一種細(xì)胞內(nèi)支架結(jié)構(gòu)及方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于TALE的新型細(xì)胞內(nèi)支架結(jié)構(gòu)及方法，它包括構(gòu)建在質(zhì)粒載體上的DNA支架序列和兩段相鄰的TALE?酶融合蛋白結(jié)合序列。利用TALE?DNA支架技術(shù)將細(xì)胞內(nèi)異源代謝通路酶系共區(qū)域化，提高代謝速率，增加目的代謝物產(chǎn)量。
【專利說明】
-種細(xì)胞內(nèi)支架結(jié)構(gòu)及方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物工程和生物制造領(lǐng)域，特別設(shè)及利用分子生物學(xué)技術(shù)和基因編輯 技術(shù)發(fā)明一種新型的細(xì)胞內(nèi)支架結(jié)構(gòu)，作為在工程微生物中提高目的產(chǎn)物產(chǎn)量的新方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 真核細(xì)胞中天然存在的代謝過程可集中在由內(nèi)膜系統(tǒng)構(gòu)建成的各種亞細(xì)胞隔間 中進(jìn)行，使酶促反應(yīng)系統(tǒng)區(qū)域化。例如，Ξ簇酸循環(huán)和脂肪酸的β-氧化集中在線粒體中完 成，而蛋白質(zhì)的加工和修飾在高爾基體中進(jìn)行。酶的區(qū)域化有利于同一代謝途徑中的酶互 相聯(lián)系、密切配合，酶、輔酶和底物高度濃縮，從而提高酶促反應(yīng)速率;同時能使不同代謝途 徑隔離分布，使各代謝途徑各行其職，互不干擾，整個細(xì)胞的代謝得W順利進(jìn)行;此外，某一 代謝途徑產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物在不同細(xì)胞器呈區(qū)域化分布，而形成局部高代謝物濃度，有利于 其對相關(guān)代謝途徑的特異調(diào)節(jié)。特別當(dāng)產(chǎn)物有毒、活性強、不穩(wěn)定或是相對不溶時，酶促反 應(yīng)區(qū)域化顯得尤為重要。
[0003] 然而，目前的代謝工程和發(fā)酵工程等領(lǐng)域的研究和生產(chǎn)依賴于將其他物種(特別 是真核生物）的酶促代謝通路或代謝流轉(zhuǎn)入工程微生物(如大腸桿菌、酵母等）中進(jìn)行研究 和生產(chǎn)，而異源代謝通路中的酶系在微生物細(xì)胞內(nèi)往往沒有區(qū)域化的機制，特別是無內(nèi)膜 系統(tǒng)的原核生物。因此，異源代謝通路在工程微生物中缺少區(qū)域化集成和調(diào)節(jié)機制運一情 況，往往導(dǎo)致目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量低，生產(chǎn)效率低，且部分有毒中間產(chǎn)物甚至對宿主造成傷害。
[0004] 因此，近年來有許多研究者致力于在工程微生物中設(shè)計支架結(jié)構(gòu)，搭載酶蛋白復(fù) 合物，使多酶體系集成化。DNA納米技術(shù)能進(jìn)行一維、二維甚至Ξ維的裝配，形成支架網(wǎng)絡(luò)結(jié) 構(gòu)，迄今，蛋白-DNA裝配體已被用于組織級聯(lián)酶促反應(yīng)，但其裝配復(fù)雜，且依賴單鏈莖環(huán)結(jié) 構(gòu)，其細(xì)胞內(nèi)工程應(yīng)用受限。蛋白支架在生命體中天然存在，如ΜΡΚ信號通路中的支架蛋白 KSR等，但其空間折疊復(fù)雜，原核體系異源表達(dá)常無效。RNA支架可W通過轉(zhuǎn)錄機制產(chǎn)生，天 然形成單鏈莖環(huán)結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生穩(wěn)定的核酸-蛋白相互作用，RNA已被用于在細(xì)胞內(nèi)建立高階組 件，并有可能被用來在體內(nèi)設(shè)計細(xì)胞內(nèi)環(huán)境。2011年，Camile等人證明了一種通過合理設(shè)計 RNA組件，搭建RNA支架，將該支架配體蛋白與產(chǎn)氨相關(guān)酶融合，在大腸桿菌中提高了產(chǎn)氨效 率。此后，類似的方法被應(yīng)用于十五燒和班巧酸的微生物制造。盡管RNA支架的應(yīng)用日趨深 入，但因其配體蛋白的種類有限，且RNA相對DNA易降解，因此其可擴(kuò)展性和穩(wěn)定性一直是其 不可逾越的瓶頸。
[0005] 因此，能否設(shè)計出一類天然的、具有高度穩(wěn)定性的、可擴(kuò)展的和裝配簡單的細(xì)胞內(nèi) 支架結(jié)構(gòu)，從而應(yīng)用于一系列蛋白酶的特異性結(jié)合和次序性排列，實現(xiàn)酶促反應(yīng)體系的區(qū) 域化集成和高效率生產(chǎn)，成為生物工程和生物制造領(lǐng)域重點關(guān)注的課題。鑒于該支架系統(tǒng) 的設(shè)計思路是蛋白質(zhì)與穩(wěn)定支架系統(tǒng)的特異性有序結(jié)合，近年來日趨成熟的基因編輯技術(shù) (例如ZFN、TALEN、CRISPER-CAS9)有望成為解決該問題的突破口。ZFN技術(shù)依賴于鋒指蛋白 與Ξ聯(lián)堿基的特異性識別，對DNA結(jié)合序列有較強的選擇性，其作用逐漸被TALEN技術(shù)取代。 CRISPER-化S作為近年來最熱口的新型基因編輯技術(shù)，主要依賴于目的DNA、引導(dǎo)RNA(gRNA) 和化s蛋白Ξ者的結(jié)合，實現(xiàn)對特定DNA序列的編輯。最近有研究將CRISPER-化s技術(shù)應(yīng)用到 細(xì)胞內(nèi)支架系統(tǒng)的構(gòu)建，證明其能局部提高代謝反應(yīng)中特定酶的濃度。然而，該方法仍然基 于引導(dǎo)RNA(gRNA)與配體蛋白的結(jié)合，屬于RNA支架的范疇，其穩(wěn)定性和擴(kuò)展性存在局限。 TALEN技術(shù)基于TALE蛋白模塊與DNA四種堿基直接的一一對應(yīng)特異性結(jié)合，理論上非常適合 于構(gòu)建細(xì)胞內(nèi)多酶代謝通路的支架系統(tǒng)。
[0006] 轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子（transcription activatorUke effector,TALE)最初是 在植物致病菌黃單胞桿菌屬(Xanthomonas)中發(fā)現(xiàn)的。運類植物致病菌通過in型分泌系統(tǒng) 將TALE蛋白注射到植物細(xì)胞質(zhì)中，然后TALE被轉(zhuǎn)運到細(xì)胞核中，模擬真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子 指導(dǎo)宿主細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄。TALE的結(jié)構(gòu)包括幾個重要功能部分:核定位信號和C-端的酸性激 活區(qū)，位于中間的結(jié)合DNA的串聯(lián)重復(fù)區(qū)域。中間的DNA結(jié)合區(qū)域由一系列數(shù)目可變的可重 復(fù)單元構(gòu)成，天然TALE的可重復(fù)單元數(shù)目一般為8.5~28.5個，常見的為17.5個。每個重復(fù) 單元包括33~35個氨基酸，特異識別一種堿基。在運33~35個氨基酸中，位于第12和第13位 的兩個相鄰的氨基酸決定了運個重復(fù)單元所特異識別的堿基，運兩個氨基酸被稱為重復(fù)可 變雙殘基(repeat variable di-residue,RVD)，運兩個氨基酸決定了每個重復(fù)單元所識別 的DNA堿基，基于每個重復(fù)單元對應(yīng)一個堿基，可將不同的重復(fù)單元串聯(lián)起來，通常為14~ 20個重復(fù)單元，使之識別特定的DNA序列。
[0007] TALE識別DNA的機制在于不同的RVD能夠相對特異地分別識別ATCG 4種堿基中的 一種通過對天然TALE的研究發(fā)現(xiàn)，有20多種不同的RVD，其中His/Asp化D)、Asn/Gly(NG)、 Asnzlle(NI)和Asn/Asn(順)4種RVD占總量的3/4根據(jù)生物信息學(xué)和實驗研究，NI識別堿基 A;皿識別堿基C; NG識別堿基T;順識別堿基G/AdRVD的第1位氨基酸與蛋白質(zhì)骨架結(jié)合，起到 穩(wěn)定RVD的作用；第2位氨基酸則直接與DNA的堿基特異識別。此外，天然TALE祀DNA序列5 ' 端保守的跟隨著一個T堿基，所W祀序列總是WT堿基開始，通過運些結(jié)構(gòu)特點，可W根據(jù)實 驗?zāi)康膶NA結(jié)合域的重復(fù)序列進(jìn)行設(shè)計，得到特異識別任意序列祀位點的TALE。目前TALE 主要被用于祀向基因編輯的工具，比如knock-out、knock-in、堿基替換、點突變或者基因修 飾等，此外還被用于基因的表達(dá)調(diào)控，比如萬能啟動子。TALE技術(shù)現(xiàn)已經(jīng)成功應(yīng)用于細(xì)胞、 斑馬魚、果蛹、大鼠、小鼠及植物上，并且被研究者不斷地嘗試應(yīng)用到其他更多的物種。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是利用TALE-DNA支架技術(shù)將細(xì)胞內(nèi)異源代謝通路酶系 共區(qū)域化，提高代謝速率，增加目的代謝物產(chǎn)量。
[0009] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明建立了一種基于TALE-DNA支架技術(shù)的新型細(xì)胞內(nèi) 異源代謝通路加速系統(tǒng)。該系統(tǒng)設(shè)計了 Ξ段TALE編碼序列(分別由14個TALE模塊組成，識別 14個堿基的DNA序列），分別與對應(yīng)的巧光蛋白或酶蛋白融合，在大腸桿菌中表達(dá)。
[0010] 具體技術(shù)方案為：
[0011] 所述細(xì)胞內(nèi)支架結(jié)構(gòu)包括構(gòu)建在質(zhì)粒載體上的DNA支架序列（含串聯(lián)重復(fù)的兩段 相鄰的TALE結(jié)合序列)和TALE-酶融合蛋白編碼序列。
[0012]優(yōu)選地，所述兩段相鄰的TALE-酶融合蛋白結(jié)合序列之間無間隔序列。
[OOU]優(yōu)選地，所述兩段相鄰的TALE-酶融合蛋白結(jié)合序列之間有6bp的間隔序列。
[0014]優(yōu)選地，所述兩段相鄰的TALE-酶融合蛋白結(jié)合序列之間有16bp的間隔序列。
[001引本發(fā)明所述TALE-酶融合蛋白編碼序列中TALE蛋白編碼序列的3'端(對應(yīng)TALE蛋 白的C端)通過ACTAGA(SEQ ID NO. 22，對應(yīng)化r-A巧氨基酸殘基)與酶編碼序列的5 '端(對應(yīng) 酶蛋白的N端)融合。
[0016] 優(yōu)選地，所述DNA支架序列如沈Q ID NO.7、沈Q ID NO.8或沈Q ID NO.9所示;所述 了八1^蛋白編碼序列如56910^.1、56910^.3或沈910^.5所示。沈9^.1，569^.3 和沈QN0.5就是分別編碼TALE1至TALE3的序列，在質(zhì)粒上會與沈QIDN0.7、沈QIDN0.8 或SEQ ID NO.9所示的支架序列組合排列在一起，不過中間會加一些基本元件，比如Plac啟 動子，核糖體結(jié)合位點，轉(zhuǎn)錄終止子W及融合的目的蛋白表達(dá)序列GFP1/GFP2或IAAM/IAAH。
[0017] 本發(fā)明還提供了一種PSB1C3改造質(zhì)粒，所述PSB1C3改造質(zhì)粒中含有權(quán)利要求6所 述的支架結(jié)構(gòu)。
[0018] 所述PSB1C3改造質(zhì)粒的構(gòu)建方法包括如下步驟(所有克隆過程均在PSB1C3載體上 進(jìn)行）：
[0019] (1)在TALE1序列下游插入GFP1或IAAM編碼片段，在TALE2序列、TALE3序列下游插 入 GFP2 或 IAAH 片段，構(gòu)成 TALE1-GFP1、TALE1-IAAM、TALE2-GFP2、TALE2-IAAH、TALE3-GFP2、 TALE3-IAAH片段；同時在Plac下游插入RBS片段，構(gòu)成Plac-RBS片段所述TALE1序列即為SEQ ID NO. 1所示序列；所述TALE2序列即為沈Q ID NO.3所示序列；所述TALES序列即為沈Q ID NO. 5所示序列；
[0020] (2)在TALE 1-GFP1、TALE2-GFP2、TALE2-IAAH、TALE3-GFP2、TALE3-IAAH 下游插入 ter 片段，構(gòu)成 TALEl-GFPl-ter、TALE2-GFP2-ter、TALE2-IAAH-ter、TALE3-GFP2-ter、 TALE3-IAAH-ter 片段；
[0021] (3)在TALEl-GFPl'TALEl-IAAM'TALEl-GFPl-ter'TALES-GFPS-ter'TALES-GFPS- ter 上游插入 Plac-RBS 片段 ，構(gòu)成 Plac-RBS-TALEl-GFPl、Plac-RBS-TALEl-IAAM、Plac-RBS- TALEl-GFPl-ter、Plac-RBS-TALE2-GFP2-ter、Plac-RBS-TALE3-GFP2-ter 片段；
[0022] (4)在Plac-RBS-TALEl-GFPl下游插入RBS序列，隨后在所得片段下游插入TALE2- GFP2-ter 或 TALE3-GFP2-ter 片段，構(gòu)建至 PSB1C3 質(zhì)粒骨架中得到 pTl-Gl/T2-G2、pTl-Gl/ T3-G2 質(zhì)粒，再酶切得到 Plac-RBS-TALEl-GFPl-RBS-TALE2-GFP2-ter、Plac-RBS-TALEl- GFPl-RBS-TALE3-GFP2-ter 片段；在 Plac-RBS-TALEl-IAAM 下游插入 RBS 序列隨后在所得片 段下游插入TALE2-IAAH-ter片段，構(gòu)建至PSB1C3質(zhì)粒骨架中得到PT1-IAAM/T2-IAAH質(zhì)粒， 再酶切得到 Plac-RBS-TALEl-IAAM-RBS-TALE2-IAAH-ter 片段；
[0023] (5)在Scaffoldl上游分別插入 Plac-RBS-TALEl-GFPl-ter、Plac-RBS-TALE3- GFP2-ter、Plac-RBS-TALEl-GFPl-RBS-TALE3-GFP2-ter片段，構(gòu)建至pSBlC3質(zhì)粒骨架中得 至 IJpTl-GFPl-Sl、pT3-GFP2-Sl、pTl-Gl/T3-G2-Sl 質(zhì)粒；
[0024] (6)在Scaffolds上游分別插入 Plac-RBS-TALE2-GFP2-ter、Plac-RBS-TALEl- GFPl-RBS-TALE2-GFP2-ter、Plac-RBS-TALEl-IAAM-RBS-TALE2-IAAH-ter 片段，構(gòu)建至 PSB1C3 質(zhì)粒骨架中得到 pT2-GFP2-S2、pTl-Gl/T2-G2-S2、pTl-IAAM/T2-IAAH-S2 質(zhì)粒；
[00 巧](7)在Scaffolds上游分別插入 Plac-RBS-TALE2-GFP2-ter、Plac-RBS-TALEl- GFPl-RBS-TALE2-GFP2-ter、Plac-RBS-TALEl-IAAM-RBS-TALE2-IAAH-ter 片段，構(gòu)建至 PSB1C3 質(zhì)粒骨架中得到 pTl-Gl/T2-G2-S3、pTl-IAAM/T2-IAAH-S3 質(zhì)粒；
[00%]所述 pTl-GFPl-Sl、pT3-GFP2-Sl、pTl-Gl/T3-G2-Sl、pT2-GFP2-S2、pTl-Gl/T2-G2- 82、口1'1-1441/了2-144護(hù)52、91'1-61/了2-62-53、91'1-1441/了2-144護(hù)53質(zhì)粒即為9581〔3改造 質(zhì)粒；91'1-6。？1-51、9了3-6。？2-51、91'1-61/了3-62-51、9了2-6。？2-52、91'1-61/了2-62-52、口1'1- IAAM/T2-IAAH-S2、pTl-Gl/T2-G2-S3、pTl-IAAM/T2-IAAH-S3質(zhì)粒序列依次如沈Q ID NO. 10 至沈Q ID NO. 17所示。
[0027] 上述方法中，PSB1C3質(zhì)粒載體、Plac啟動子、GFP1、GFP2、IAAM+IAAH、終止子原始質(zhì) 粒由iGEM 化undation DNA distribution 2015提供，TALE1、TALE2、TALE3質(zhì)粒利用Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit 2.0構(gòu)建、RBS序列由iGEM Regist巧提供，基因片段由 Invitroge?完成單鏈合成后在緩沖液中自95°C緩慢降溫至室溫得到。Scaffoldl、 Scaf fold2、Scaffolds由Vi ewSo lid公司全序列合成。實驗中根據(jù)需要通過PCR對原始質(zhì)粒 中的GFP巧日GFP2編碼序列進(jìn)行了改造;其中，在GFP1下游插入密碼子序列W實現(xiàn)翻譯終止、 在GFP2上游敲去一個堿基W避免移碼突變。同時在IAAM+IAAH質(zhì)粒中通過PCR克隆出IAAM、 IAAH基因。所有新構(gòu)建和改造的基因片段均被亞克隆于PSB1C3載體并測序檢測，選取測序 正確的分子進(jìn)行酶切得到對應(yīng)基因片段。
[0028] 下面對本發(fā)明作進(jìn)一步說明：
[0029] TALE識別的DNA支架序列與TALE-酶表達(dá)序列共建在同一個PSB1C3質(zhì)粒上，使該質(zhì) 粒既能表達(dá)目的蛋白，又能承擔(dān)支架功能，簡化了該TALE-DNA支架系統(tǒng)。該系統(tǒng)具有如SEQ 10^.1所示(編碼氨基酸序列如569 10^).2所示）、569 10^.3(編碼氨基酸序列如569 ID NO.4所示)和SEQ ID NO.5所示(編碼氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示）的TALE編碼序列， 沈Q ID NO.7、SEQ ID NO.8和沈Q ID NO.9所示的DNA支架序列。
[0030] 本發(fā)明在大腸桿菌中將TALE-DNA支架系統(tǒng)應(yīng)用于二酶反應(yīng)體系，設(shè)計了兩種不同 的DNA結(jié)合基序W及對應(yīng)的TALE結(jié)合蛋白。結(jié)合序列選自斑馬魚CD154基因，W防與微生物 工程菌基因組同源。由于TALE目前應(yīng)用于基因編輯領(lǐng)域時，通常設(shè)計為14~20個重復(fù)單元， 使之識別14~20bp的特定DNA序列，過短則可能導(dǎo)致識別特異性下降，過長則可能影響 TALE在細(xì)胞內(nèi)的正常裝配。本發(fā)明使用的TALE模塊和識別堿基對數(shù)限定于14~20bp，由于 對特異性要求相對基因編輯技術(shù)應(yīng)用時較低，因此選擇14bp作測試。
[0031] 本發(fā)明根據(jù)TALE與DNA的結(jié)合原理，W及細(xì)胞內(nèi)典型B型DNA的空間構(gòu)象，設(shè)計并優(yōu) 化了二酶代謝通路支架系統(tǒng)相鄰DNA結(jié)合基序的間距W及朝向，從而保證酶系中相鄰酶的 有序、緊密排列（參見圖1)。本發(fā)明認(rèn)為，對于相鄰的TALE-酶融合蛋白有頭頭相鄰(參見圖 1A)和頭尾相鄰(參見圖1B和1C)兩種方式，其中頭尾相鄰有利于降低空間位阻，且更適合于 更多酶系成員的擴(kuò)展。本發(fā)明同時利用頭頭相鄰和頭尾相鄰兩種方式驗證TALE的共區(qū)域化 效果(害螺GFP實驗），主要利用頭尾相鄰的方式驗證TALE系統(tǒng)的酶促代謝加速能力（IAA合 成實驗）。根據(jù)細(xì)胞內(nèi)典型的B型DNA空間結(jié)構(gòu)，即DNA沿中屯、軸每旋轉(zhuǎn)一周有l(wèi)Obp(即每lObp 一個螺距）。為保證頭尾相鄰的TALE蛋白末端連接的酶系在空間上朝向同側(cè)，從而進(jìn)一步限 定酶系的活動區(qū)域，TALE識別的DNA支架序列中，相鄰TALE識別序列之間的間隔序列需保證 間隔序列+識別序列總長度為lObp的整數(shù)倍（即1個螺距的整數(shù)倍）。由于本發(fā)明所使用的識 別堿基長度為14bp，因此間隔序列設(shè)計為6bp(相鄰酶間隔1個螺距)和16bp(相鄰酶間隔2個 螺距）。
[0032] 本發(fā)明還提供了將DNA支架W十次重復(fù)的方式直接整合在表達(dá)TALE-酶蛋白融合 基因的質(zhì)粒骨架上的方法，W增加酶在DNA支架上的結(jié)合量。
[0033] 本發(fā)明利用割裂GFP技術(shù)驗證TALE-DNA支架系統(tǒng)的對異源表達(dá)蛋白的共區(qū)域化能 力，利用植物生長素 IAA合成的二酶代謝通路驗證TALE-DNA支架系統(tǒng)提高異源代謝通路速 率的能力。
[0034] 本發(fā)明設(shè)及的酶為在微生物細(xì)胞內(nèi)能進(jìn)行異源表達(dá)和正確折疊的次生代謝酶類， 酶系需要兩個酶W上才能實現(xiàn)目的產(chǎn)物的合成。
【附圖說明】
[0035] 圖1二酶代謝通路支架系統(tǒng)的設(shè)計；（A)第一類支架用于盡可能拉近各酶之間的距 離，相鄰兩個結(jié)合基序間無插入序列；（B)第二類支架相鄰結(jié)合基序間插入化P間隔序列，用 于避免位阻現(xiàn)象并確保酶的空間定位；（C)第Ξ類支架相鄰結(jié)合基序間插入16bp間隔序列， 用于檢測不同長度插入序列的效應(yīng)；
[0036] 圖2本發(fā)明構(gòu)建的質(zhì)粒示意圖；（A)pSBlC3-Plac-RBS-TALEl-GFPl-Ter-Scaffoldl (pTl-GFPl-Sl)、pSBlC3-Plac-RBS-TALE2-GFP2-Ter-Scaffold2(pT2-GFP2-S2)及pSBlC3- P lac-RBS-TALE3-GFP2-Ter-Scaf f 01 d 1 (PT3-GFP2-S1)質(zhì)粒；（8)9581〔3斗1日。-1^5-了41^1- GFPl-TALE3-GFP2-Ter-Scaffoldl(pTl-Gl/T3-G2-Sl)^pSBlC3-Plac-RBS-TALEl-GFPl- TALE2-GFP2-Ter-Scaffold2(pTl-Gl/T2-G2-S2)^pSBlC3-Plac-RBS-TALEl-GFPl-TALE2- GFP2-Ter-Scaffold3(pTl-Gl/T2-G2-S3)、無 SI 支架的 pSBlC3-Plac-RBS-TALEl-GFPl- TALE3-GFP2-Ter(pTl-Gl/T3-G2)和無 S2/S3 支架的 pSBlC3-Plac-RBS-TALEl-GFPl-TALE2- Scaffold2(pTl-IAAM/T2-IAAH-S2)^pSBlC3-Plac-RBS-TALEl-IAAM-TALE2-IAAH-Ter- Scaffold3(pTl-IAAM/T2-IAAH-S3)和無 S2 或 S3 支架的 PT1-IAAM/T2-IAAH 質(zhì)粒；
[0037] 圖3驗證TALE-GFP融合蛋白與DNA支架的結(jié)合能力；（A)化IP-PCR實驗引物設(shè)計及 對應(yīng)PCR擴(kuò)增區(qū)域示意圖，P1/P2用于TALE1-GFP1的ChIP-PCR實驗，P3/P4用于TALE2-GFP2和 TALE3-GFP2的ChIP-PCR實驗；（B)大腸桿菌IPTG誘導(dǎo)表達(dá)和TALE-DNA結(jié)合溫度條件的優(yōu)化； (C)TALE1-GFP1，TALE2-GFP2和TALE3-GFP2結(jié)合到相應(yīng)支架上能力的檢測。I噸ut表明了試 樣中總的DNA量；
[003引圖4通過割裂GFP實驗驗證TALE-DNA支架系統(tǒng)對異源蛋白的共區(qū)域化效果；（A)割 裂GFP和TALE-DNA支架系統(tǒng)的整合方式及結(jié)合模式示意圖；（B)割裂GFP轉(zhuǎn)入大腸桿菌后，經(jīng) IPTG誘導(dǎo)（或未經(jīng)誘導(dǎo)）培養(yǎng)過夜測得的巧光強度（激發(fā)光波長：488nm;發(fā)射光波長： 538nm)，被ODsqq標(biāo)準(zhǔn)化后得到相對巧光強度值;將TALE1-GFP1/TALE3-GFP2對照組相關(guān)的巧 光強度設(shè)為1.0,其余組的巧光值按比例進(jìn)行計算;實驗中，Ξ組平行反應(yīng)同時進(jìn)行，數(shù)據(jù)由 至少Ξ組獨立實驗獲得；圖中**代表p<0.01; (C)RT-PCR檢測GFP巧日GFP2在不同TALE-GFP支 架組中的表達(dá)情況;大腸桿菌16S核糖體RNA的cDNA序列用作內(nèi)參；
[0039]圖5驗證TALE-DNA支架系統(tǒng)對提高IAA合成二酶代謝通路速率的能力；（A)IAA合成 通路示意圖；（B)IAAM和IAAH與TALE-DNA支架系統(tǒng)的整合方式及結(jié)合模式示意圖；（C)轉(zhuǎn)化 相應(yīng)質(zhì)粒的大腸桿菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)過夜后，通過夾屯、酶聯(lián)免疫分析法化LISA)檢測IAA產(chǎn)量。 經(jīng)顯色和終止反應(yīng)后，通過分光光度法測量樣品在450nm處的吸光度;樣品中IAA濃度標(biāo)準(zhǔn) 曲線算出；將TALE1-IAAM/TALE2-IAAH無支架對照組IAA濃度設(shè)為1.0，其余組濃度值按比例 進(jìn)行計算；實驗中，Ξ組平行反應(yīng)同時進(jìn)行，數(shù)據(jù)由至少Ξ組獨立實驗獲得；圖中**代表八 ο. ο 1. (D)RT-PCR檢ii IAAM和IAAH在不同TALE-IAA支架組表達(dá)情況;大腸桿菌16S核糖體RNA 的cDNA序列用作內(nèi)參；
[0040] 圖6 TALE-DNA支架系統(tǒng)提高多酶代謝通路速率的效果模擬;A組分析:盡管有無 TALE支架時反應(yīng)底物的消耗速率差別不大，但是TALE支架可W加速中間產(chǎn)物向最終產(chǎn)物的 轉(zhuǎn)化。顯然，支架系統(tǒng)有利于提高反應(yīng)速率;B組分析:本組TALE支架上的酶間距大于組1，但 是相似地，有無 TALE支架時反應(yīng)底物的消耗速率差別不大;TALE支架仍可W加速中間產(chǎn)物 向最終產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化，但是支架系統(tǒng)對反應(yīng)速率的提高效果有所下降；C組分析:本組TALE支 架上的酶間距進(jìn)一步增大;不同的是，支架系統(tǒng)對反應(yīng)速率的提高效果消失了;D組分析:當(dāng) 多酶反應(yīng)鏈加長時，有無 TALE支架時反應(yīng)底物的消耗速率仍然差別不大;但是，支架系統(tǒng)對 反應(yīng)速率的提高效果進(jìn)一步加強；
[0041] 圖7 TALE-DNA支架系統(tǒng)中酶不同間距（代謝反應(yīng)鏈長度相同）對代謝速率提高的 影響模擬。
【具體實施方式】
[0042] 實施例1 TALE-DNA支架系統(tǒng)原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建方法
[0043] 利用Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit 2.0構(gòu)建TALE表達(dá)序列，利用 DM合成的方法合成DNA支架序列。利用限制性內(nèi)切酶Spe 1和Xba 1同尾酶的性質(zhì)，在pSB 1C3 質(zhì)粒上設(shè)計EcoRl、Xbal、Spel和Pstl的多克隆位點系統(tǒng)，基于標(biāo)準(zhǔn)的分子克隆方法根據(jù)對 應(yīng)質(zhì)粒構(gòu)建需要插入Plac啟動子、核糖體結(jié)合位點(RBS)、TALE、割裂GFP、色氨酸單加氧酶 (IAAM)、嗎I噪乙酷胺水解酶（IAAH)、終止子(Ter)或DNA支架序列（Scaffold)等核酸元件。具 體構(gòu)建如下質(zhì)粒：構(gòu)建pSBlC3-Plac-RBS-TALEl-GFPl-Ter-Scaffoldl(pTl-GFPl-Sl)、 pSBlC3-Plac-RBS-TALE2-GFP2-Ter-Scaffold2(pT2-GFP2-S2) W及9581〔3斗1日(3-1?85- TALE3-GFP2-Ter-Scaffoldl(pT3-GFP2-Sl)質(zhì)粒用于檢測 TALE-GFP 融合蛋白與 DNA 支架的 結(jié)合能力（參見圖 2A)。構(gòu)建 pSBlC3-Plac-RBS-TALEl-GFPl-TALE3-GFP2-Ter-Scaffoldl (pTl-Gl/T3-G2-Sl)^pSBlC3-Plac-RBS-TALEl-GFPl-TALE2-GFP2-Ter-Scaffold2(pTl-Gl/ T2-G2-S2)^pSBlC3-Plac-RBS-TALEl-GFPl-TALE2-GFP2-Ter-Scaffold3(pTl-Gl/T2-G2- S3)用于驗證TALE-DNA支架系統(tǒng)對異源蛋白的共區(qū)域化效果，無 S1支架的pSB 1C3-P1 ac- RBS-TALEl-GFPl-TALE3-GFP2-Ter(pTl-Gl/T3-G2)和無 S2/S3 支架的 pSBlC3-Plac-RBS- TALEl-GFPl-TALE2-GFP2-Ter(pTl-Gl/T2-G2)質(zhì)粒用于設(shè)置無支架對照組（參見圖2B)。構(gòu) 建pSBlC3-Plac-RBS-TALEl-IAAM-TALE2-IAAH-Ter-Scaffold2(pTl-IAAM/T2-IAAH-S2)和 pSBlC3-Plac-RBS-TALEl-IAAM-TALE2-IAAH-Ter-Scaffold3 (PT1-IAAM/T2-IAAH-S3)用于 驗證TALE-DNA支架系統(tǒng)對提高二酶代謝通路速率的能力。無 S2或S3支架的PT1-IAAM/T2- IAAH質(zhì)粒用于設(shè)置無支架對照組(參見圖2C)。
[0044] 實施例2驗證本發(fā)明提供的TALE-GFP融合蛋白與DNA支架的結(jié)合能力
[0045] 利用化IP-PCR檢驗TALE與異源表達(dá)蛋白（GFP1/2)融合蛋白是否有效結(jié)合到質(zhì)粒 DNA支架。首先將構(gòu)建的pSBlC3-l、pSBlC3-2W及PSB1C3-3質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌化21 (DE3)菌株感受態(tài)，篩選陽性克隆，接種于5mL含氨節(jié)青霉素（5化g/ml)的LB液體培養(yǎng)基中， 置37 °C搖床，W 25化pm轉(zhuǎn)速培養(yǎng)5小時，再將培養(yǎng)物W1:100比例加入含氨節(jié)青霉素（5化g/ ml)的LB液體培養(yǎng)基，置37°C搖床，W25化pm轉(zhuǎn)速繼續(xù)培養(yǎng)。測定細(xì)菌生長曲線，待OD600至 0.6~1.0時，加入IPTG，使終濃度為ImM，然后轉(zhuǎn)入20°C、25°C或30°C培養(yǎng)箱，200巧m過夜。細(xì) 菌經(jīng)溶菌酶和裂解液裂解后，根據(jù)碧云天提供的操作手冊進(jìn)行化IP實驗。因結(jié)合質(zhì)粒片段 較小，細(xì)菌裂解產(chǎn)物未經(jīng)超聲波處理而直接使用1 %的甲醒，并與GFP多克隆抗體進(jìn)行免疫 共沉淀反應(yīng)。產(chǎn)物利用上游引物P1 (ATGCGTAAAGGAGAAGA) (SEQ ID NO. 18)和下游引物P2 (TTATTGTTTGTCTGCCA) ( SEQ ID NO . 1 9 )擴(kuò)增 GFP 1 片段；矛。用上游弓| 物 P 3 ^.21)擴(kuò)增6。?2片段，片段大小分別為47化9和25化9(參見圖34)。優(yōu)化的？0?條件為:941： 預(yù)變性 4min;94°C 變性 40s，55°C 退火 lmin，72°C 延伸 3〇3,30個循環(huán)；72°(：延伸1〇111111。？〔尺產(chǎn) 物用1.2 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
[0046] 為了優(yōu)化大腸桿菌IPTG誘導(dǎo)表達(dá)和TALE-DNA結(jié)合的溫度條件，本發(fā)明選用轉(zhuǎn)化有 pTl-GFPl-Sl質(zhì)粒的大腸桿菌進(jìn)行不同IPTG誘導(dǎo)溫度下TALE-GFP與DNA支架結(jié)合實驗。結(jié)果 顯示20°C、25°C、30°C都適合TALE-GFP融合蛋白的表達(dá)及與相應(yīng)DNA支架的結(jié)合，且25°C誘 導(dǎo)溫度組化IP-PCR擴(kuò)增信號最強（參見圖3B)。繼續(xù)選擇25°C的誘導(dǎo)溫度用于后續(xù)實驗，如 圖3C所示，pTl-GFPl-Sl組、PT2-GFP2-S2組和PT3-GFP2-S1組ChIP-PCR均擴(kuò)增出明顯的目的 條帶，而無關(guān)IgG同型對照組或分離珠對照組均無相應(yīng)條帶。該結(jié)果表明轉(zhuǎn)化有pTl-GFPl- Sl、pT2-GFP2-S2 或 PT3-GFP2-S1 質(zhì)粒的大腸桿菌，其細(xì)胞內(nèi) TALE1-GFP1、TALE2-GFP2 和 TALE3-GFP2均能與對應(yīng)的DNA支架結(jié)合。
[0047] 實施例3驗證本發(fā)明提供的TALE-DNA支架系統(tǒng)對異源蛋白的共區(qū)域化效果
[0048] 利用割裂GFP實驗驗證本發(fā)明提供的TALE-DNA支架系統(tǒng)對異源蛋白的共區(qū)域化效 果。將pTl-Gl/T3-G2-Sl、pTl-Gl/T2-G2-S2、pTl-Gl/T2-G2-S3、pTl-Gl/T3-G2、pTl-Gl/T2- G2五組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌化21 (DE3)菌株感受態(tài)，陽性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后用ImM IPTG于 25°C誘導(dǎo)過夜。未添加 IPTG組作為未誘導(dǎo)的對照組。隨后收集細(xì)菌樣品，用巧光酶標(biāo)儀 Fluoroskan Ascent FlXThermo Scientific公司）測量各組的0〇6日日和巧光強度FI(激發(fā)光 波長：488nm;發(fā)射光波長：538nm)。如圖4B所示，PT1-G1/T3-G2-S1組FI/OD600值顯著高于無 支架 PT1-G1/T3-G2 對照組；PT1-G1/T2-G2-S2 和 PT1-G1/T2-G2-S3 組 FI/ODsoo值顯著高于無 支架PT1-G1/T2-G2對照組。RT-PCR結(jié)果顯示W(wǎng)上含支架組和不含支架組割裂GFP的表達(dá)量 是無顯著差異的，因此綠色巧光的增強是TALE-DNA支架系統(tǒng)對割裂GFP共區(qū)域化的結(jié)果，而 不歸因于割裂GFP的表達(dá)量差異（參見圖4C)。運些結(jié)果表明證本發(fā)明提供的TALE-DNA支架 系統(tǒng)是一個可W實現(xiàn)TALE融合蛋白共區(qū)域化和有序化的有效裝置。
[0049] 實施例4驗證本發(fā)明提供的TALE-DNA支架系統(tǒng)對提高二酶代謝通路速率的能力
[0050] 為了研究不同TALE-DNA支架系統(tǒng)在代謝通路中的作用，本發(fā)明選用植物生長素嗎I 噪乙酸IAA的二酶體系合成通路進(jìn)行驗證。將pTl-IAAM/T2-IAAH-S2、pTl-IAAM/T2-IAAH- S3、pTl-IAAM/T2-IAAHΞ 組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL2UDE3) 菌株感受態(tài) ，陽性克隆擴(kuò)大培 養(yǎng)后用ImM IPTG于25°C誘導(dǎo)過夜。未添加 IPTG組作為未誘導(dǎo)的對照組。隨后收集細(xì)菌樣品， 根據(jù)酶聯(lián)生物公司提供的試劑盒W及方法進(jìn)行夾屯、法酶聯(lián)免疫分析。結(jié)果顯示含支架的 PT1-IAAM/T2-IAAH-S2和PT1-IAAM/T2-IAAH-S3組IAA的產(chǎn)量顯著高于無支架對照組，其中 PT1-IAAM/T2-IAAH-S2組較無支架組單位時間內(nèi)產(chǎn)量提高3.2倍，PT1-IAAM/T2-IAAH-S3組 無支架組單位時間內(nèi)產(chǎn)量提高2.5倍(參見圖5B)。RT-PCR結(jié)果顯示W(wǎng)上含支架組和不含支 架組IAAM和IAAH的表達(dá)量是無顯著差異的，因此IAA生產(chǎn)速率的增強是TALE-DNA支架系統(tǒng) 對ΙΑΑΜ和ΙΑΑΗ共區(qū)域化的結(jié)果，而不歸因于表達(dá)量差異(參見圖5C)。^上結(jié)果證明了本發(fā) 明提供的TALE-DNA支架系統(tǒng)可W顯著提高二酶代謝通路的代謝速率。此外，隨著相鄰酶在 DNA支架上的間距增加，代謝速率提高的程度降低。
[0051] 實施例5利用數(shù)學(xué)模型驗證本發(fā)明提供的TALE-DNA支架系統(tǒng)可W提高細(xì)胞內(nèi)多 酶代謝通路的反應(yīng)效率
[0052] 利用MATLAB將隨機模擬方法用于計算和評估有TALE支架和無 TALE支架的反應(yīng)系 統(tǒng)，W概率分布的形式求解兩類系統(tǒng)的性能參數(shù)。模型運算的參數(shù)設(shè)置如圖6所示。模型忽 略不與多酶促反應(yīng)直接相關(guān)的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，只考慮細(xì)胞、反應(yīng)物、支架和酶(包括游離和固定 的酶)的行為，在TALE-DNA支架體系中，酶固定在支架上。模擬在二維平面上進(jìn)行，因此用圓 形來描述細(xì)胞、反應(yīng)物、支架和酶用直線段來描述支架(參見圖7)。該模型在計算時采用時 間驅(qū)動的方式，假設(shè)在相同的足夠小時間間隔內(nèi)，給出分子的運動方向和速度大小V便可 確定其下一個狀態(tài)的位置，其中假設(shè)運動方向和速度大小V滿足均勻分布。此外，對于相互 作用的假設(shè)是所有分子只能在細(xì)胞內(nèi)運動，且忽略分子間的非接觸力。模擬過程中，反應(yīng)底 物和中間產(chǎn)物均可與酶及支架發(fā)生重疊，運在一定程度上模擬了酶與反應(yīng)物結(jié)合的行為。 假設(shè)只要反應(yīng)物與酶滿足特異性條件，則兩者的碰撞(重疊）均是有效的，且反應(yīng)可W在碰 撞的瞬間完成。
[0053] 模擬實驗顯示，由于支架對酶的共聚作用，比起無支架系統(tǒng)，支架系統(tǒng)傾向于花費 更少的時間來完成中間產(chǎn)物進(jìn)一步與其對應(yīng)酶的碰撞過程。因此支架系統(tǒng)可W提高多酶促 反應(yīng)的效率。然而，支架上的酶間距的擴(kuò)大使得支架對酶的共聚效果漸漸不明顯，導(dǎo)致其加 速效果逐漸消失。因此該模型的結(jié)果證明TALE-DNA支架系統(tǒng)可W提高多酶代謝通路的代謝 效率，且隨著對酶促反應(yīng)鏈的加長，支架系統(tǒng)對速率的提高效果加強。然而，隨著支架上酶 的間距擴(kuò)大，支架對于代謝效率的提高效果減弱。
【主權(quán)項】
1. 一種細(xì)胞內(nèi)支架結(jié)構(gòu)，其特征在于，所述支架結(jié)構(gòu)包括構(gòu)建在質(zhì)粒載體上的DNA支架 序列和TALE-酶融合蛋白編碼序列。2. 如權(quán)利要求1所述的支架結(jié)構(gòu)，其特征在于，所述兩段相鄰的TALE-酶融合蛋白結(jié)合 序列之間無間隔序列。3. 如權(quán)利要求1所述的支架結(jié)構(gòu)，其特征在于，所述兩段相鄰的TALE-酶融合蛋白結(jié)合 序列之間有6bp的間隔序列。4. 如權(quán)利要求1所述的支架結(jié)構(gòu)，其特征在于，所述兩段相鄰的TALE-酶融合蛋白結(jié)合 序列之間有16bp的間隔序列。5. 如權(quán)利要求1至4任一項所述的支架結(jié)構(gòu)，其特征在于，所述DNA支架序列如SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8或SEQ ID NO. 9所示；所述TALE-酶融合蛋白編碼序列如SEQ ID NO. 1、 SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5所示。6. -種TALE-酶融合蛋白編碼序列，其特征在于，所述TALE-酶融合蛋白編碼序列中， TALE蛋白編碼序列的3 '端通過ACTAGA與酶編碼序列的5 '端融合。7. 如權(quán)利要求6所述的TALE-酶融合蛋白編碼序列，其特征在于，所述TALE-酶融合蛋白 編碼序列如SEQIDN0.1、SEQIDN0.3或SEQIDN0.5所示。8. -種pSBlC3改造質(zhì)粒，其特征在于，所述pSBlC3改造質(zhì)粒中含有權(quán)利要求6所述的支 架結(jié)構(gòu)。9. 如權(quán)利要求7所述質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟： (1) 在TALE1序列下游插入GFP1或IAAM編碼片段，在TALE2序列、TALE3序列下游插入 GFP2 或 IAAH 片段，構(gòu)成 TALE1-GFP1、TALE1-IAAM、TALE2-GFP2、TALE2-IAAH、TALE3-GFP2、 TALE3-IAAH片段；同時在Plac下游插入RBS片段，構(gòu)成Plac-RBS片段所述TALE1序列即為SEQ ID NO. 1所示序列；所述TALE2序列即為SEQ ID NO.3所示序列；所述TALE3序列即為SEQ ID NO. 5所示序列； (2) 在TALE1-GFP1、TALE2-GFP2、TALE2-IAAH、TALE3-GFP2、TALE3-IAAH 下游插入 ter 片 段，構(gòu)成 TALEl-GFPl-terJALES-GFPS-terJALES-IAAH-terJALES-GFPS-terJALES-iAAH-ter 片段； (3) 在TALE1-GFP1、TALE1-1AAM、TALE1-GFP1-ter、TALE2-GFP2-1er、TALE3-GFP2-1er上 游插入 Plac-RBS 片段 TALEl-GFPl-ter、Plac-RBS-TALE2-GFP2-ter、Plac-RBS-TALE3-GFP2-ter 片段； (4) 在Plac-RBS-TALEl-GFPl下游插入RBS序列，隨后在所得片段下游插入TALE2-GFP2-ter 或 TALE3-GFP2-ter 片段，構(gòu)建至 pSBlC3 質(zhì)粒骨架中得到 pTl-Gl/T2-G2、pTl-Gl/T3-G2 質(zhì) 粒，再酶切得到 Plac-RBS-TALEl-GFPl-RBS-TALE2-GFP2-ter、Plac-RBS-TALEl-GFPl-RBS-TALE3-GFP2-ter片段;在Plac-RBS-TALEl-IAAM下游插入RBS序列隨后在所得片段下游插入 TALE2-IAAH-ter片段，構(gòu)建至pSBlC3質(zhì)粒骨架中得到ρΤ1-ΙΑΑΜ/Τ2-ΙΑΑΗ質(zhì)粒，再酶切得到 Plac-RBS-TALEl-IAAM-RBS-TALE2-IAAH-ter 片段； (5) 在Scaffoldl上游分別插入 Plac-RBS-TALEl-GFPl-ter、Plac-RBS-TALE3-GFP2-ter、Plac-RBS-TALEl-GFPl-RBS-TALE3-GFP2-ter片段，構(gòu)建至pSBlC3質(zhì)粒骨架中得到pTl-GFP1-S1、pT3-GFP2-Sl、pTl-Gl/T3-G2-Sl 質(zhì)粒； (6) 在 Scaffold2 上游分別插入 Plac-RBS-TALE2-GFP2-ter、Plac-RBS-TALEl-GFPl- RBS-TALE2-GFP2-ter、Plac-RBS-TALEl-IAAM-RBS-TALE2-IAAH-ter 片段，構(gòu)建至 pSBlC3 質(zhì) 粒骨架中得到 pT2-GFP2-S2、pTl-Gl/T2-G2-S2、pTl-IAAM/T2-IAAH-S2 質(zhì)粒； (7)在Scaffold3 上游分別插入 Plac-RBS-TALE2-GFP2-ter、Plac-RBS-TALEl-GFPl-RBS-TALE2-GFP2-ter、Plac-RBS-TALEl-IAAM-RBS-TALE2-IAAH-ter片段，構(gòu)建至pSBlC3質(zhì) 粒骨架中得到 pTl-Gl/T2-G2-S3、pTl-IAAM/T2-IAAH-S3 質(zhì)粒； 所述 pH-GFPl-Sl、pT3-GFP2-Sl、pH-Gl/T3-G2-Sl、pT2-GFP2-S2、pIl-Gl/T2-G2-S2、 pTl-IAAM/T2-IAAH-S2、pTl-Gl/T2-G2-S3、pTl-IAAM/T2-IAAH-S3 質(zhì)粒即為 pSBlC3 改造質(zhì) S;pn-GFPl-Sl、pT3-GFP2-Sl、pH-Gl/T3-G2-Sl、pT2-GFP2-S2、pTl-Gl/T2-G2-S2、pTl-IAAM/T2-IAAH-S2、pTl-Gl/T2-G2-S3、pTl-IAAM/T2-IAAH-S3質(zhì)粒序列依次如SEQ ID NO. 10 至SEQ ID NO. 17所示。
【文檔編號】C12N15/55GK106011160SQ201610380526
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年6月1日
【發(fā)明人】朱律韻, 朱凌云, 邱鑫源, 吳小敏, 章媛, 范冬雨, 朱楚姝, 張東裔
【申請人】中國人民解放軍國防科學(xué)技術(shù)大學(xué)