基于pcr?rlfp?dhplc技術(shù)掃描分析食品中動物源性成份組成的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種分析肉制品的動物物種來源的方法。更具體地，本發(fā)明提供一種基于PCR?RLFP?DHPLC技術(shù)全景掃描分析食品中動物源性成份組成的方法。本發(fā)明還提供了一種用于分析肉制品的動物物種來源的試劑盒。
【專利說明】
基于PCR-RLFP-DHPLC技術(shù)掃描分析食品中動物源性成份組成
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于食品檢測領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明設(shè)及一種分析肉制品的動物物種來 源的方法。特別地，本發(fā)明提供一種基于PCR-RLFP-DHPLC技術(shù)掃描分析食品中動物源性成 份組成的方法。本發(fā)明還提供了一種用于分析肉制品的動物物種成份的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 國內(nèi)外市場上肉制品滲假現(xiàn)象頻發(fā)，運(yùn)種假冒偽劣產(chǎn)品雖不至于損害人民群眾的 身體健康，但卻足W侵害消費者利益，擾亂市場的公平競爭環(huán)境，極端情況下還會引發(fā)民族 矛盾。因此，有必要研發(fā)肉制品中動物源性成分鑒定技術(shù)，對市場上"肉制品滲假"風(fēng)險進(jìn)行 防控。
[0003] 目前國內(nèi)外用于動物源性成分鑒定的主流技術(shù)為巧光實時定量PCR(real-time PCR)技術(shù)，雖然該技術(shù)具有檢測靈敏度高、特異性好和耗時短等優(yōu)勢，但是利用該技術(shù)對動 物源性成份進(jìn)行鑒定時，檢測結(jié)果只能顯示樣品中是否含有某種動物源性成份，而無法對 樣本中的動物源性成份組成進(jìn)行全景分析。正是由于運(yùn)種技術(shù)缺陷，常常會使"肉制品滲 假'的風(fēng)險疏于防控，從而引發(fā)一系列的社會問題。例如：2013年英國的"馬肉風(fēng)波"事件在 世界范圍內(nèi)造成了極大的負(fù)面效應(yīng)，不久，歐盟繼馬肉風(fēng)波之后，又爆出魚肉制品造假程度 更甚的消息。因此，研發(fā)一種可W對肉制品中的動物源性成份進(jìn)行全景掃描分析的技術(shù)方 法對于"肉制品滲假"的風(fēng)險防控至關(guān)重要。
[0004] PCR-RFLP技術(shù)是一類被廣泛用于物種鑒定的技術(shù)方法，該技術(shù)方法包括用通用引 物擴(kuò)增一段預(yù)選的DNA片段，根據(jù)DNA片段的序列選擇合適的限制性內(nèi)切酶，酶切DNA片段并 產(chǎn)生特異性的酶切圖譜，根據(jù)酶切圖譜實現(xiàn)對物種的鑒定。通過構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)物種酶切圖譜庫 W及與測序技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用，PCR-RFLP可W很好的彌補(bǔ)real-time PCR技術(shù)的不足，實現(xiàn)對 肉制品中的動物源性成份組成全景掃描目前，基于PCR-RFLP開發(fā)的魚類物種鑒定技術(shù) 已經(jīng)相當(dāng)成熟，已經(jīng)有商品化的試劑盒出售。該試劑盒由Agilent Technologies公司研發(fā)， 可W用于鑒定50種W上的魚類物種W?；赑CR-RFLP技術(shù)對非魚類物種成份的鑒定雖常有 報道，但未形成商品化檢測試劑盒。2005年Aida AA等人選用內(nèi)切酶BsaJ I對長度為350bp 的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，實現(xiàn)了對清真食品中豬肉成份的鑒定W。2009年Abde^Rahman SM.等 人選用限制性內(nèi)切酶Alu I對驢肉和馬肉進(jìn)行了有效區(qū)分W。同年，chandrika M等人利用 PCR-RFLP技術(shù)實現(xiàn)了對豬、牛、水牛、鶴譜、雞、山羊和兔子的鑒定。在該技術(shù)方法中，擴(kuò)增的 PCR產(chǎn)物片段長度為359bp，選用的內(nèi)切酶包括Alu I，BsaJ I，Rsa I，Mse I和BstU 1[6]。 2012年，化dia化ider等人W線粒體DNA為模板，利用條形碼通用引物擴(kuò)增長度為71化p的 C0I序列，選擇限制性內(nèi)切酶化a II切割C0I片段，實現(xiàn)了對牛、雞、火雞、綿羊、豬、水牛、駱 駝和驢的有效區(qū)分W。同年M.Eaqub等人選用限制性內(nèi)切酶Alu I實現(xiàn)了對豬肉成份的鑒 定W。2014年，Abbas D等人利用PCR-RFLP技術(shù)實現(xiàn)了對腸類食品中牛肉、羊肉、豬肉、雞肉、 驢肉和馬肉的鑒定[9]。雖然近年來相關(guān)研究報道不斷，但是運(yùn)些方法主要存在W下幾點技 術(shù)局限性：1)所鑒別的物種種類范圍狹窄；2)限制性內(nèi)切酶片段多樣性的分析手段自動化 程度不高，樣品之間易形成交叉污染;3)-些研究選擇的內(nèi)切酶種類過多，需進(jìn)行多次酶切 反應(yīng)才能實現(xiàn)對動物源性成份的鑒別，操作繁瑣。因此，有必要繼續(xù)深入研究基于PCR-RFLP 的物種鑒定技術(shù)，W實現(xiàn)對肉制品中禽類和哺乳動物類的物種成份進(jìn)行全景掃描分析。
[000引DHPLC(變性高效液相色譜）是近年來發(fā)展起來的一項核酸分析技術(shù)。應(yīng)用 lYansgenomic公司的DNA S邱Cartridge分離柱可W有效分離長度不同的DNA片段，并且該 技術(shù)分辨率高，分析過程自動化，可W有效的防止樣品間的交叉污染。本研究擬設(shè)計一對可 W從樣品中擴(kuò)增出所有禽類和哺乳動物類物種成份C0I片段的通用引物序列;通過對C0I片 段的核酸序列分析，篩選出可W有效區(qū)分各物種成份的限制性內(nèi)切酶;利用篩選獲得的內(nèi) 切酶對擴(kuò)增獲得的C0I片段進(jìn)行酶切;利用DHPLC技術(shù)繪制酶切圖譜，構(gòu)建陽性樣本庫，W實 現(xiàn)對肉制品中禽類和哺乳動物類的物種成份進(jìn)行全景掃描分析。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的一個目的是提供一種分析肉制品的動物物種來源的方法，所述方法包括 W下步驟：
[0007] 1)提取肉制品樣品的基因組DNA;
[000引 2)w所述基因組DNA為模板，使用通用C0I引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物；
[0009] 3)將所述PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切;和
[0010] 4)利用DHPLC對酶切產(chǎn)物進(jìn)行分析，
[0011] 其中步驟2)中所述的通用C0巧I物對的序列為(方向5'-3'):
[0012] C01-F(正向引物）：CGNATAAAYAAYATRAGCTTYTGA
[0013] C01-R(反向引物）：TANACTTCDGGRTGNCCRAARAATCA
[0014] 其中；
[0015] R表示 A或 G;
[0016] Y表示 C或 T;
[0017] 慷示G或A或T;
[001引 N表示A或T或G或C。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中步驟3)中進(jìn)行酶切使用的內(nèi)切酶為 Hindlll和/或Hpall。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案，其中所述動物物種選自哺乳動物和禽類，優(yōu) 選選自反當(dāng)動物、犬科動物、兔科、貓科和家禽，和優(yōu)選選自綿羊、山羊、馬、驢、兔子、貓、鼠、 牛、豬、狐貍、狗、駱、鹿、駱駝、鶴譜、大雁、錯子、雞、鴨、火雞和山雞。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案，其中在步驟3)中將獲得的DHPLC的洗脫峰與 同樣條件下確定的已知動物物種的DHPLC的洗脫峰進(jìn)行比對，如果兩者的洗脫峰重合，則指 示所述肉制品樣品中存在來源于所述已知動物物種的成份。
[0022] 根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案，所述方法可用于分析所述肉制品樣品中動物 源性成份組成。
[0023] 在另一方面，本發(fā)明還提供一種用于分析肉制品的動物物種來源的試劑盒，其包 括針對哺乳動物和禽類的通用C0I引物對，其中所述通用C0I引物對的序列為(方向5'-3'):
[0024] C0I-F(正向引物）：CGNATAAAYAAYATRAGCTTYTGA
[0025] CO I -R (反向引物）：TANACTTCDGGRTGNCCRAARAATCA
[0026] 其中；
[0027] R表示 A或 G;
[002引 Y表示C或T;
[0029] D表示G或A或T;
[0030] N表示A或T或G或C。
[0031] 根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，所述試劑盒還包含限制性內(nèi)切酶化nd III和/ 或限制性內(nèi)切酶化a III。
[0032] 根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案，所述試劑盒還包含標(biāo)準(zhǔn)DNA模板和/或PCR反 應(yīng)液，優(yōu)選其中所述標(biāo)準(zhǔn)DNA模板是含有已知動物物種的C0I序列的質(zhì)粒或者基因組。
[0033] 在一個優(yōu)選實施方案中，所述標(biāo)準(zhǔn)DNA模板是含有已知動物物種的C0I序列（如 cDNA序列或其互補(bǔ)序列）的質(zhì)?；蛘呋蚪M。所述PCR反應(yīng)液包括進(jìn)行PCR反應(yīng)所需的各種 組分，如MgCl2、緩沖液、dNTP、Taq酶等，它們都是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。
[0034] 根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案，所述試劑盒還包含陽性樣本酶切圖譜庫，所 述陽性樣本酶切圖譜庫是指根據(jù)已知動物物種的C0I序列的質(zhì)?；蛘呋蚪M作為模板，使 用權(quán)利要求6中所述的通用C0I引物進(jìn)行擴(kuò)增，所獲得的PCR產(chǎn)物使用限制性內(nèi)切酶Hind III和/或限制性內(nèi)切酶化a III進(jìn)行酶切后的DHPLC洗脫峰圖譜。
[0035] 本發(fā)明還提供根據(jù)本發(fā)明所述的試劑盒在分析肉制品的動物物種來源中的應(yīng)用。
[0036] 通過使用本發(fā)明的方法和試劑盒，能夠?qū)κ称分械膭游镌葱猿煞葸M(jìn)行全景掃描， 從而提升了監(jiān)管部口的監(jiān)控能力，可W主動發(fā)現(xiàn)并防控風(fēng)險。
[0037] 發(fā)明詳述
[0038] 本發(fā)明的一個方面是提供一種分析肉制品中動物源性成份的方法，所述方法包括 W下步驟：
[0039] 1)陽性樣本菌種庫的構(gòu)建；
[0040] 2)設(shè)計針對哺乳動物類和禽類C0I片段的通用引物；
[0041] 3)內(nèi)切酶的篩選；
[0042] 4)陽性樣本酶切圖譜庫的構(gòu)建；
[0043] 5)肉制品樣本中動物源性(哺乳動物類和禽類)成份的分析。
[0044] 根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，所述動物物種選自禽類和哺乳動物類，優(yōu)選選 自反當(dāng)動物、犬科動物、兔科、貓科和家禽，和優(yōu)選選自綿羊、山羊、馬、驢、兔子、貓、鼠、牛、 豬、狐貍、狗、駱、鹿、駱駝、鶴譜、大雁、錯子、雞、鴨和火雞。從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲取上述物種 C0I片段的核酸序列，利用體外基因組合成技術(shù)合成運(yùn)些物種的C0I片段，并將合成的片段 分別克隆至PTC57載體中。將連接成功的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入D冊a感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽性克隆菌，擴(kuò) 增培養(yǎng)，用終濃度40 %的甘油保菌，-80°C凍存儲藏，制備陽性樣本菌種庫。
[0045] 根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案，在上述方法的步驟2)中針對禽類和哺乳動物 類物種的C0I片段設(shè)計一對通用引物，使用運(yùn)對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可W擴(kuò)增出禽類和哺乳 動物類中不同物種的C0I片段。將上述方法步驟1)中陽性樣本菌種庫中儲藏的菌種活化，擴(kuò) 增，并提取含有物種C0I序列的質(zhì)粒作為模板，使用設(shè)計獲得的通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到 PCR產(chǎn)物，并對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序分析。
[0046] 根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案，在上述方法的步驟3)中通過肥Bcutter V2.0 分析上述方法步驟2)中獲得的PCR產(chǎn)物的酶切位點，通過比對，初步確定可W對物種進(jìn)行區(qū) 分的限制性內(nèi)切酶;通過酶切實驗，篩選出可W對物種進(jìn)行區(qū)分的限制性內(nèi)切酶。
[0047] 根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案，在上述方法步驟4)中利用上述方法步驟3)中 篩選獲得的限制性內(nèi)切酶對上述方法步驟2)中的PCR片段進(jìn)行酶切;利用DHPLC對酶切產(chǎn)物 進(jìn)行分析，繪制酶切片段的洗脫峰圖譜，從而獲得陽性樣本酶切圖譜庫。
[0048] 根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案，在上述方法步驟5)中從市場購買肉制品作為 分析樣本，提取樣本的基因組作為擴(kuò)增模板;使用上述方法步驟2)中的通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò) 增;獲得的產(chǎn)物使用上述方法步驟3)中篩選的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切處理;獲得的酶切產(chǎn) 物用DHPLC進(jìn)行分析，繪制酶切產(chǎn)物的洗脫峰圖譜;將樣品的酶切圖譜與陽性樣本酶切圖譜 庫進(jìn)行比對，如果兩者的洗脫峰重合，則指示所述肉制品樣品中存在來源于所述已知動物 物種的成份;如果兩者的洗脫峰不重合，則指示所述肉制品樣本中存在未知的動物物種成 份;將存在未知動物物種成份的樣本PCR產(chǎn)物克隆至T-載體，挑取陽性克隆進(jìn)行測序分析， 直至尋找到未知的動物物種成份；W含有未知動物物種成份的T-載體作為模板，按照上述 方法4)處理，擴(kuò)增陽性樣本酶切圖譜庫。
[0049] 根據(jù)本發(fā)明的一個特別優(yōu)選的實施方案，所述動物物種特異性的C0I引物選自W 下序列(方向5'^3'）：
[00 加]C01-F:CGNATAAAYAAYATRAGCTTYTGA [0化 1 ] C0I-R:TANACTTCDGGRTGNCCRAARAATCA [0化2 ] R：A/G；Y:C/T；D:G/A/T；N:A/T/G/C
[0053] 在另一方面，本發(fā)明還提供一種用于分析肉制品的動物物種來源(哺乳動物類和 禽類)的試劑盒，其包括：
[0054] 1)-種動物物種(哺乳動物和禽類特異性)的通用C0I引物對；
[0055] 2)陽性樣本酶切圖譜庫；
[0化6] 3)PCR反應(yīng)液；和
[0057] 4)內(nèi)切酶反應(yīng)液。
[0058] 在一個優(yōu)選實施方案中，所述標(biāo)準(zhǔn)物種酶切圖譜庫是由上述方法步驟4)制備獲得 的。所述PCR反應(yīng)液包括進(jìn)行PCR反應(yīng)所需的各種組分，如MgCl2、緩沖液、dNTP、Taq酶等，它 們都是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。所述的酶切反應(yīng)液包含上述方法步驟3)中篩選獲得的內(nèi)切 酶W及與之相匹配的反應(yīng)緩沖液。
[0059] 根據(jù)本發(fā)明的一個特別優(yōu)選的實施方案，所述試劑盒中的所述動物物種(哺乳動 物和禽類特異性)的通用C0I引物對選自W下序列(方向5'^3'）：
[0060] C0I-F:CGNATAAAYAAYATRAGCTTYTGA [0061 ] C0I-R:TANACTTCDGGRTGNCCRAARAATCA
[0062] R：A/G；Y:C/T；D:G/A/T；N:A/T/G/C
[0063] 通過使用本發(fā)明的方法和試劑盒，可W:l)本技術(shù)方法可W快速、準(zhǔn)確的鑒定肉制 品中哺乳動物和鳥類的動物源性成份，多個肉制品中動物源性成份分析結(jié)果表明，本方法 的鑒定準(zhǔn)確率為100% ;2)本方法采用一對引物和兩種限制性內(nèi)切酶即可實現(xiàn)對現(xiàn)有常見 肉制品中哺乳動物成份和禽類成份的檢測。
【附圖說明】
[0064] 圖1.陽性樣本酶切圖譜庫，即W陽性樣本菌種庫中的陽性質(zhì)粒為模板，用通用引 物擴(kuò)增后酶切，用DHPLC分析獲得的陽性樣本酶切圖譜(色譜截圖）；
[0065] 圖2.設(shè)計獲得的通用引物對對哺乳動物和禽類的C0I序列擴(kuò)增圖；
[0066] 圖3.樣品1的分析結(jié)果(色譜截圖）。（1)樣品1的酶切圖譜；（2)陽性樣本圖譜庫中 兔子的酶切圖譜；（3)陽性樣本圖譜庫中兔子的酶切圖譜與樣本1的酶切圖譜重疊圖。
[0067] 圖4.樣品2的分析結(jié)果(色譜截圖）。（1)樣品2的酶切圖譜；（2)陽性樣本圖譜庫中 鴨子的酶切圖譜；（3)陽性樣本圖譜庫中鴨子的酶切圖譜與樣本2的酶切圖譜重疊圖。
[0068] 圖5.樣品3的分析結(jié)果(色譜截圖）。（1)樣品3的酶切圖譜；（2)陽性樣本圖譜庫中 牛的酶切圖譜；（3)陽性樣本圖譜庫中豬的酶切圖譜；（4)陽性樣本圖譜庫中牛和豬的酶切 圖譜與樣本3的酶切圖譜重疊圖。
[0069] 圖6.樣品4的分析結(jié)果(色譜截圖）。（1)樣品4的酶切圖譜；（2)陽性樣本圖譜庫中 驢的酶切圖譜；（3)陽性樣本圖譜庫中馬的酶切圖譜；（4)陽性樣本圖譜庫中驢和馬的酶切 圖譜與樣本4的酶切圖譜重疊圖。
[0070] 圖7.樣品5的分析結(jié)果(色譜截圖）。（1)樣品5的酶切圖譜；（2)陽性樣本圖譜庫中 馬的酶切圖譜；（3)陽性樣本圖譜庫中豬的酶切圖譜；（4)陽性樣本圖譜庫中馬和豬的酶切 圖譜與樣本5的酶切圖譜重疊圖。
[0071] 圖8.樣品6的分析結(jié)果(色譜截圖）。（1)樣品6的酶切圖譜；（2)陽性樣本圖譜庫中 綿羊的酶切圖譜；（3)陽性樣本圖譜庫中豬的酶切圖譜；（4)陽性樣本圖譜庫中綿羊和豬的 酶切圖譜與樣本6的酶切圖譜重疊圖。
[0072] 圖9.樣品7的分析結(jié)果(色譜截圖）。（1)樣品7的酶切圖譜；（2)陽性樣本圖譜庫中 綿羊的酶切圖譜；（3)陽性樣本圖譜庫中鴨子的酶切圖譜；（4)陽性樣本圖譜庫中綿羊和鴨 子的酶切圖譜與樣本7的酶切圖譜重疊圖。
[0073] 圖10.樣品8的分析結(jié)果(色譜截圖）。（1)樣品8的酶切圖譜；（2)陽性樣本圖譜庫中 雞的酶切圖譜；（3)陽性樣本圖譜庫中鴨子的酶切圖譜；（4)陽性樣本圖譜庫中綿羊的酶切 圖譜；（5)陽性樣本圖譜庫中雞、鴨子和綿羊的酶切圖譜與樣本8的酶切圖譜重疊圖。
【具體實施方式】
[0074] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
[0075] 實施例1:陽性樣本菌種庫的構(gòu)建
[0076] 通過NCBI數(shù)據(jù)庫獲得綿羊（Ovis aries|KR868678.1)、山羊（Capra hircus KR059175.1)、馬化quus cabal lus I KT757764.1)、驢化quus asinus I X97337.1)、牛（Bos Taurus IKT184472.1)、豬（Sus scrofa IKF569218.1)、巧牛（Bos muUis I KR106993.1)、水牛 (Bubalus bulalis I JN632607.1)、兔子（Oiyctolagus cuniculus |AJ001588.1)、貓（Felis 。日化3|肥0753.1)、大鼠（1?日《113 11〇'￥6邑1。113|陽011917.1)、狐貍（化1口63|1^11443.1)、狗 (Canis familiaris I AY29880.1)、駱（Nyctereutes procyonoides I GU25622.1)、馬鹿 (Cervus elaphus|AB245427.2)、駱駝（Camelus bactrianus fe;rus|EF212038.2)、雞 (Gallus I KR：M7464.1)、鴨（Anas I KF751616.1)鶴譜（Coturnix japonica IAP003195.2)、大 雁（Anser 巧即oides IKT427463.1)、錯子（Columba livia IKP319029.1)和火雞(Meleagris gallopavo|EF153719.1)的COI(巧tochrome oxidase subunit I)序列，截取每個物種序列 對 CAACCACAAAGACATTGGCA 和 GGTGTCCGAARAAYCARAA (方向 5 - -3 -)之間的片段核酸序列，委托 北京博軒宏宇生物技術(shù)有限公司利用全基因組體外合成技術(shù)按照該核酸序列體外合成各 個物種的C0I片段，并將合成好的基因片段分別克隆至pU巧7(武漢森靈生物科技有限公司） 上，將克隆好的載體轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞D冊a中，制備成具有氨節(jié)抗性的陽性菌株。將所有菌株 分別擴(kuò)增培養(yǎng)，用終濃度40 %的甘油-8(TC保存，制備陽性樣本菌種庫。
[0077] 實施例2:制備陽性樣本質(zhì)粒
[007引將加 L菌種保存液(來源于陽性樣本菌種庫)接種至5mL LA培養(yǎng)基(蛋白腺：lOg/L， 酵母:5g/L，化Cl: lOg/L W及氨節(jié)青霉素(天根生物）：lOOug/血）中37°C擴(kuò)增培養(yǎng)24h，按照 質(zhì)粒提取試劑盒（TaKaRa Mini邸ST plasmid purification kit Ver.4.0)的說明書操作 提取質(zhì)粒樣本。
[0079] 實施例3:設(shè)計針對哺乳動物和禽類C0I片段的通用引物
[0080] 比對分析實施例1中截取每個物種序列對CAACCACAAAGACATTGGCA和 GGTGTCCGAARAAYCARAA (方向5' -3')之間的片段核酸序列，在各個物種共有的序列區(qū)間共設(shè) 計3對不同引物，W實施例2中提取的質(zhì)粒作為模板進(jìn)行PCR實驗，對引物的特異性進(jìn)行分析 測試，結(jié)果表明第二對引物可W作為通用引物對哺乳動物類和禽類C0I序列進(jìn)行有效擴(kuò)增 (結(jié)果見附圖2)。第二對的引物序列如下(方向5'^3'）：
[0081 ] C0I-F:CGNATAAAYAAYATRAGCTTYTGA
[0082] C0I-R:TANACTTCDGGRTGNCCRAARAATCA
[0083] R：A/G；Y:C/T；D:G/A/T；N:A/T/G/C
[0084] 實施例4:內(nèi)切酶的篩選
[00化]通過肥Bcutter V2.0分析實施例1中不同物種C0I序列中的內(nèi)切酶位點，通過比 對，初步確定Alu I，化a II，Hind IIIW及Xba I作為候選內(nèi)切酶進(jìn)行實驗鑒定。W實施例2 制備的陽性樣本質(zhì)粒為模板，W實施例3篩選獲得的通用引物為擴(kuò)增引物，用PCR擴(kuò)增試劑 盒(Q5化曲-Fide 1 i ty Ki t，肥B)分別擴(kuò)增出不同物種的C01序列，PCR的反應(yīng)條件遵照PCR 擴(kuò)增試劑盒說明書進(jìn)行設(shè)定。選擇肥B的內(nèi)切酶Alu I，化a II，Hind III-HFW及Xba I對 PCR產(chǎn)物進(jìn)行單酶切，酶切反應(yīng)條件為37°C，比，滅活條件為80°C，20min。酶切體系為:PCR產(chǎn) 物：lOuL，內(nèi)切酶：luL，Cutsmad buf f er:加 L，此0: 34uL，Total: 50uL。將酶切產(chǎn)物用DHPLC (Denaturing High Performance Liquid Chromatography)變性高效液相色譜 (Transgenomic公司）進(jìn)行分析，上樣量為40uL，分析模式為universal model，分析條件如 表1。研究結(jié)果表明，單酶切體系無法實現(xiàn)對全部陽性樣本的有效區(qū)分，因此，進(jìn)一步篩選雙 酶切體系的區(qū)分效果，雙酶切的組合為I:Alu I+Hpa I+Hind I+Xba I;IV:Hpa II+Hind III-HF;V:Hpa II巧ba I;VI:Hind III-HF巧ba I。酶切反應(yīng)條 件為37°Cah，滅活條件為80°C，20min，酶切體系為：PCR產(chǎn)物：10uL，酶l:luL，酶2:luL， Cutsmad buffer:加 L，此0:33uL，Total:50uL。鑒定結(jié)果表明，僅有IV:Hpa II+Hind III- HF的雙酶切組合可W實現(xiàn)對陽性樣本的有效區(qū)分，為了達(dá)到最佳的物種鑒定效果，最終確 定用化a II和化nd III雙酶切處理PCR產(chǎn)物，酶切反應(yīng)條件為37°Cah，滅活條件為80°C， 20min，酶切體系為：PCR產(chǎn)物：lOuL，Hpa II: luL，Hind III: luL，Cutsmad緩沖液：5uL，此0: 33uL，總共：50uL。
[0086] 表1 :DHPLC(universal model)的核酸片段分離條件 [00871
[0088] 實施例5:陽性樣本圖譜庫的構(gòu)建
[0089] W實施例2制備的陽性樣本質(zhì)粒為模板，W實施例3篩選獲得的通用引物為擴(kuò)增引 物，用PCR擴(kuò)增試劑盒(Q5化曲-Fidelity Kit,肥B)分別擴(kuò)增出不同物種的C0I序列，PCR的 反應(yīng)條件遵照PCR擴(kuò)增試劑盒說明書進(jìn)行設(shè)定。按照實施例4確定的酶切反應(yīng)條件對PCR產(chǎn) 物進(jìn)行酶切，按照實施例4所示的DHPLC分析條件和上樣量對酶切產(chǎn)物進(jìn)行分析，儲存所獲 得的酶切圖譜(見附圖1)構(gòu)建陽性樣本圖譜庫。
[0090] 實施例6:樣本一的動物源性成份分析
[0091] 樣本一來源于市購標(biāo)稱為"兔肉"的肉制品。稱取樣本0.2g，使用基因組提取試劑 盒（TakaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0)提取樣本基因 組，具體提取步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行，提取獲得的基因組樣本濃度用超微量核酸測定 儀化U0,購自于英國柏諾有限公司）測定，經(jīng)測定，樣品的基因組濃度為64ng/uL。用實施例3 篩選獲得的通用引物為擴(kuò)增引物，用PCR擴(kuò)增試劑盒(Q甜i曲-Fidelity Kit,肥B)分別擴(kuò)增 出不同物種的C0I序列，PCR的反應(yīng)條件遵照PCR擴(kuò)增試劑盒說明書進(jìn)行設(shè)定。按照實施例4 確定的酶切反應(yīng)條件對PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，按照實施例4所示的DHPLC分析條件和上樣量對 酶切產(chǎn)物進(jìn)行分析，酶切圖譜見圖3中的（1)。經(jīng)比對，所獲得酶切圖譜與陽性物種圖譜庫中 的兔酶切圖譜（圖3中的（2))全重合（圖3中的（3))，分析結(jié)果顯示樣品一為兔肉樣本。為了 驗證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，將PCR產(chǎn)物測序(委托北京博軒宏宇生物技術(shù)有限公司完成），經(jīng)過 比對，測序結(jié)果顯示該P(yáng)CR序列與兔子（OiTctolagus cuniculus IAJ001588.1)的序列相似 度為100% ,本次檢測結(jié)果正確。
[0092] 實施例7:樣本二的動物源性成份分析
[0093] 樣本二來源于市購標(biāo)稱為"鴨肉"的肉制品。稱取樣本0.2g，使用基因組提取試劑 盒（TakaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0)提取樣本基因 組，具體提取步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行，提取獲得的基因組樣本濃度用超微量核酸測定 儀化U0,購自于英國柏諾有限公司）測定，經(jīng)測定，樣品的基因組濃度為128ng/uL。用實施例 3篩選獲得的通用引物為擴(kuò)增引物，用PCR擴(kuò)增試劑盒(Q5Hi曲-Fidelity Kit,肥B)分別擴(kuò) 增出不同物種的C0I序列，PCR的反應(yīng)條件遵照PCR擴(kuò)增試劑盒說明書進(jìn)行設(shè)定。按照實施例 4確定的酶切反應(yīng)條件對PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，按照實施例4所示的DHPLC分析條件和上樣量對 酶切產(chǎn)物進(jìn)行分析，酶切圖譜見圖4中的（1)。經(jīng)比對，所獲得酶切圖譜與陽性物種圖譜庫中 任何一張圖譜的洗脫峰均不相同。為了進(jìn)一步確定物種成份，將樣品的PCR產(chǎn)物克隆至T載 體(pMD?l8-T Vector Cloning Kit,IMaRa)，挑取100個克隆進(jìn)行測序分析(委托北京博軒 宏宇生物技術(shù)有限公司完成），根據(jù)測序結(jié)果顯示，所測序列均為鴨物種，將測序結(jié)果與 NCBI數(shù)據(jù)庫中鴨的C0I序列(Anas|KF751616.1)進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)存在堿基突變，突變結(jié)果剛 好影響酶切結(jié)果，測序結(jié)果如下（下劃線粗體標(biāo)記的為影響酶切結(jié)果的核酸突變位點）。^ 巧。序的T載體為模板，用實施例3篩選獲得的通用引物為擴(kuò)增引物，用PCR擴(kuò)增試劑盒（Q5 化曲-Fidelity Kit,肥B)分別擴(kuò)增出不同物種的C0I序列，PCR的反應(yīng)條件遵照PCR擴(kuò)增試 劑盒說明書進(jìn)行設(shè)定。按照實施例4確定的酶切反應(yīng)條件對PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，按照實施例4 所示的DHPLC分析條件和上樣量對酶切產(chǎn)物進(jìn)行分析，所獲得的酶切圖譜與圖4中的（1)完 全重合，最終確認(rèn)，樣本二為鴨肉樣本，同時將樣本二的酶切圖譜錄入陽性樣本圖譜庫。
[0094] 樣品二的測序結(jié)果
[0095] 了cggataaataatatgagcttttgactcctcccaccatcattcctccttctactcgcctcatccactgtagaagctg gcgctggtacgggttgaaccgtatacccacctctagcaggcaacctagcccacgccggagcctcagtggacctggct atcttctcacttcacctggctggtgtctcctccatcctcggagccattaacttcattaccacagccatcaacataaa accccccgcactctcacaataccaaaccccacttttcgtctgatcagtcctaattaccgccatcctgctcctcctat cactccccgtcctcgccgccggcatcacaatgctactaaccgaccgaaacctaaacaccacattctttgatcctgcc ggagggggagacccaatcctgtaccaacacctattttgattcttcggacatcccggaagtataa
[0096] 陽性樣本庫中鴨(Anas|KF751616.1)的序列
[0097] Cggataaaataatatgagcttttgactcctcccaccatcattcctccttctactcgcctcatccactgtagaagctg gcgctggtacgggttgaaccgtatacccacctctagcaggcaacctagcccacgccggagcctcagtggacctggct atcttctcacttcacctggctggtgtctcctccatcctcggagccattaacttcattaccacagccatcaacataaa accccccgcactctcacaataccaaaccccacttttcgtctggtcagtcctaattaccgccatcccgctcctcctat cactccccgtcctcgccgccagcatcacaatgctactaaccgaccgaaacctaaacaccacattctttgatcctgcc ggagggggagacccaatcctgtaccaacacctattttgattcttcggacatcccgaaagtttaa
[0098] 實施例8:樣本=的動物源性成份分析
[0099] 樣本=來源于市購標(biāo)稱為"牛肉"的肉制品。稱取樣本0.2g，使用基因組提取試劑 盒（TakaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0)提取樣本基因 組，具體提取步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行，提取獲得的基因組樣本濃度用超微量核酸測定 儀化U0,購自于英國柏諾有限公司）測定，經(jīng)測定，樣品的基因組濃度為86ng/uL。用實施例3 篩選獲得的通用引物為擴(kuò)增引物，用PCR擴(kuò)增試劑盒(Q甜i曲-Fidelity Kit,肥B)分別擴(kuò)增 出不同物種的C0I序列，PCR的反應(yīng)條件遵照PCR擴(kuò)增試劑盒說明書進(jìn)行設(shè)定。按照實施例4 確定的酶切反應(yīng)條件對PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，按照實施例4所示的DHPLC分析條件和上樣量對 酶切產(chǎn)物進(jìn)行分析，酶切圖譜見圖5中的（1)。經(jīng)比對，所獲得酶切圖譜與陽性物種圖譜庫中 的牛的酶切圖譜（圖5中的（2))不重合而與陽性物種圖譜庫中豬的酶切圖譜（圖5中的（3)) 完全重合(圖5中的(4))，分析結(jié)果顯示樣品=為豬肉樣本。為了驗證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，將 PCR產(chǎn)物測序(委托北京博軒宏宇生物技術(shù)有限公司完成），經(jīng)過比對，測序結(jié)果顯示該P(yáng)CR 序列與豬(SUS scro化|K巧69218.1)的序列相似度為100%，本次檢測結(jié)果正確。
[0100] 實施例9:樣本四的動物源性成份分析
[0101] 樣本四來源于市購標(biāo)稱為"驢肉"的肉制品。稱取樣本0.2g，使用基因組提取試劑 盒（TakaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0)提取樣本基因 組，具體提取步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行，提取獲得的基因組樣本濃度用超微量核酸測定 儀化U0,購自于英國柏諾有限公司）測定，經(jīng)測定，樣品的基因組濃度為126ng/uL。用實施例 3篩選獲得的通用引物為擴(kuò)增引物，用PCR擴(kuò)增試劑盒(Q5Hi曲-Fidelity Kit,肥B)分別擴(kuò) 增出不同物種的C0I序列，PCR的反應(yīng)條件遵照PCR擴(kuò)增試劑盒說明書進(jìn)行設(shè)定。按照實施例 4確定的酶切反應(yīng)條件對PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，按照實施例4所示的DHPLC分析條件和上樣量對 酶切產(chǎn)物進(jìn)行分析，酶切圖譜見圖6中的（1)。經(jīng)比對，所獲得酶切圖譜與陽性物種圖譜庫中 的驢和馬的酶切圖譜完全重合（圖6中的（4))，分析結(jié)果顯示樣品四為馬肉和驢肉混合樣 本。為了進(jìn)一步確定物種成份，將樣品的PCR產(chǎn)物克隆至T載體(pMD?l8-T Vector Cloning Kit JaKaRa)，挑取100個克隆進(jìn)行測序分析(委托北京博軒宏宇生物技術(shù)有限公司完成）， 根據(jù)測序結(jié)果顯示，所測樣本僅包含兩種序列，一種與馬化quus caballus IKT757764.1)的 序列相似度為100%，另一種與驢化quus asinus I X97337.1)的序列相似度為100%。本次檢 測結(jié)果正確。
[0102 ]實施例10:樣本五的動物源性成份分析
[0103] 樣本五來源于市購標(biāo)稱為"驢肉"的肉制品。稱取樣本0.2g，使用基因組提取試劑 盒（TakaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0)提取樣本基因 組，具體提取步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行，提取獲得的基因組樣本濃度用超微量核酸測定 儀化U0,購自于英國柏諾有限公司）測定，經(jīng)測定，樣品的基因組濃度為64ng/uL。用實施例3 篩選獲得的通用引物為擴(kuò)增引物，用PCR擴(kuò)增試劑盒(Q甜i曲-Fidelity Kit,肥B)分別擴(kuò)增 出不同物種的C0I序列，PCR的反應(yīng)條件遵照PCR擴(kuò)增試劑盒說明書進(jìn)行設(shè)定。按照實施例4 確定的酶切反應(yīng)條件對PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，按照實施例4所示的DHPLC分析條件和上樣量對 酶切產(chǎn)物進(jìn)行分析，酶切圖譜見圖7中的（1)。經(jīng)比對，所獲得酶切圖譜與陽性物種圖譜庫中 的豬和馬的酶切圖譜（圖7中的（4))完全重合，分析結(jié)果顯示樣品五為豬肉和馬肉的混合 物。為了進(jìn)一步確定物種成份，將樣品的PCR產(chǎn)物克隆至T載體(pMD?l8-T Vector Cloning Kit JaKaRa)，挑取100個克隆進(jìn)行測序分析(委托北京博軒宏宇生物技術(shù)有限公司完成）， 根據(jù)測序結(jié)果顯示，所測樣本僅包含兩種序列，一種與馬化quus cabal lus IKT757764.1)的 序列相似度為100%，另一種與豬(sus scrofa|KF569218.1)的序列相似度為100%。本次檢 測結(jié)果正確。
[0104] 實施例11:樣本六的動物源性成份分析
[0105] 樣本六來源于市購標(biāo)稱為"羊肉"的肉制品。稱取樣本0.2g，使用基因組提取試劑 盒（TakaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0)提取樣本基因 組，具體提取步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行，提取獲得的基因組樣本濃度用超微量核酸測定 儀化U0,購自于英國柏諾有限公司）測定，經(jīng)測定，樣品的基因組濃度為54ng/uL。用實施例3 篩選獲得的通用引物為擴(kuò)增引物，用PCR擴(kuò)增試劑盒(Q5化曲-Fidelity Kit,肥B)分別擴(kuò) 增出不同物種的C0I序列，PCR的反應(yīng)條件遵照PCR擴(kuò)增試劑盒說明書進(jìn)行設(shè)定。按照實施例 4確定的酶切反應(yīng)條件對PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，按照實施例4所示的DHPLC分析條件和上樣量對 酶切產(chǎn)物進(jìn)行分析，酶切圖譜見圖8中的（1)。經(jīng)比對，所獲得酶切圖譜與陽性物種圖譜庫中 的綿羊和豬的酶切圖譜（圖8中的(4))完全重合。分析結(jié)果顯示樣品六為豬肉和羊肉的混合 物。為了進(jìn)一步確定物種成份，將樣品的PCR產(chǎn)物克隆至T載體(pMD?l8-T Vector Cloning Kit JaKaRa)，挑取100個克隆進(jìn)行測序分析(委托北京博軒宏宇生物技術(shù)有限公司完成）， 根據(jù)測序結(jié)果顯示，所測樣本僅包含兩種序列，一種與綿羊(Ovis aries IKR868678.1)的序 列相似度為100%，另一種與豬(SUS scrofa|KF569218.1)的序列相似度為100%。本次檢測 結(jié)果正確。
[0106] 實施例12:樣本屯的動物源性成份分析
[0107] 樣本屯來源于市購標(biāo)稱為"羊肉"的肉制品。稱取樣本0.2g，使用基因組提取試劑 盒（TakaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0)提取樣本基因 組，具體提取步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行，提取獲得的基因組樣本濃度用超微量核酸測定 儀化U0,購自于英國柏諾有限公司）測定，經(jīng)測定，樣品的基因組濃度為10化g/uL。用實施例 3篩選獲得的通用引物為擴(kuò)增引物，用PCR擴(kuò)增試劑盒(Q5Hi曲-Fidelity Kit,肥B)分別擴(kuò) 增出不同物種的C0I序列，PCR的反應(yīng)條件遵照PCR擴(kuò)增試劑盒說明書進(jìn)行設(shè)定。按照實施例 4確定的酶切反應(yīng)條件對PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，按照實施例4所示的DHPLC分析條件和上樣量對 酶切產(chǎn)物進(jìn)行分析，酶切圖譜見圖9中的（1)。經(jīng)比對，所獲得酶切圖譜與陽性物種圖譜庫中 羊和鴨的酶切圖譜完全重合（圖9中的（4))，分析結(jié)果顯示樣品屯為鴨肉和羊肉的混合物。 為了進(jìn)一步確定物種成份，將樣品的PCR產(chǎn)物克隆至T載體(pMD?l8-T Vector Cloning Kit JaKaRa)，挑取100個克隆進(jìn)行測序分析(委托北京博軒宏宇生物技術(shù)有限公司完成）， 根據(jù)測序結(jié)果顯示，所測樣本僅包含兩種序列，一種與綿羊(Ovis aries IKR868678.1)的序 列相似度為100%，另一種與鴨(Anas IKF751616.1)的序列相似度為100%。本次檢測結(jié)果正 確。
[0108] 實施例13:樣本八的動物源性成份分析
[0109] 樣本八來源于市購標(biāo)稱為"羊肉"的肉制品。稱取樣本0.2g，使用基因組提取試劑 盒（TakaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0)提取樣本基因 組，具體提取步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行，提取獲得的基因組樣本濃度用超微量核酸測定 儀化U0,購自于英國柏諾有限公司）測定，經(jīng)測定，樣品的基因組濃度為96ng/uL。用實施例3 篩選獲得的通用引物為擴(kuò)增引物，用PCR擴(kuò)增試劑盒(Q5化曲-Fidelity Kit,肥B)分別擴(kuò) 增出不同物種的C0I序列，PCR的反應(yīng)條件遵照PCR擴(kuò)增試劑盒說明書進(jìn)行設(shè)定。按照實施例 4確定的酶切反應(yīng)條件對PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，按照實施例4所示的DHPLC分析條件和上樣量對 酶切產(chǎn)物進(jìn)行分析，酶切圖譜見圖10中的（1)。經(jīng)比對，所獲得酶切圖譜與陽性物種圖譜庫 中的綿羊、鴨和雞的酶切圖譜完全重合（圖10中的（4))，分析結(jié)果顯示樣本八為羊肉、鴨肉 和雞肉的混合物。為了進(jìn)一步確定物種成份，將樣品的PCR產(chǎn)物克隆至T載體(pMD?l 8-T Vector Cloning Kit,TaKaRa)，挑取100個克隆進(jìn)行測序分析(委托北京博軒宏宇生物技術(shù) 有限公司完成），根據(jù)測序結(jié)果顯示，所測樣本僅包含S種序列，一種與綿羊(Ovis aries KR868678.1)的序列相似度為100%，一種與鴨(Anas IKF751616.1)的序列相似度為100%， 另一種與雞(Gallus|KR347464.1)的序列相似度為100%。本次檢測結(jié)果正確。
[0110] 雖然為了清楚的理解，已經(jīng)借助于附圖和實施例在一些細(xì)節(jié)上描述了上述發(fā)明， 但是說明書和實施例不應(yīng)當(dāng)被視為限制本發(fā)明的范圍。本文中引用的所有專利和科學(xué)文獻(xiàn) 的公開內(nèi)容通過引用完整地清楚并入。
[0111] 參考文獻(xiàn)：
[0112] 1、Teletchea，F(xiàn).Molecular identification methods of fish species : reassessment and possible application.民ev.Fish Biol.Fisheries 2009,19,265- 293.
[0113] 2、民asmussen，民.S.;Morrissey，M.T.Application of DNA-based methods to identify fish and seafood substitution on the commer i c i a 1 market.Compr.Rev.Food Sci.Food Saf.2009,8,118-154.
[0114] 3、民osalee S.民asmussen Hellberg;Michael T.Morrissey.Advances in DNA- based techniques for the detection of seafood species substitution on the commercial market.Technology Review.2011,8(19),308-321.
[011日]4、A.A.Aida，Y.B.Qie Man,C.M.V丄.Wong,et al?'analysis of raw meats and fats of pigs using polymerase chain reaction for Halal authentication.Meat Science，2005，69:47-52.
[0116] 5、Abdel-Rahman，S.M.;El-Saadani，M.A.;Ashiy，K.M.，Haggag，A.S.
[0117] Detection of adulteration and identification of cat's，dog's，donkey's and horse's meat using species-specific PC民 and PC民一民FLP techniques.Australian Journal of Basic and Applied Sciences 2009,3(3)1716- 1719.
[0118] 6、Chandrika Murugaiah，Zainon Mohd Noor，Maimunah Mastakim，et al..Meat species identification and Halal authentication analysis using mitochondrial DM.
[0119] 7、Nadia Haider，Imad Nabulsi，Bassam Al-Safadi. Identification of meat species by PCR-RFLP of the mitochondrial COI gene.Meat Science.2012,90,490- 493.
[0120] 8、M.Eaqub Ali ? U.Hashim ? S.Mustafa ? Yaakob Bin Che Man.Swine-specific PC民一RFLP assay targeting mitochondrial cytochrome B gene for semiquantitative detection of pork in commercial meat products.Food Anal Methods .2012，5，613- 623.
[0121] 9、Abbas Doosti ? Payam Ghasemi Dehkordi ? Ebrahim 民ahimi.Molecular assay to fraud identification of meat products.J Food Sci Technol，2014,5(1): 148-152.
【主權(quán)項】
1. 一種分析肉制品的動物物種來源的方法，所述方法包括以下步驟： 1) 提取肉制品樣品的基因組DNA; 2) 以所述基因組DNA為模板，使用通用COI引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物； 3) 將所述PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切;和 4) 利用DHPLC對酶切產(chǎn)物進(jìn)行分析， 其中步驟2)中所述的通用COI引物對的序列為(方向5'-3'): COI-F(正向引物）：CGNATAAAYAAYATRAGCTTYTGA COI-R(反向引物）：TANACTTCDGGRTGNCCRAARAATCA 其中： R表示A或G; Y表示C或T; D表示G或A或T; N表示A或T或G或C。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟3)中進(jìn)行酶切使用的內(nèi)切酶為Hindlll和/或 HpaII〇3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述動物物種選自哺乳動物和禽類，優(yōu)選選自反芻 動物、犬科動物、兔科、貓科和家禽，和優(yōu)選選自綿羊、山羊、馬、驢、兔子、貓、鼠、牛、豬、狐 貍、狗、絡(luò)、鹿、胳盤、鶴鶴、大雁、鶴子、雞、鴨、火雞和山雞。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在步驟3)中將獲得的DHPLC的洗脫峰與同樣條件下 確定的已知動物物種的DHPLC的洗脫峰進(jìn)行比對，如果兩者的洗脫峰重合，則指示所述肉制 品樣品中存在來源于所述已知動物物種的成份。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的方法，所述方法可用于分析所述肉制品樣品中動 物源性成份組成。6. -種用于分析肉制品的動物物種來源的試劑盒，其包括針對哺乳動物和禽類的通用 C0I引物對，其中所述通用C0I引物對的序列為(方向5'-3'): C0I-F(正向引物）：CGNATAAAYAAYATRAGCTTYTGA COI-R(反向引物）：TANACTTCDGGRTGNCCRAARAATCA 其中： R表示A或G; Y表示C或T; D表示G或A或T; N表示A或T或G或C。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其還包含限制性內(nèi)切酶Hind III和/或限制性內(nèi)切酶 Hpa UK8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其還包含標(biāo)準(zhǔn)DNA模板和/或PCR反應(yīng)液，優(yōu)選其中所 述標(biāo)準(zhǔn)DNA模板是含有已知動物物種的CO I序列的質(zhì)?；蛘呋蚪M。9. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其還包含陽性樣本酶切圖譜庫，所述陽性樣本酶切圖 譜庫是指根據(jù)已知動物物種的C0I序列的質(zhì)粒或者基因組作為模板，使用權(quán)利要求6中所述 的通用C0I引物進(jìn)行擴(kuò)增，所獲得的PCR產(chǎn)物使用限制性內(nèi)切酶Hind III和/或限制性內(nèi)切 酶Hpa III進(jìn)行酶切后的DHPLC洗脫峰圖譜。10.根據(jù)權(quán)利要求6-9中任一項所述的試劑盒在分析肉制品的動物物種來源中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12Q1/68GK106048034SQ201610515926
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年7月1日
【發(fā)明人】路勇, 姜潔, 宋麗萍, 毛婷, 張衛(wèi)民, 郭淼, 胡智愷
【申請人】北京市食品安全監(jiān)控和風(fēng)險評估中心