爾酬碳巧二聚體化合物，結(jié)構(gòu)式如圖1。
[0040] 式Π 所示：
[0041]
[0042] 式11結(jié)構(gòu)解析為:暗橘色粉末，[0]。2*^: + 134.7(〇0.1，16(^)。高分辨質(zhì)譜化1?斗51- MS :m/z = 1043.2679[M-H]-i，calcd . 1043.2674)表明其分子式為C4姐51〇26。紅外光譜在 3433cnfi處的強(qiáng)吸收顯示它有徑基存在，在1640cm-i處也出現(xiàn)幾基的特征吸收，同時(shí)在1513 和HOOcnfi處也出現(xiàn)芳環(huán)的特征吸收。紫外光譜顯示228、344和420nm有最大吸收，說明分子 中存在高度共輛體系。
[0043] iH-NMR(圖2)顯示兩套對徑基桂皮酷基信號(hào)分別為S7.51(lH，d，J=16.0Hz)、7.19 αH，d，J=16.0Hz)、7.39(2H，d，J = 8.甜z)、6.76(2H，d，J = 8.甜z)、9.70αH，brs)，W及δ 7.45(lH，d J=16.0Hz)、7.16(lH，d J=16.0Hz)、7.37(2H，d J = 8.甜z)、6.76(2H，dJ = 8.5化）。此外，在4-^版中還有兩個(gè)碳巧葡萄糖端基氨信號(hào)53.78(化(1，1 = 9.0化)和3.57 αH，d，J = 9.甜z)，一個(gè)脫氧山梨醇端基氨信號(hào)δ4.56αH，d，J = 8.0Hz)，W及一些糖基氨信 號(hào) δ2·9-4·6ρρπι。
[0044] "C-NMR(圖3)顯示有48個(gè)碳原子，結(jié)合iH-醒R、HSQC和精確分子量，可判定該化合 物為AHSYB的同分異構(gòu)體。同樣，在MS/MS譜圖上，該化合物裂解產(chǎn)生111八1025.25[1-護(hù) 出0]-、923.22 [M-H-C 姐 80]-、593.15 [M-H-C21出2011 ]-和449.11 [M-H-C27 出0015 ]-，與AHSYB 裂解 的特征碎片一致。
[0045] 在HMBC光譜上，H-2""和C-1相關(guān)表明0H-2""和C-1酪徑基形成醋鍵。酪徑基氨信號(hào) δ18.31 與C-1' (181.5)、C-2' (106.0)和C-6' (101.4)HMBC相關(guān)表明該化合物W1-締醇-3,7- 二酬形式存在。該化合物的兩個(gè)釀環(huán)均W1，5-環(huán)己二締酬形式存在。
[0046] 化合物在272皿處呈現(xiàn)負(fù)的cotton效應(yīng)，表明4和少的絕對構(gòu)型均為S。根據(jù)生源合 成途徑，脫水山梨醇由D-葡萄糖衍生而來，結(jié)合其端基質(zhì)子的禪合常數(shù)為8.0Hz，脫水山梨 醇確定為1-脫水D-山梨醇，1""的絕對構(gòu)型為S。
[0047] 實(shí)施例2抑制LI^誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞炎癥反應(yīng)的活性篩選
[004引血疲證的本質(zhì)是微循環(huán)障礙或血液流變性異常。隨著細(xì)胞、分子生物學(xué)研究的深 入，炎癥反應(yīng)與血疲證關(guān)系密切，一系列的炎癥細(xì)胞和炎癥因子參與血疲證的疾病過程。故 本實(shí)驗(yàn)采用LPS誘導(dǎo)冊VEC建立體外細(xì)胞炎癥反應(yīng)模型評(píng)價(jià)釀式查爾酬巧類化合物的抗炎 活性。
[0049] 1、實(shí)驗(yàn)材料
[0化0] 1.1儀器
[0化1] 沈RIES IIWATERJAVKET型C〇2解育箱（美國Thermo公司）；1300沈RIES A2型生物安 全柜(美國Thermo公司）；BWS-10型水浴鍋（昆山一恒儀器有限公司）；T0MY SX-500高壓蒸汽 滅菌鍋（日本Queensland公司）；EP抓超純水系統(tǒng)（南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司）； CKX31SF型倒置顯微鏡（OLYMPUS公司）；Allegra X-12R通用臺(tái)式離屯、機(jī)（美國肥CKMAN公 司）；6孔培養(yǎng)板(美國Costar公司）;WGk230B型電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公 司）；qPCR儀（美國Applied Biosystem公司）；超微量核酸蛋白檢測儀（日本Queensland公 司）。
[0化2] 1.2細(xì)胞及試劑
[0053] HUVEC細(xì)胞購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；高糖DEME培養(yǎng)基和胎牛血清 (FBS)購自美國Gibco公司；脂多糖化PS)購自于美國Sigma-Al化ich公司；TRIzol試劑購自 美國Invitrogen公司；PrimeScript? RT reagent kit購自中國大連TaKaRa公司。
[0化4] 2、實(shí)驗(yàn)方法
[00對 2.1細(xì)胞培養(yǎng)
[0化6] 冊VEC細(xì)胞培養(yǎng)于含10%的胎牛血清、lOOmg · mL-i青霉素 、lOOmg · mL-i鏈霉素的 DMEM培養(yǎng)基中，置于37 °C、5 %二氧化碳培養(yǎng)箱中。2~3d更換培養(yǎng)液，3~4d傳代一次。
[0化7] 2.2細(xì)胞處理及分組
[005引將冊VEC細(xì)胞按1 X 105個(gè)· mL-i接種于六孔板，每孔滿體積2血。實(shí)驗(yàn)分為3組誼白 組，不加入WS和藥物;模型組，加入LPS，終濃度lOyg · ml/i，不加藥物;給藥組:依次加入W 上式Π 化合物，使式式Π -1化合物濃度為0.8皿01 · 1/1、式Π -2化合物濃度為4皿01 · L一 1、 式Π -3化合物濃度為20μπιο1 · 1/?、Π -4化合物濃度為100皿01 · 1/1藥物。連續(xù)給藥2天后收 集細(xì)胞，用于提取總RNA。
[0化9] 2.3RNA 提取
[0060] 于6孔板每個(gè)孔各加入50化L RNAzol，準(zhǔn)備1.5mL子彈頭，標(biāo)記好記號(hào)，用刮刀將細(xì) 胞HUVEC仔細(xì)的刮下并且轉(zhuǎn)移到1.5mL的EP管中；加入500μΙ DEPC出0，混懸15s ;離屯、 (13200巧111，10111111，4°(：);取上清1000化到新的6?管中，離屯、（13200巧111，30111111，4°(：);觀察 RNA形態(tài)，傾倒出上層液體，每個(gè)EP管中加入50化L 70 %乙醇，離屯、（13200rpm，1 Omin，4°C); 重復(fù)1次，倒置，驚干后，各加入20化55°CDEPC出0，-80°C保存；Nano drop測定RNA含量 (A260/280 的范圍在 1.8-2.0)。
[0061] 2.4轉(zhuǎn)。0臟
[0062] TaKaRa試劑盒：P;rimeSc;ript?RT reagent Kit with 曲NA liraser
[0063] 1)基因組DM去除反應(yīng)
[0064]
[00化]2)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
[0066]
-
[0067] Store at 4°C ；
[006引 3)船110化09測定。0臟含量^260/280的范圍在1.6-1.8)。
[0069] 2.6. 1.2.5qRT-PCR SYBR Green試劑盒（QIAGEN)
[0070] l)qPCR反應(yīng)體系配制
[0074] 取對數(shù)生長期冊VEC，加入一定濃度藥物作用，利用RNAzol-步法提取總RNA，lyg 的總RNAWlO化體系進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，制備cDNA并反轉(zhuǎn)錄PCR。使用引物如下：
[0075]
[0076] 3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0077] 表1式Π 釀式查爾酬巧化合物抑制LI^誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞炎癥因子表達(dá)結(jié)果
[007引
[0079] 與空白組相比，咕<0.05，##P<0.01，與模型組相比，沖<0.05，*沖<0.01.
[0080] 由W上表1實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，式Π 釀式查爾酬碳巧二聚體化合物顯著上調(diào)抗炎因子 比-10的基因表達(dá)作用，式Π 釀式查爾酬碳巧二聚體化合物可劑量依耐性地抑制比-1、比-6 和IFN- 丫的基因表達(dá)，式Π 釀式查爾酬碳巧二聚體化合物僅在高劑量濃度下對TNF-a的基 因表達(dá)具有顯著抑制作用，進(jìn)一步表明，釀式查爾酬碳巧二聚體化合物具有特異性的抗炎 活性，有開發(fā)成為新一代抗炎藥的潛力。
[0081 ]實(shí)施例3抑制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I的活性篩選
[0082] DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶（Topoisomerase)是一種重要的核酶，參與DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、重組、 基因調(diào)節(jié)及細(xì)胞有絲分裂等重要生命活動(dòng)，可通過催化DNA鏈的斷裂和結(jié)合控制其拓?fù)浣Y(jié) 構(gòu)。腫瘤細(xì)胞中，Τορο I含量及活性遠(yuǎn)高于正常體細(xì)胞，抑制Τορο I-DNA可裂解復(fù)合物解 離，就能選擇性抑制腫瘤細(xì)胞的快速增殖，進(jìn)而殺死腫瘤細(xì)胞W ηΤορο I由此成為公認(rèn)的抗 癌藥作用祀點(diǎn)。故本實(shí)驗(yàn)采用體外抑制DNA Τορο I的模型評(píng)價(jià)釀式查爾酬碳巧二聚體化合 物的抗腫瘤活性。
[0083] 1、實(shí)驗(yàn)材料
[0084] 1.1 儀器
[0085] 凝膠成像儀(上海培清科技有限公司），電泳儀(北京市六一儀器廠），金屬浴(杭州 博日科技有限公司）。
[00化]1.2藥物及試劑
[0087] DNA Τορο I、pBR322DNA、Aga;rose Regular's X Loading Buffer、T;ris-Borate- EDTA Buffer(TBE)powder均購自寶生物(大連)有限公司；10-?基喜樹堿(OPT)和十二烷基 硫酸鋼購自上海阿拉下生化科技公司；Super green I購自北京泛博生物化學(xué)有限公司。實(shí) 施例1制備得到的式Π 釀式查爾酬碳巧二聚體化合物。
[0088] 2、實(shí)驗(yàn)方法
[0089] 該測試采用20化反應(yīng)體系，包括lOXTopo I緩沖液（350mM Tris-HCl pH 8.0， 720mM KCI，50mM MgCl2,50mM DTT，50mM spermidine)、0.1%BSA、0.5yg小牛胸腺P BR322DNA、lU Τορο I、待測化合物的DMSO溶液，陽性藥為10-?基喜樹堿(OPT)。置于37 °C金 屬浴中反應(yīng)30min，加入扣L反應(yīng)終止液1.5%十二烷基硫酸鋼(SDS)終止反應(yīng)。1化產(chǎn)物與化 L 6 X loading buffer混合上樣，1 %瓊脂糖凝膠、T肥緩沖液、90V電壓，電泳60min〇Sybr green I染色30min，凝膠成像儀觀察結(jié)果，拍照記錄。酶活力單位定義：能在37°C 30min松 馳0.化g負(fù)超螺旋地R322DNA所需的Τορο I酶量，為1個(gè)單位化）。
[0090] 3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0091] 式Π 化合物在lOOliM時(shí)對Τορο I有明顯抑制作用，結(jié)果表明釀式查爾酬碳巧二聚 體具有較好的抗腫瘤活性。
[0092] 實(shí)施例4體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)
[0093] 本發(fā)明使用改良ΜΤΤ法對本發(fā)明實(shí)施例1制備得到的式Π 釀式查爾酬碳巧二聚體 化合物進(jìn)行體外抗腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn):將肺癌、胃癌、結(jié)腸癌、宮頸癌、乳腺癌、肝癌或腎癌用膜 酶進(jìn)行消化、計(jì)數(shù)、制成濃度為5 X104個(gè)/ml的細(xì)胞懸液。將96孔板中每孔加入100μΙ細(xì)胞懸 液(每孔5 X 103個(gè)細(xì)胞），然后置于37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)；用非完全培養(yǎng)基稀釋 式Π 釀式查爾酬巧化合物至所需的不同梯度濃度，每孔加入1(Κ)化相應(yīng)的含藥培養(yǎng)基，同時(shí) 設(shè)立陰性對照組，溶媒對照組和陽性對照組，再將96孔板置于37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 小時(shí)。然后每孔加入20化MTT(5mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)基，每孔加入 15化L DMS0溶解，搖床10分鐘輕輕混勻。在A = 4570nm、620nm兩波長下用酶標(biāo)儀檢測每孔的 吸光度即0D值，W各復(fù)孔的平均值作為該組細(xì)胞的0D值，計(jì)算各藥物的抑制率。
[0094]實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示本發(fā)明實(shí)施例1制備得到的式Π 釀式查爾酬碳巧二聚體化合物，對 肺癌、胃癌、結(jié)腸癌、宮頸癌、乳腺癌、肝癌或腎癌均具有較強(qiáng)的抑制作用，在l〇μg/ml劑量 下，對肺癌、胃癌、結(jié)腸癌、宮頸癌、乳腺癌、肝癌或腎癌抑制率均大于50%。
[00M] W上實(shí)施方式只為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點(diǎn)，其目的在于讓熟悉此項(xiàng)技術(shù)的 人了解本
【發(fā)明內(nèi)容】
并加 W實(shí)施，并不能W此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍，凡根據(jù)本發(fā)明精神實(shí) 質(zhì)所做的等效變化或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 具有抗腫瘤活性和抗炎活性的釀式查爾酬碳巧二聚體化合物，其特征在于，其結(jié)構(gòu) 式如式Π 所示：2. 具有抗腫瘤活性和抗炎活性的釀式查爾酬碳巧二聚體化合物的制備方法，其特征在 于，包括W下步驟： (1) 取紅花，加乙醇滲漉提取得到乙醇提取液，合并提取液，濃縮，得乙醇浸膏； (2) 取步驟（1)制得的乙醇浸膏，分散在水中，依次用石油酸和乙酸乙醋進(jìn)行萃取，萃取 后濃縮，分別得到石油酸、乙酸乙醋和水的萃取物； (3) 取步驟(2)得到的水的萃取物，上大孔吸附樹脂柱，先用水洗脫，然后分別用體積濃 度為5~95%的乙醇洗脫，收集體積濃度為30%的乙醇洗脫液，濃縮，得大孔吸附樹脂洗脫 物； (4) 取步驟(3)得到的大孔吸附樹脂洗脫物上LH-20凝膠柱層析，洗脫液為出O-MeOH，體 積比為從100:0到0:100，得到30個(gè)流分； (5) 取步驟(4化H-20凝膠柱洗脫流分，上pre-HPLC色譜進(jìn)行分離，得到式Π 所示的釀式 查爾酬碳巧二聚體化合物。3. 具有抗腫瘤活性和抗炎活性的釀式查爾酬碳巧二聚體化合物的制備方法，其特征在 于，步驟(1)的提取方法為滲漉法，超聲提取法，浸泡法或回流法。4. 具有抗腫瘤活性和抗炎活性的釀式查爾酬碳巧二聚體化合物的制備方法，其特征在 于，步驟（5)pre-HPLC色譜分離的分離條件:X化idge? C18 0抓了《柱，規(guī)格為150 X 30mm，5μ m，流動(dòng)相A相為0.1%甲酸水和B相為甲醇，采用梯度洗脫程序：0-5min，16%-19%B;5- l5min，19%B;15-20min，19%-44%B;20-30min，44%B;30-32min，44%-100%B。流速為 15mL/min;柱溫為 25°C。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有抗腫瘤活性和抗炎活性的釀式查爾酬碳巧二聚體化合 物，其特征在于，將釀式查爾酬碳巧二聚體化合物化合物和藥學(xué)上可接受的載體制備成片 劑、膠囊劑、注射劑、粉針劑、顆粒劑、微囊、丸劑、軟膏劑或透皮控釋貼劑劑型的藥物。6. 權(quán)利要求1所述的具有抗腫瘤活性和抗炎活性的釀式查爾酬碳巧二聚體化合物在制 備抗炎藥物中的應(yīng)用。7. 權(quán)利要求1所述的具有抗腫瘤活性和抗炎活性的釀式查爾酬碳巧二聚體化合物在制 備抗血栓性疾病中的應(yīng)用。8. 權(quán)利要求1所述的具有抗腫瘤活性和抗炎活性的釀式查爾酬碳巧二聚體化合物在制 備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的具有抗腫瘤活性和抗炎活性的釀式查爾酬碳巧二聚體化合物 在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的腫瘤為肺癌、胃癌、結(jié)腸癌、宮頸癌、乳腺 癌、肝癌或腎癌。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK106083788SQ201610475483
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月24日
【發(fā)明人】唐于平, 樂世俊, 段金廒, 瞿城, 金益
【申請人】南京中醫(yī)藥大學(xué)