薺菜過氧化物酶基因及其在改良經(jīng)濟(jì)植物抗寒性中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明屬于植物分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種薺菜過氧化物酶基因及其在改良經(jīng)濟(jì)植物抗寒性中的應(yīng)用。本發(fā)明薺菜過氧化物酶功能基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，該核酸序列編碼一個(gè)受低溫誘導(dǎo)表達(dá)，在正常溫度下低表達(dá)，表達(dá)后通過調(diào)節(jié)植物細(xì)胞中的活性氧，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞產(chǎn)生低溫誘導(dǎo)相關(guān)基因，最終提高植物的抗寒力。利用該基因片段構(gòu)建的過表達(dá)載體可以在植物中過量表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控抗冷基因表達(dá)，保護(hù)植物細(xì)胞免受低溫傷害。本發(fā)明還提供了基于上述基因培育抗寒植物的應(yīng)用方法，用于有經(jīng)濟(jì)價(jià)值農(nóng)作物品種的改良。
【專利說明】
莽菜過氧化物酶基因及其在改良經(jīng)濟(jì)植物抗寒性中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于植物分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種莽菜過氧化物酶基因，其制 備方法，該基因的重組質(zhì)粒，W及將其應(yīng)用于植物逆境調(diào)控特別是用于經(jīng)濟(jì)植物抗寒基因 的遺傳轉(zhuǎn)化，W提高植物抗寒性。
【背景技術(shù)】
[0002] 溫度是植物生長過程中不可缺少的一種環(huán)境條件，植物作為固定生長的一種生 物，不能通過行走移動(dòng)躲避不良環(huán)境，更加受到環(huán)境因素的制約。低溫凍害是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中嚴(yán) 重的自然災(zāi)害，不僅會(huì)限制農(nóng)作物的栽種范圍，也會(huì)造成農(nóng)作物減產(chǎn)，每年引起的農(nóng)作物的 損失巨大，所W有關(guān)植物抗寒性的研究，改造農(nóng)作物的遺傳特性，使之從凍害中解脫出來， 一直都是農(nóng)業(yè)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一，也是科學(xué)工作者的理想與追求。隨著生物技術(shù)的發(fā)展 和廣泛應(yīng)用，對(duì)抗寒分子機(jī)理的認(rèn)識(shí)不斷加深，采用現(xiàn)代生物技術(shù)培育抗寒新品種已成為 主要手段之一。
[0003] 利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，人們已從各種植物中克隆出眾多參與植株耐低溫能力 形成的基因，運(yùn)些基因均是植物在低溫環(huán)境下誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種特異基因，稱為冷調(diào)芐基因 或冷馴化基因，它們所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)能夠保護(hù)植物免受低溫傷害，因此研究低溫誘導(dǎo)基因 的作用并將其應(yīng)用于農(nóng)作物改良有著重要的意義。近幾年在模式植物擬南芥的研究中發(fā)現(xiàn) 一類低豐度的低溫誘導(dǎo)基因，稱為RCKRare Cold Inducible)基因。擬南芥的RCI基因共分 為四類，其中第Ξ類為RCI3基因，該基因編碼產(chǎn)物為一種陽離子過氧化物酶化lorente F，L opez-Cobollo RM, Catala R, Martinez-Zapater JM, Salinas J. A novel cold- inducible gene from Arabidopsis, RCI3, encodes a peroxidase that constitutes a component for stress tolerance. Plant J.2002,32(1) :13-24),在植物中的作用為 在低溫脅迫下可增強(qiáng)植物細(xì)胞中活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)的解毒功能從 而提高植物的抗寒性（Kim MJ, Ciani S, Schachtman DP. A peroxidase contributes to ROS production during Arabidopsis root response to potassium deficiency. Mol. Plant. 2010，3(2):420-427)。大量的研究表明當(dāng)植物的外在條件發(fā)生急劇變化時(shí)， 如在低溫脅迫過程中，體內(nèi)對(duì)化的利用能力降低，多余的化則在代謝過程中被轉(zhuǎn)化成R0S，過 多的R0S積累會(huì)對(duì)植物細(xì)胞造成損傷，植物中存在一種抗氧化防御機(jī)制來消除R0S的不利作 用。同時(shí)R0S也是重要的信號(hào)調(diào)節(jié)分子，參與調(diào)控植物的生長發(fā)育W及各種脅迫反應(yīng)。目前 的研究發(fā)現(xiàn)植物中R0S的產(chǎn)生會(huì)影響多種基因的表達(dá)，說明植物細(xì)胞在進(jìn)化的過程中已經(jīng) 獲得了利用R0S作為信號(hào)分子的機(jī)制。R0S做為信號(hào)分子能夠選擇性地作用于一個(gè)能夠感知 R0S的目標(biāo)蛋白，然后將運(yùn)種信號(hào)傳遞下去從而調(diào)節(jié)某些基因表達(dá)的變化。在植物細(xì)胞中， R0S調(diào)控的結(jié)果有正面的，也有負(fù)面的，R0S的運(yùn)種雙面調(diào)控作用已在各種非生物脅迫中得 到證實(shí)，因此，對(duì)R0S產(chǎn)生及清除機(jī)制中各種組分的功能研究將有助于更好的控制細(xì)胞中 R0S的濃度。植物細(xì)胞中R0S的水平的調(diào)控對(duì)于提高作物的抗逆性具有良好的應(yīng)用前景。
[0004] 莽菜（C 7 a bt/rsa-pastoris)是一種1或2年野生的草本植物，平鋪地面， 喜陰，在南方是處處可見的一種可食用蔬菜，屬于十字花科（Cruciferae)、莽菜屬 (化psella)，在低溫條件下例如早春和秋冬季節(jié)能夠正常生長發(fā)育并開花結(jié)實(shí)。本發(fā)明所 設(shè)及的莽菜過氧化物酶基因是從莽菜葉片的基因組的DNA中克隆得到的。目前尚未發(fā)現(xiàn)有 關(guān)莽菜過氧化物酶基因在培育耐寒植物中的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的第一目的就是提供一種新的莽菜過氧化物酶基因，該基因是從莽菜的基 因組中克隆得到的，是植物在冷誘導(dǎo)和冷馴化下產(chǎn)生的高表達(dá)的蛋白質(zhì)。
[0006] 本發(fā)明的第二目的是提供一種新的莽菜過氧化物酶。
[0007] 本發(fā)明的第Ξ目的是提供所述莽菜過氧化物酶及其基因序列在利用轉(zhuǎn)基因技術(shù) 改良植物抗逆(耐低溫)上的應(yīng)用。
[0008] 在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種分離出的DNA分子，即一種新的莽菜過氧化物 酶基因，該基因是從莽菜的基因組中克隆得到。該莽菜過氧化物酶基因，選自： (1) 其核巧酸序列如SEQ ID No. 1中第20-1532位堿基所示； (2) 其核巧酸序列與沈Q ID No. 1中從核巧酸第20-232;337-525;615-777; 1116-1532 位DNA分子的核巧酸序列有至少70%同源性、且編碼相同功能蛋白質(zhì);或者 (3) 其核巧酸序列在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID No. 1中從核巧酸第20-1532位的核巧酸 序列雜交、且編碼相同功能蛋白質(zhì)。
[0009] 在本發(fā)明的另一方面，還提供一種重組質(zhì)粒，其包含上述莽菜過氧化物酶基因。
[0010] 在本發(fā)明的另一方面，還提供一種莽菜過氧化物酶，其包括:具有SEQ ID No.2氨 基酸序列的多膚、或其保守性變異多膚、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，所述莽菜 過氧化物酶為SEQ ID No.2序列的多膚。
[0011] 在本發(fā)明的另一方面中，還提供了用于制備上述莽菜過氧化物酶基因的方法，所 述方法包括W下步驟： (1) 將莽菜種子經(jīng)過70%酒精消毒后，播種于MS培養(yǎng)基上； (2) 待所述莽菜種子長出葉片后，提取所述葉片的基因組DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳分 析其質(zhì)量；W及 (3) 采用基因組步移技術(shù)克隆得到莽菜過氧化物酶基因基因組全長序列，其中，使用的 上游引物為CbRCIFl: 5-ATGAACTGCTTGAGAGCTATTGCCC-3(記為沈Q ID No . 3)，下游引物為 CbRCIR:5-TTAACTATTTGCAACGGAACATTGCCT-3(記為沈Q ID No.4)。
[0012] 在本發(fā)明的另一方面中，還提供了用于制備上述重組質(zhì)粒的方法，所述方法包括 W下步驟： (1) 設(shè)計(jì)引物對(duì)，擴(kuò)增出上述莽菜過氧化物酶基因的完整DNA片段，所述引物對(duì)的上游 引物為CbRCIFl:5-ATGAACTGCTTGAGAGCTATTGCCC-3(SEQIDNo.3)，所述下游引物為 CbRCIR:5-TTAACTATTTGCAACGGAACATTGCCT-3(沈Q ID No.4);W及 (2) 將所述完整DNA片段克隆到中間載體pMDlS-T，再進(jìn)一步克隆到植物表達(dá)載體pl304 上，得到上述重組質(zhì)粒。
[OOU]在步驟（1)中，向所述上游引物引入限制性酶切位點(diǎn)W col，W及向所述下游引物 引入限制性酶切位點(diǎn)公S祀II。
[0014] 在本發(fā)明的另一方面中，還提供了上述莽菜過氧化物酶基因或上述重組質(zhì)粒在植 物抗寒性和耐寒性中的應(yīng)用。較佳地，所述植物為具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的作物，更佳地包括水稻、 小麥、玉米、棉花、油菜、番茄和黃瓜。
[0015] 在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種用上述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。在實(shí)例中該宿 主細(xì)胞是擬南芥、煙草和其它植物細(xì)胞等。
[0016] 在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種產(chǎn)生具有莽菜過氧化物酶活性的多膚的方 法，其步驟如下： (1) 將編碼具有莽菜過氧化物酶活性多膚的純化的核巧酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控 序列，形成莽菜過氧化物酶基因表達(dá)載體，所述的核巧酸序列與SEQ ID No.1中從核巧酸 第20-1532位的核巧酸序列有至少70 %的同源性； (2) 將步驟(1)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入原核宿主細(xì)胞，形成莽菜過氧化物酶的重組細(xì)胞； (3) 在適合表達(dá)莽菜過氧化物酶多膚的條件下，培養(yǎng)步驟(2)中的重組細(xì)胞； (4) 分離出具有莽菜過氧化物酶活性的基本純的多膚。
[0017] 較佳地，在該方法中使用的核酸序列為SEQ ID No. 1中第20-1532位的序列。
[0018] 在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將編碼具有莽菜過氧化物酶 活性多膚的核巧酸序列轉(zhuǎn)化入植物W提高植物對(duì)低溫的耐受性的方法，其步驟如下： (1) 將編碼具有莽菜過氧化物酶活性多膚的純化的核巧酸序列可操作地連于植物表達(dá) 調(diào)控序列后，形成含莽菜過氧化物酶基因的植物表達(dá)載體，所述的核巧酸序列與SEQ ID No. 1中從核巧酸第20-1532位的核巧酸序列有至少70 %的同源性； (2) 將步驟(1)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，將含表達(dá)載體的農(nóng)桿菌同真核宿主細(xì)胞共培 養(yǎng)，在22-28°C條件下，暗培養(yǎng)l-2d后，通過篩選如抗生素篩選，獲得含有莽菜過氧化物酶 基因的轉(zhuǎn)化細(xì)胞并最終再生轉(zhuǎn)基因植株及其后代，包括植物種子及植物組織。含有莽菜過 氧化物酶基因的轉(zhuǎn)基因植株對(duì)植物干旱耐受特性具有增強(qiáng)的作用。
[0019] 較佳地，在該方法中使用的核巧酸序列為SEQ ID No. 1中第20-1532位的序列。
[0020] 本發(fā)明的另一個(gè)方面中，還提供了與莽菜過氧化物酶多膚特異性結(jié)合的抗體，它 包括多克隆抗體和單克隆抗體。
[0021] 在本發(fā)明中，"分離的"、"純化的"或"基本純的"DNA是指，該DNA或片段己從天然狀 態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來，還指該DNA.或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核巧酸的組 份分開，而且己經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開。
[0022] 在本發(fā)明中，術(shù)語"莽菜過氧化物酶(或多膚)基因序列"指包含有編碼莽菜過氧化 物酶活性多膚的核巧酸序列，如SEQ ID No . 1中第20-232;337-525 ;615-777; 1116-1532位 核巧酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQ ID No. 1序列的編碼框第20-1532位 核巧酸中，有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。 由于密碼子的簡并性，所W與沈Q ID No. 1中第20-232;337-525;615-777; 1116-1532位編 碼區(qū)內(nèi)的核巧酸序列同源性低至約70%的簡并序列也能編碼出SEQ ID No.2所述的序列。該 術(shù)語還包括能在中度嚴(yán)緊條件下，更佳的在高度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID No.1中從核巧酸第 20-1532位的核巧酸序列雜交的核巧酸序列。該術(shù)語還包括與SEQ ID No. 1中從核巧酸第 20-1532位的核巧酸序列的同源性至少70%，較佳地至少80%，更佳地至少90%，最佳地至少 95%的核巧酸序列。
[0023] 該術(shù)語還包括能編碼具有與天然的莽菜過氧化物酶相同功能的蛋白的SEQ ID No. 1中編碼區(qū)序列的變異形式。運(yùn)些變異形式包括(但并不限于）:若干個(gè)(通常為1-90個(gè)， 較佳地1-60個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))核巧酸的缺失、插入和/或取代，W及在5'和/ 或3'端添加數(shù)個(gè)(通常為60個(gè)W內(nèi)，較佳地為30個(gè)W內(nèi)，更佳地為10個(gè)W內(nèi)，最佳地為5個(gè)W 內(nèi)）核巧酸。
[0024] 在本發(fā)明中，"基本純的"蛋白質(zhì)或多膚是指其至少占樣品總物質(zhì)的至少20%，較佳 地至少50%，更佳地至少80%，最佳地至少90%(按干重或濕重計(jì)）。純度可W用任何合適的方 法進(jìn)行測(cè)量，如用柱層析、PAGE或HPLC法測(cè)量多膚的純度。基本純的多膚基本上不含天 然狀態(tài)下伴隨其的組分。
[0025] 在本發(fā)明中，術(shù)語"莽菜過氧化物酶或多膚"指具有莽菜過氧化物酶活性的SEQ ID No. 1序列的多膚。該術(shù)語還包括具有與天然莽菜過氧化物酶相同功能的SEQ ID No.2序列 的變異形式。運(yùn)些變異形式包括(但并不限于）:若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳 地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，W及在C末端和/或N末端添加一 個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)W內(nèi)，較佳地為10個(gè)W內(nèi)，更佳地為5個(gè)W內(nèi)）氨基酸。例如，在本領(lǐng)域 中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端 和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括莽菜過氧 化物酶的活性片段和活性衍生物。
[0026] 本發(fā)明的莽菜過氧化物酶多膚的變異形式包括:同源序列、保守性變異體、等位變 異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊條件下能與莽菜過氧化物酶DNA雜交的DNA 所編碼的蛋白、W及利用莽菜過氧化物酶多膚的血清獲得的多膚或蛋白。
[0027] 在本發(fā)明中，"莽菜過氧化物酶保守性變異多膚"指與SEQ ID No.1的氨基酸序列 相比，有至多10個(gè)，較佳地至多8個(gè)，更佳地至多5個(gè)氨基酸性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換 而形成多膚。運(yùn)些保守性變異多膚最好根據(jù)表1進(jìn)行替換而產(chǎn)生。
[0028] 發(fā)明還包括莽菜過氧化物酶或多膚的類似物。運(yùn)些類似物與天然冷誘導(dǎo)蛋白多膚 的差別可W是氨基酸序列上的差異，也可W是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而 有之。運(yùn)些多膚包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可W通過各種技術(shù)得到，如通過 福射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技 術(shù)。類似物還包括具有不同于天然k氨基酸的殘基（如D-氨基酸）的類似物，W及具有非天 然存在的或合成的氨基酸(如0、丫-氨基酸）的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多膚并不限于上述 列舉的代表性的多膚。
[0029] 修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括:體內(nèi)或體外的多膚的化學(xué)衍生形式如乙酷 化或簇基化。修飾還包括糖基化，如那些在多膚的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行 糖基化修飾而產(chǎn)生的多膚。運(yùn)種修飾可W通過將多膚暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物 的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有憐酸化氨基酸殘基（如憐酸酪氨 酸，憐酸絲氨酸，憐酸蘇氨酸）的序列。還包括被修飾從而提高了其蛋白水解性能或優(yōu)化了 溶解性能的多膚。
[0030] 在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體，包括質(zhì)粒，粘粒等。在 生產(chǎn)本發(fā)明的莽菜過氧化物酶多膚時(shí)，可W將莽菜過氧化物酶編碼序列可操作地連于表達(dá) 調(diào)控序列，從而形成莽菜過氧化物酶表達(dá)載體。
[0031] 表 1
如本發(fā)明所用，"可操作地連于"指運(yùn)樣一種狀況，即線性DM序列的某些部分能夠影響 同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號(hào)膚DNA作為前體表達(dá)并參與多膚的分泌， 那么信號(hào)膚(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多膚DNA;如果啟動(dòng)子控制序列的轉(zhuǎn)錄， 那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被置于能使其翻譯的位置時(shí)，那么 它是可操作地連于編碼序列。一般，"可操作地連于"意味著相鄰，而對(duì)于分泌前導(dǎo)序列則意 味著在閱讀框中相鄰。
[0032] 在本發(fā)明中，術(shù)語"宿主細(xì)胞"為真核細(xì)胞。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞、擬 南芥細(xì)胞、煙草細(xì)胞和其它植物細(xì)胞。
[0033] 還可用Nodhern印跡技術(shù)或巧光定量PCR技術(shù)分析莽菜過氧化物酶基因產(chǎn)物的表 達(dá)，即分析莽菜過氧化物酶的RNA轉(zhuǎn)錄物在細(xì)胞中的存在與否和數(shù)量。
[0034] 莽菜過氧化物酶基因的Nodhern印跡分析或巧光定量PCR分析和莽菜過氧化物酶 特異抗體的Western印跡分析可W聯(lián)合使用，W證實(shí)莽菜過氧化物酶在生物樣本中的表達(dá)。
[0035] 此外，本發(fā)明中可用作探針的核酸分子，該分子通常具有莽菜過氧化物酶核巧酸 編碼序列的8-100個(gè)連續(xù)核巧酸，較佳地具有15-50個(gè)連續(xù)核巧酸。該探針可用于檢測(cè)樣品 中是否存在編碼莽菜過氧化物酶的核酸分子。
[0036] 本發(fā)明設(shè)及檢測(cè)樣品中是否存在莽菜過氧化物酶核巧酸序列的方法，它包括用上 述的探針與樣品進(jìn)行雜交，然后檢測(cè)探針是否發(fā)生了結(jié)合。較佳地，該樣品是PCR擴(kuò)增后的 產(chǎn)物，其中PCR擴(kuò)增引物對(duì)應(yīng)于莽菜過氧化物酶核巧酸編碼序列，并可位于該編碼序列的兩 側(cè)或中間。引物長度一般為15-50個(gè)核巧酸。
[0037] 此外，根據(jù)本發(fā)明的莽菜過氧化物酶核巧酸序列和氨基酸序列，可W在核酸同源 性或表達(dá)蛋白質(zhì)的同源性基礎(chǔ)上，篩選莽菜過氧化物酶同源基因或同源蛋白。
[0038] 為了得到與莽菜過氧化物酶基因相關(guān)的莽菜cDNAs的點(diǎn)陣，可W用DNA探針篩選莽 菜基因組文庫，運(yùn)些探針是在低嚴(yán)緊條件下，用32P對(duì)莽菜過氧化物酶的全部或部分做放射 活性標(biāo)記而得的。最適合于篩選的DNA文庫是來自莽菜葉片的基因組文庫。構(gòu)建來自感興趣 的細(xì)胞或者組織的基因組文庫的方法是分子生物學(xué)領(lǐng)域眾所周知的。另外，許多運(yùn)樣的 cDNA文庫也可W購買到，例如購自Clontech，Stratagene，F(xiàn)*alo Alto,化1.。運(yùn)種篩選方法 可W識(shí)別與莽菜過氧化物酶基因家族同源的核巧酸序列。
[0039] 本發(fā)明的莽菜過氧化物酶基因全長序列或其片段通?？蒞用PCR擴(kuò)增法、重組法 或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核巧酸序列，尤其是 一些保守序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的基因組庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制 備的基因組庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR 擴(kuò)增，然后再將擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
[0040] -旦獲得了有關(guān)的序列，就可W用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。運(yùn)通常是將 其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
[0041] 此外，還可用人工化學(xué)合成的方法來合成有關(guān)序列。在本申請(qǐng)之前，現(xiàn)有技術(shù)已完 全可W通過先合成多個(gè)多核巧酸小片段，然后再進(jìn)行連接而獲得編碼本發(fā)明莽菜過氧化物 酶的核酸序列。然后，可將該核酸序列引入本領(lǐng)域中各種現(xiàn)有的DNA分子(如載體)和細(xì)胞 中。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
[0042] 除了用重組法產(chǎn)生之外，本發(fā)明蛋白的片段還可用固相技術(shù)，通過直接合成膚而 方口W生產(chǎn)（Guan X, Chaffey ΡΚ, Zen邑 C, Tan Z. New methods for chemical protein synthesis. Top Curr Chem. 2015, 363:155-92)。在體外合成蛋白質(zhì)可W用手工或自動(dòng) 進(jìn)行。例如，可W用Applied Biosystems的431A型膚合成儀（Foster City, CA)來自動(dòng)合 成膚?？蒞分別化學(xué)合成本發(fā)明蛋白的各片段，然后用化學(xué)方法加 W連接W產(chǎn)生全長的分 子。
[0043] 本發(fā)明的莽菜過氧化物酶可通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)來提高經(jīng)濟(jì)作物的抗寒能力，在全球 ±地日趨緊缺人口爆炸的情況下，本發(fā)明具有很大的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0044] 圖1為莽菜過氧化物酶與其他物種中的過氧化物酶蛋白家族成員的系統(tǒng)進(jìn)化樹分 析結(jié)果。
[0045] 圖2為冷馴化(A)，冷誘導(dǎo)(B)，各種激素 (C)和各種離子(D)處理?xiàng)l件下莽菜過氧化 物酶基因在莽菜葉、根、莖中的表達(dá)分析。
[0046] 圖3為轉(zhuǎn)莽菜過氧化物酶基因煙草抗性苗中潮霉素抗性基因 PCR鑒定結(jié)果。泳道1. DNA marker;2.野生型煙草;3，4空白對(duì)照;5.轉(zhuǎn)空載體煙草;6.農(nóng)桿菌陽性菌;7-13.轉(zhuǎn) 基因煙草抗性苗。
[0047] 圖4為轉(zhuǎn)莽菜過氧化物酶基因煙草陽性苗中目的基因 PCR鑒定結(jié)果。泳道1. DNA marker; 2-5轉(zhuǎn)基因煙草陽性苗。
[0048] 圖5為轉(zhuǎn)基因煙草陽性植株中莽菜過氧化物酶基因表達(dá)量測(cè)定(A)、冷脅迫下轉(zhuǎn)基 因煙草陽性植株的表型觀察(B)W及轉(zhuǎn)基因煙草苗植株的耐寒生理指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果(C)。
[0049] 圖6為轉(zhuǎn)基因煙草陽性植株內(nèi)活性氧的鑒定結(jié)果。
[0050] 圖7為轉(zhuǎn)基因煙草陽性植株中內(nèi)源冷誘導(dǎo)基因的表達(dá)量測(cè)定結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0051] 下面結(jié)合實(shí)驗(yàn)室具體的試驗(yàn)數(shù)據(jù)和結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。運(yùn)些實(shí) 施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn) 方法，通常按照常規(guī)條件中所述的條件(例如薩姆布魯克(著），黃培堂(主譯）.分子克隆驗(yàn) 指南（精編版），化學(xué)工業(yè)出版社，2008)或按照制造廠商所建議的條件。
[0052] 實(shí)施例1莽菜過氧化物酶基因的分離和鑒定 1.莽菜幼苗的培養(yǎng) 莽菜種子來源于上海市種子公司，莽菜種子經(jīng)過75%乙醇消毒處理后，播種于含有MSo 培養(yǎng)基上，置于26Γ下培養(yǎng)2w后將小苗移栽到±壤(賠石：黑±:珍珠巖=9:3:1)中繼續(xù)生 長，生長過程中光照周期為16h光照，化黑暗，濕度保持恒定適中。
[0化3] 2.莽菜葉片基因組DNA的提取和RNA的提取 取適當(dāng)大小的莽菜葉片，在液氮中研磨成粉，分別采用植物RNA提取試劑盒(CW0588) (北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）和CTAB法提取莽菜的總RNA和全基因組DNA。瓊脂糖凝膠 電泳分別檢測(cè)RNA和DNA的質(zhì)量。
[0054] 3.莽菜過氧化物酶基因編碼區(qū)核屯、序列的克隆 根據(jù)擬南芥（GenBank Accession No. :NP_172018.1)和甘藍(lán)（GenBank Accession N〇.:XP_013600777.1)中的過氧化物酶3(peroxidase 3)基因編碼區(qū)的保守序列，設(shè)計(jì)一對(duì) 引物CbRCIF2(5-CTGAAGGACCTTGTCTTACTCTCC-3(記為SEQ ID N0.5)和州3(：11?(5- TTAACTATTTGCAACGGAACATTGCCT-3(SEQ ID No.4))，利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得獲得編碼區(qū) 序列，擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到一條特異性很強(qiáng)的片段，長 度為25化P左右。回收該片段并連接到PMD-19T載體上，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化^ DH5a感受 態(tài)細(xì)胞，測(cè)序得到序列長度為267bp。用Blast分析發(fā)現(xiàn)，該片段的核巧酸序列與擬南芥(A 的RCI3A(ATU97648)的mRNA序列同源性為94%，與甘藍(lán)（公 rassica 〇如races)的 XM_013728218.1的mRNA序列的同源性為92%，證實(shí)該序列的正確性。
[0055] 4.莽菜過氧化物酶基因序列的克隆 分為Ξ個(gè)階段進(jìn)行： (1)中間序列的克隆使用步驟3合成引物，W基因組DNA序列為模板為，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 PCR反應(yīng)體系為：10XPCR Buffer SiiUMgCb (25mM) 10化；dNTP Mix (lOmM) ^LTaq DNA聚合酶（5UAiL) ^LPrimerl (10 μΜ) ^LPrimer2 (10 μΜ) 1化；0魁1 化；地2〇 26 化；總體積 50yL。使用程序?yàn)椋?4°C for 5 min，30 巧cles (94°C for 30 sec, 56°C for 30 sec, 72°C for 50 sec)。擴(kuò)增到的PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到一 條特異性很強(qiáng)的片段，長度為45化P左右?；厥赵撈尾⑦B接到PMD-18T載體上，將連接產(chǎn)物 轉(zhuǎn)化^ DH5a感受態(tài)細(xì)胞，測(cè)序得到序列長度為447bp。與步驟3序列比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn) 除了多出的一段內(nèi)含子序列外，其余序列與步驟3均相同，說明我們得到的序列為莽菜過氧 化物酶基因組中間序列； (2) 根據(jù)步驟(1)獲得的序列分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增中間序列上游的引物，其中兩個(gè)上游引物分 別記為CbRCI5-l(5-GAGATACACCGATAGTGTGAGCCCCGGA-3(記為沈Q ID 齡.6))和饑亂15-2 (5-TGTTTTGCGGCTCCCTGGATCCATCTCA-3(記為沈Q ID No . 7) )。W步驟2提取的莽菜基因組 DNA為模板，利用CI0NTECH公司提供的Universal GenomeWa化er Kit(Clontech)試劑盒中 的接頭引物API和AP2分別與上游基因特異引物組合進(jìn)行巢式擴(kuò)增，所得目的條帶即包含有 向中間序列的5'端外移了一定距離的序列。PCR的反應(yīng)體系和程序均按試劑盒的說明書進(jìn) 行。上游序列的擴(kuò)增經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到一條特異性很強(qiáng)的片段，長度為 1200bp左右?；厥辗謩e回收運(yùn)兩個(gè)片段并連接到PMD-19T載體上，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化^ D冊(cè)a感受態(tài)細(xì)胞，測(cè)序得到上游序列長度為1140bp; (3) 根據(jù)步驟(1)和(2)擴(kuò)增片段進(jìn)行序列拼接，然后根據(jù)拼接序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增全長引物， 引物序列分別為CbRCIF巧-AACCCCCACAACTTTAAAGATGAAC-3(記為沈Q ID No. 8))，所述下游 引物為CbRCIR(5-TTAACTATTTGCAACGGAACATTGCCT-3(SEQ ID No. 4))。W步驟2提取的莽菜 基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得全長序列。PCR反應(yīng)體系和程序與步驟（1)相同，擴(kuò)增到 的PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到一條特異性很強(qiáng)的片段，長度為1500bp左 右?；厥赵撈尾⑦B接到PMD-19T載體上，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化^ 0冊(cè)曰感受態(tài)細(xì)胞，測(cè)序 得到序列長度為1532bp。與步驟（1)和步驟(2)拼接的序列相同，說明我們獲得的序列為莽 菜過氧化物酶基因組完整序列。
[0056]實(shí)施例2莽菜過氧化物酶基因的生物信息學(xué)分析 1.基因結(jié)構(gòu)分析 將獲得的序列與莽菜過氧化物酶基因的CDS序列(AY566573)進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)莽菜基因 組序列包含3個(gè)內(nèi)含子，3個(gè)內(nèi)含子均包含gt-ag內(nèi)含子保守序列，除去內(nèi)含子，莽菜過氧化 物酶基因的CDS序列包含98 η bp。
[0化7] 2.同源性分析 使用ht1:p://www.ncbi .nlm.n;Lh. gov/blast網(wǎng)站通過Protein-Protein BLAST捜索與 及其它過氧化物酶蛋白家族成員包括擬南芥(兒tAaJiana)中的過氧化物酶(醒100405 and NP1 888 1 4 )，大豆（GJjci円e max)中的過氧化物酶（AAD11481)，杜仲 (怎 t/commiaWmoic/es)中的過氧化物酶(AAU04879)，渡菜（S /7inaciaoJeracea)中的過氧化 物酶（CAA76374)，水稻（化中的過氧化物酶（CAH69331 )，紫萍 (SjOiroc/eJajOoJ/TrAiza)中的過氧化物酶（CAA80502)，煙草（jV icoiianaia6act/m)中的過 氧化物酶（BAA07664)，玉米Uea majs)中的過氧化物酶(AAS75418)，油菜(公.ra仍）中的 BrC0R(ABF60663)的氨基酸序列通過 Protein-Protein BLAST分析（http : // www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)和VectorNTIvlO.O軟件分析，顯示出較高的同源性，其中 與擬南芥的過氧化物酶AtRCI3的同源度最高(一致性95%，相似性94%)。
[005引3.進(jìn)化樹分析 應(yīng)用Clus化1 X軟件，通過鄰位相連法，構(gòu)建CbRCI3與其他過氧化物酶家族成員的進(jìn)化 樹(圖1)。從蛋白序列比對(duì)結(jié)果和進(jìn)化關(guān)系上看，CbRCI3與AtRCI3最為接近。
[0059]實(shí)施例3莽菜過氧化物酶的表達(dá)特異性分析 1.莽菜植株的各種處理?xiàng)l件 (1)冷誘導(dǎo)處理：將22°C長日照條件下生長4w的莽菜幼苗，移至4°C分別處理4h，8h， 24h； (2) 冷馴化處理:將22 °C長日照條件下生長4w的莽菜幼苗，依次放入12 °C處理4d，4°C處 理4d，0°C處理化； (3) 激素處理:將在22°C長日照條件下生長4w的莽菜幼苗，分別經(jīng)浸泡在扣Μ GA，300μΜ MeJA，20yM ΙΑΑ,100μΜ ΑΒΑ水溶液處理化，6h，24h; (4) 離子溶液處理：將在22°C長日照條件下生長4w的莽菜，分別使用80mM KCl，50mM MgCl2,5mM ZnCl2,30mM LiCl，0.1mM CuCl2,80mM CaCb水溶液浸泡處理4h，8h，24h。
[0060] 2.莽菜葉、根、莖Ξ種組織的總RNA提取 采用植物RNA提取試劑盒(CW0588K北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）分別提取莽菜 根、莖、葉Ξ種組織的總RNA,步驟與實(shí)施例1(2)相同。
[0061 ] 3.巧光定量PCR分析 采用巧光定量PCR技術(shù)檢測(cè)各種處理?xiàng)l件下莽菜過氧化物酶基因表達(dá)量的變化，實(shí)驗(yàn) 設(shè)置Ξ組重復(fù)，W莽菜18s rRNA基因 （GenBank Accession No.:AY662285)為內(nèi)參。結(jié)果顯 示莽菜過氧化物酶基因的本底表達(dá)僅在根中有較低的表達(dá)，莖和葉中幾乎沒有表達(dá)。冷誘 導(dǎo)（圖2A)和冷馴化（圖2B)處理后均能大幅度提高莽菜過氧化物酶基因在各組織中的表達(dá) 量。不同激素處理對(duì)莽菜過氧化物酶的表達(dá)調(diào)控結(jié)果不同。ΑΒΑ能明顯增強(qiáng)莽菜過氧化物酶 基因的表達(dá)，并且隨著時(shí)間的增加，表達(dá)量會(huì)持續(xù)上升;MeJA可瞬時(shí)提高莽菜過氧化物酶基 因表達(dá)量，呈現(xiàn)反饋抑制;GA3可抑制莽菜過氧化物酶基因的表達(dá)；IAA對(duì)其基因的表達(dá)無影 響（圖20。金屬離子處理發(fā)現(xiàn)，巧離子、銅離子和裡離子均能誘導(dǎo)莽菜過氧化物酶基因的表 達(dá)，而儀離子、鋒離子、鐘離子則可抑制莽菜過氧化物酶基因的表達(dá)(圖2D)。
[0062] 實(shí)施例4農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法植物轉(zhuǎn)化 1.植物表達(dá)載體的構(gòu)建 本實(shí)施方案中，莽菜過氧化物酶基因被置于35S啟動(dòng)子之后，構(gòu)建一個(gè)植物表達(dá)載體， 用于植物轉(zhuǎn)化。
[0063] 2.農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)煙草的轉(zhuǎn)化 (1) 農(nóng)桿菌的培養(yǎng)。挑取單菌落，加入2mL農(nóng)桿菌液體培養(yǎng)基中，28Γ培養(yǎng)過夜;取2mLW 上培養(yǎng)物，加入50血農(nóng)桿菌液體培養(yǎng)基中，28 °C培養(yǎng)至0〇6日日=0.6-1.0; SOOOrpm離屯、lOmin， 收集菌體，用MS日重懸，使0〇6日日=1.0; (2) 共培養(yǎng)。取煙草無菌苗的幼嫩、健壯葉片，去主脈，將葉片剪成O.ScmXO.8cm左右的 葉盤，放在MSi培養(yǎng)基上，防止葉盤脫水;將葉盤放入農(nóng)桿菌培養(yǎng)液中，190rpm，28 °C搖床上 浸染lOmin;用藥勺拱出葉盤，放在滅菌的吸水紙上，吸干葉盤上的多余菌液;將吸干的葉盤 平放在加蓋一層濾紙的MSi培養(yǎng)基上，化Γ左右，于暗處共培養(yǎng)約2d; (3) 誘導(dǎo)叢生芽。共培養(yǎng)后，按W下步驟將葉盤表面的農(nóng)桿菌洗掉，其間不時(shí)搖動(dòng)，使葉 盤充分接觸下列溶液:無菌水，15min;無菌水+簇節(jié)青霉素(350mg/L)，15min; MSo +簇節(jié)青霉 素（350mg/L)，20min。用藥勺拱出葉盤，放在吸水紙上，吸干多余水分;將葉盤放在MS2培養(yǎng) 基上，葉盤邊緣輕壓入培養(yǎng)基中；26 °C左右，1化光照培養(yǎng)； (4) 誘導(dǎo)生根。在MS2培養(yǎng)基上誘導(dǎo)約4w后，將葉緣長出的幼芽從基部與葉盤切開，將幼 芽插入MS3培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，26 °C左右，1化光照培養(yǎng)。
[0064] 實(shí)施例5轉(zhuǎn)基因煙草的分子檢測(cè) 1.轉(zhuǎn)基因煙草葉片DM的提取及抗性基因的PCR檢測(cè) 轉(zhuǎn)基因煙草葉片DNA的提取步驟可參照實(shí)施例1(2)的方法。W提取的轉(zhuǎn)基因煙草苗葉 片基因組DNA為模板，使用潮霉素基因特異性引物Hyg-F( 5-GTCGAGAAGTTTCTGATCG-3 (記為 SEQ ID No.9))和 Hyg-lK5-GTTTCCACTATCGGCGAGTACT-3(記為沈Q ID 齡.10))進(jìn)行？〇?擴(kuò) 增，W野生型煙草和轉(zhuǎn)入空載體的煙草樣品陰性對(duì)照，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草 基因組中是否含有抗潮霉素抗性基因（700bp)，結(jié)果顯示在圖3,檢測(cè)結(jié)果顯示共有35棵轉(zhuǎn) 基因抗性苗包括抗潮霉素抗性基因。
[0065] 2.轉(zhuǎn)基因煙草中目的基因的PCR檢測(cè) W提取的轉(zhuǎn)基因煙草基因組DNA為模板，使用莽菜過氧化物酶基因的特異性引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，引物序列為：饑RCIF3(5-GGATGCGATGGATCAGTGCTTATA-3(記為SEQ ID No . 11)) CbRCIR 巧-TTAACTATTTGCAACGGAACATTGCCT-3(SEQ ID No.4))。^野生型和轉(zhuǎn)空載體的煙 草樣品為陰性對(duì)照，1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草基因組中是否含有莽菜過氧化物酶目的 基因（12(K)bp)，結(jié)果顯示在圖4,檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)35棵煙草抗性苗中有30棵苗含有莽菜過氧化 物酶基因。
[0066] 3.轉(zhuǎn)基因煙草的RNA提取及目的基因表達(dá)量的鑒定 轉(zhuǎn)基因煙草RNA的提取可參照實(shí)施例1 (2)的方法。巧光定量PCR檢測(cè)30株轉(zhuǎn)基因煙草中 莽菜過氧化物基因的表達(dá)量，使用的引物序列為：Realtime-CbRCI35-F (5- CATTAGCCAACATTCCTCCTCCGACCA-3(記為SEQ ID No. 12))和Realtime-CbRCI35-R(5- CTGACTGAAACAGACCTCTACGCTTG-3(記為SEQ ID No.l3))，W煙草中的GAPD基因 （GenBank Accession No. :AJ133422)為內(nèi)參。結(jié)果發(fā)現(xiàn)相對(duì)于野生型煙草，不同的轉(zhuǎn)基因株系其表達(dá) 量不同，轉(zhuǎn)基因煙草中基因表達(dá)量均有所上調(diào)，圖5A顯示的是其中2株轉(zhuǎn)基因煙草陽性植株 的表達(dá)量。
[0067] 實(shí)施例6轉(zhuǎn)基因煙草陽性植株的耐寒性試驗(yàn) 選取表達(dá)量較高的2個(gè)株系，繼續(xù)種植后獲得純系。將所述的兩個(gè)轉(zhuǎn)基因純系植株置于 12°C光照培養(yǎng)，冷適應(yīng)4d，之后依次置于4°C處理24h，-4°C處理比，在22°C恢復(fù)3d，拍攝記錄 轉(zhuǎn)基因煙草陽性苗與非轉(zhuǎn)基因野生型煙草苗和轉(zhuǎn)入空載體煙草苗的表型差異（圖5B)。結(jié)果 顯示22°C正常溫度下轉(zhuǎn)基因煙草無生長延遲、矮化等現(xiàn)象;4°C冷處理下非轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)空載 體對(duì)照組植株受冷害較嚴(yán)重，葉萎黨，莖干倒伏，轉(zhuǎn)基因煙草陽性苗受冷害輕微，僅有少數(shù) 葉萎縮;-4Γ下非轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M植株受冷害嚴(yán)重，葉萎黨與莖干倒伏的現(xiàn)象加劇，轉(zhuǎn)基因煙 草同樣受冷害，出現(xiàn)葉萎黨，但現(xiàn)象較輕。將轉(zhuǎn)基因煙草陽性苗和對(duì)照重新放回22。陜復(fù)生 長，3d后轉(zhuǎn)基因煙草陽性苗可恢復(fù)到正常生長狀態(tài)，而對(duì)照組煙草苗則會(huì)萎縮、死亡。
[0068] 實(shí)施例7轉(zhuǎn)基因陽性煙草的耐寒生理指標(biāo)的測(cè)定 取將實(shí)施例6處理后的煙草葉片測(cè)定葉片電導(dǎo)率、相對(duì)含水量與葡萄糖含量。實(shí)驗(yàn)設(shè)置 Ξ組重復(fù)，通過t-檢驗(yàn)評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因組和對(duì)照組的顯著性差異。
[0069] 1.葉片電導(dǎo)率的測(cè)定 使用8mm口徑打孔器在各煙草植株同一部位葉片的主脈兩側(cè)取葉盤8個(gè)，浸于10ml Milli-Q水中抽真空化，使用電導(dǎo)儀DDS-11A(上海索申）檢測(cè)表觀電導(dǎo)率。100°C煮沸后冷 卻至室溫，檢測(cè)絕對(duì)電導(dǎo)率。相對(duì)電導(dǎo)率(％)=表觀電導(dǎo)率/絕對(duì)電導(dǎo)率X 100%。結(jié)果顯示在 冷脅迫下對(duì)照組煙草葉片在冷脅迫下電導(dǎo)率顯著增大，質(zhì)膜透性顯著增加;而轉(zhuǎn)基因煙草 陽性植株葉片質(zhì)膜透性增加明顯較緩慢，且幅度也小，說明其細(xì)胞質(zhì)膜受損程度較輕。統(tǒng)計(jì) 顯示兩者差異顯著（圖5C)。
[0070] 2.相對(duì)水含量測(cè)定 使用6 mm口徑打孔器在各種處理過的煙草植株同一部位葉片的主脈兩側(cè)取葉盤8個(gè)， 稱取鮮重(FW);將葉盤放入Milli-Q水中抽真空4 h，稱取濕重(TW);將葉盤用吸水紙吸干， 85°C干燥24 h，稱取干重(DW);相對(duì)水含量(％=(FW-DW)/(TW-DW)X100%。結(jié)果顯示冷脅迫 下，冷敏植物煙草的相對(duì)水含量顯著下降，表明水分與細(xì)胞活性成分在冷脅迫下散失。相比 野生型與空載體對(duì)照，轉(zhuǎn)基因煙草兩個(gè)高表達(dá)株系相對(duì)水含量顯著較高（圖50。同時(shí)，不同 轉(zhuǎn)基因株系之間相對(duì)水含量值無明顯差異，表明莽菜過氧化物酶在植物中過量表達(dá)即可完 成細(xì)胞的低溫保護(hù)。
[0071] 3.葡萄糖含量測(cè)定 使用葡萄糖含量(服法)測(cè)定試劑盒(51旨1113-41化1證，111(3.，肥4)用來檢測(cè)煙草葉片相 對(duì)葡萄糖的含量。每個(gè)處理方法每種處理梯度下，每個(gè)株系取4株植物的葉片，每株取相同 位置約1.5 cm見方葉片，稱葉片質(zhì)量，加入1.5ml去離子水，65 °C處理7 h，然后抽真空2 h，得到樣品的葡萄糖提取液。用分光光度計(jì)(Eppendo計(jì)，Germany)測(cè)定340皿處NADH產(chǎn) 物的吸光值，去離子水為對(duì)照。葡萄糖含量與吸光度值成正比，計(jì)算公式為：葡萄糖含量= 0.319X [Atest-(Asample blank +Area邑ent blank) ] 〇A Test, A sample Blank 和A Reagent Blank 分別為樣品管、樣品空白管（將樣品管中的Glucose Assay Reagent用等體積去離子水替 代）、試劑空白管(將樣品管中的樣品葡萄糖提取液換成等體積去離子水)的吸光度值。葡萄 糖在調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透勢(shì)中發(fā)揮作用，從野生型植株與轉(zhuǎn)基因陽性植株葉片的葡萄糖含量測(cè) 定結(jié)果可W看出，轉(zhuǎn)煙草陽性植株的細(xì)胞內(nèi)葡萄糖含量含量高于野生型的葡萄糖含量（圖 50,表明在受低溫逆境脅迫時(shí)細(xì)胞內(nèi)葡萄糖含量提高W響應(yīng)低溫引起的缺水及細(xì)胞損傷。
[0072] 實(shí)施例8轉(zhuǎn)基因煙草的植株的過氧化物分析 轉(zhuǎn)基因煙草的過氧化物分析采用DCFH-DA巧光探針，此探針可穿過細(xì)胞膜從而被過氧 化物酶酶解變成DCFH，留在細(xì)胞內(nèi)。然后細(xì)胞內(nèi)的DCFH會(huì)被活性氧氧化而發(fā)出巧光。實(shí)驗(yàn)結(jié) 束時(shí)，先將葉片組織剪下，然后浸入濃度為lOrt的DCFH-DA巧光探針溶液，在37°C條件下解 育20min，后用去離子水沖洗葉片表面，使葉片細(xì)胞表面附著的DCFH-DA被清洗掉，W免影響 后續(xù)的觀察，造成干擾。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因煙草陽性植株相比于野生型煙草對(duì)照植株過氧化 物明顯增多（圖6)，說明莽菜過氧化物酶是一種能夠產(chǎn)生R0S的過氧化物酶。
[0073] 實(shí)施例9轉(zhuǎn)基因煙草的植株的抗冷性形成的分子機(jī)制分析 由W上冷馴化的表型可W看出轉(zhuǎn)基因煙草陽性植株的冷耐受能力有了較大程度的提 高，運(yùn)種能力的提高必然與植物細(xì)胞膜保護(hù)蛋白等物質(zhì)有關(guān)，也就是說轉(zhuǎn)基因煙草陽性植 株中的莽菜過氧化物酶可能通過激活冷響應(yīng)的信號(hào)途徑的關(guān)鍵基因而提高煙草的抗冷性。 煙草中存在與擬南芥中相似的冷響應(yīng)途徑相關(guān)基因，其中7?怎公J和Wi07?怎公J編碼 C公戶/07?怎公類轉(zhuǎn)錄因子，在冷信號(hào)途徑中起重要作用；Wi怎化和W ?怎口6貝IJ 編碼下游的一些C07?基因；WirS/J是與病害等有關(guān)的一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子。轉(zhuǎn)基因煙草RNA的 提取可參照實(shí)施例1 (2)的方法。用巧光定量PCR技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草植株中5個(gè)內(nèi)源冷響應(yīng) 基因的表達(dá)量變化。結(jié)果顯示，26°C培養(yǎng)條件下，相對(duì)于對(duì)照組煙草，所述的轉(zhuǎn)基因煙草陽 性植株自身的冷誘導(dǎo)途徑相關(guān)基因的表達(dá)量已經(jīng)有了一定量的上調(diào);在4Γ處理后，轉(zhuǎn)基因 煙草陽性植株中W 怎公7，W 怎公怎7?07〇a，和W ?怎的表達(dá)量 上調(diào)也顯著強(qiáng)于對(duì)照植株（圖7) "WirS/7表達(dá)量在轉(zhuǎn)基因煙草和對(duì)照植物中無明顯差 另IJ。由此說明，莽菜過氧化物酶基因能夠參與冷耐受途徑中的信號(hào)傳遞途徑，經(jīng)過信號(hào)傳遞 使煙草內(nèi)源的下游冷誘導(dǎo)基因表達(dá)量大幅提高，從而提高植物抗冷性。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種從薺菜中分離的具有低溫誘導(dǎo)特性的薺菜過氧化物酶基因，其特征在于，所述 薺菜過氧化物酶基因的選自以下之一： (1) 其核苷酸序列如SEQ ID No. 1中第20-1532位堿基所示； (2) 其核苷酸序列與SEQ ID No. 1 中從核苷酸第20-232;337-525;615-777;1116-1532 位DNA分子的核苷酸序列有至少70%同源性、且編碼相同功能蛋白質(zhì);或者 (3) 其核苷酸序列在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID No. 1中從核苷酸第20-1532位的核苷酸 序列雜交、且編碼相同功能蛋白質(zhì)。2. -種重組質(zhì)粒，其特征在于，含有權(quán)利要求1所述的薺菜過氧化物酶基因。3. -種薺菜過氧化物酶，其特征在于，所述薺菜過氧化物酶選自以下之一： (1) 其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示;或者 (2) 具有SEQ ID No. 2氨基酸序列之多肽的保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性 衍生物。4. 一種權(quán)利要求1所述的薺菜過氧化物酶基因的制備方法，其特征在于包括以下步驟： (1) 將薺菜種子經(jīng)過70%酒精消毒后，播種于MS培養(yǎng)基上； (2) 待所述薺菜種子長出葉片后，提取所述葉片的基因組DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳分 析其質(zhì)量；以及 (3) 采用基因組步移技術(shù)克隆得到薺菜過氧化物酶基因基因組全長序列，其中，使用的 上游引物為：SEQ ID No.3,下游引物為SEQ ID No.4。5. -種權(quán)利要求2所述的重組質(zhì)粒的制備方法，其特征在于包括以下步驟： (1) 設(shè)計(jì)引物對(duì)，擴(kuò)增出權(quán)利要求1所述的薺菜過氧化物酶基因的完整DNA片段，擴(kuò)增所 用引物對(duì)為:上游引物為SEQ ID No.3,下游引物為SEQ ID No.4; (2) 將所述完整DNA片段克隆到中間載體pMD18-T，再進(jìn)一步克隆到植物表達(dá)載體pl304 上，得到所述重組質(zhì)粒。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于還包括向所述上游引物引入限制性酶 切位點(diǎn)# co I，向所述下游引物引入限制性酶切位點(diǎn)B s ?五II。7. 權(quán)利要求1所述的薺菜過氧護(hù)額物酶基因或權(quán)利要求2所述的重組質(zhì)粒在植物抗寒 性和耐寒性中的應(yīng)用。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述植物為具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的作物，包括水 稻、小麥、玉米、棉花、油菜、番茄和黃瓜。9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，將所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌ΕΗΑ105 中，然后用于轉(zhuǎn)化目的植物，提高植物對(duì)寒冷的耐受性。10. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將編碼具有薺菜過氧化 物酶活性多肽的核苷酸序列轉(zhuǎn)化入植物，以提高植物對(duì)寒冷的耐受性，其步驟如下： (1) 將編碼具有薺菜過氧化物酶活性多肽的純化的核苷酸序列可操作地連于植物表達(dá) 調(diào)控序列后，形成含薺菜過氧化物酶基因的植物表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID No. 1中從核苷酸第20-1532位的核苷酸序列有至少70%的同源性； (2) 將步驟(1)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，將含表達(dá)載體的農(nóng)桿菌同真核宿主細(xì)胞共培 養(yǎng)，在22-28°C條件下，暗培養(yǎng)l-2d后，通過篩選，獲得含有薺菜過氧化物酶基因的轉(zhuǎn)化細(xì) 胞并最終再生轉(zhuǎn)基因植株及其后代，包括植物種子及植物組織。
【文檔編號(hào)】C12N5/10GK106011157SQ201610555165
【公開日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年7月15日
【發(fā)明人】林娟, 李偉偉, 陳虎, 魏東暉
【申請(qǐng)人】復(fù)旦大學(xué)