一種空間氧化微桿菌lct-h6的制作方法
【專利摘要】一種空間氧化微桿菌LCT?H6，更具體的說是一種太空微生物，運(yùn)用空間技術(shù)從“神舟九號(hào)”飛船返回艙內(nèi)部的冷凝水分離獲得。其特征：氧化微桿菌LCT?H6是好氧的革蘭陽性菌，與微桿菌Microbacterium maritypicum親緣關(guān)系最為相近，對(duì)環(huán)氧樹脂、酯類聚氨酯、醚類聚氨酯和硫化天然橡膠4種高分子材料具有腐蝕能力。在基因組學(xué)層面對(duì)該菌進(jìn)行闡明，證實(shí)LCT?H6的全基因組序列總長度為4.11Mbp，GC含量為67.75%，其蛋白被分類注釋為22類COG家族，包含蛋白數(shù)目最多的COG為“能量產(chǎn)生和轉(zhuǎn)化”、“氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝”、“糖轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝”、“無機(jī)鹽離子轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝”、“翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和形成”。CGMCC 1257420160601
【專利說明】
一種空間氧化微桿菌LCT-H6
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于微生物及生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種新的微生物菌株氧化微桿菌LCT-H6以及其生物學(xué)特性、基因組DNA序列，利用生物信息學(xué)技術(shù)進(jìn)行了組學(xué)分析，獲得其在基因組的特性。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著人類空間探索活動(dòng)的日益頻繁，宇宙空間成為了人類活動(dòng)的一個(gè)重要領(lǐng)域。太空密閉艙中存在著特定的微生物群落。雖然每一件物品都經(jīng)過了嚴(yán)格消毒，微生物仍會(huì)隨航天員身體、人體分泌物、航空部件等進(jìn)入太空，并在航天器密閉艙室內(nèi)形成特定微生物群落，既包括無害微生物，也包括一些致病性和腐蝕性微生物?！昂推健碧?hào)運(yùn)行十余年來空間站內(nèi)檢測到234種微生物。太空密閉艙內(nèi)的特殊環(huán)境因素，包括微重力、弱磁場和粒子輻射等，使得微生物會(huì)產(chǎn)生變異，導(dǎo)致它們對(duì)生存環(huán)境的要求很低，更加容易生長和繁殖，某些微生物的腐蝕性會(huì)增強(qiáng)。太空密閉艙中腐蝕性微生物的大量繁殖，使得各種航天材料逐漸產(chǎn)生腐蝕，加速航天器件的降解耗損，將可能導(dǎo)致空間站內(nèi)的設(shè)備運(yùn)行失靈，影響航天器的長期正常運(yùn)行及其在軌使用壽命，甚至對(duì)飛行安全也會(huì)造成很大威脅。航天器服役條件惡劣，在軌時(shí)間長，而維修條件相對(duì)不足，一旦發(fā)生微生物腐蝕設(shè)備故障，損失不可估量。國外載人航天器在軌經(jīng)驗(yàn)和國內(nèi)地面研究的初步結(jié)果表明，微生物會(huì)嚴(yán)重威脅航天設(shè)備安全。開展長期太空密閉艙中微生物對(duì)航天器材腐蝕的機(jī)理及防控措施研究，深化對(duì)載人航天器中微生物風(fēng)險(xiǎn)的認(rèn)識(shí)和加強(qiáng)相關(guān)技術(shù)儲(chǔ)備，探索更加有效的載人航天器微生物綜合控制措施，為載人航天器的研制和運(yùn)營提供技術(shù)支撐。
[0003]針對(duì)空間環(huán)境微生物材料腐蝕研究，目前尚無氧化微桿菌的相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種空間氧化微桿菌LCT-H6。對(duì)空間菌株進(jìn)行表型檢測，然后對(duì)其進(jìn)行全基因組測序，闡明該細(xì)菌的特性及用途。
[0005]本發(fā)明提供的菌株氧化微桿菌LCT-H6，其保藏號(hào)為CGMCCN0.12574。
[0006]所述的氧化微桿菌LCT-H6，革蘭陽性菌，與微桿菌Microbacterium maritypicum親緣關(guān)系最為相近。對(duì)環(huán)氧樹脂、酯類聚氨酯、醚類聚氨酯和硫化天然橡膠4種高分子材料具有腐蝕能力。
[0007]所述的氧化微桿菌^:1'-冊(cè)，全基因組序列總長度為4.111?^，6(:含量為67.75%， 其蛋白被分類注釋為22類COG家族，包含蛋白數(shù)目最多的COG為“能量產(chǎn)生和轉(zhuǎn)化”、“氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝”、“糖轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝”、“無機(jī)鹽離子轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝”、“翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和形成”，以及其他。
【附圖說明】
[0008]圖1氧化微桿菌LCT-H6的革蘭氏染色。
[0009]圖2氧化微桿菌LCT-H6進(jìn)化樹。
[0010]圖3氧化微桿菌LCT-H6在環(huán)氧樹脂唯一碳源培養(yǎng)條件下增長曲線。
[0011]圖4氧化微桿菌LCT-H6對(duì)環(huán)氧樹脂腐蝕的SEM觀察。
[0012]圖5氧化微桿菌LCT-H6在酯類聚氨酯唯一碳源培養(yǎng)條件下增長曲線。
[0013]圖6氧化微桿菌LCT-H6對(duì)酯類聚氨酯腐蝕的SEM觀察。
[0014]圖7氧化微桿菌LCT-H6在醚類聚氨酯唯一碳源培養(yǎng)條件下增長曲線。
[0015]圖8氧化微桿菌LCT-H6對(duì)醚類聚氨酯腐蝕的SEM觀察。
[0016]圖9氧化微桿菌LCT-H6在硫化天然橡膠唯一碳源培養(yǎng)條件下增長曲線。
[0017]圖10氧化微桿菌LCT-H6對(duì)硫化天然橡膠腐蝕的SEM觀察。
[0018]圖11氧化微桿菌LCT-H6在聚乙烯醇縮甲醛唯一碳源培養(yǎng)條件下增長曲線。
[0019]圖12氧化微桿菌LCT-H6對(duì)聚乙烯醇縮甲醛腐蝕的SEM觀察。
[0020]圖13氧化微桿菌LCT-H6的COG功能分析。
【具體實(shí)施方式】
[0021 ]下述實(shí)施實(shí)例中所用的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0022]下述實(shí)施實(shí)例中所用的材料、試劑，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。
[0023]一、氧化微桿菌LCT-H6的表型
1.菌株來源:對(duì)“神舟九號(hào)”飛船返回艙內(nèi)部的冷凝水進(jìn)行了微生物的采集，選用細(xì)菌培養(yǎng)基對(duì)樣品進(jìn)行初篩，然后挑取菌落形態(tài)不同的單菌落進(jìn)行劃線培養(yǎng)，純化到單一菌株后，使用生理鹽水加80%甘油保藏菌種。菌株命名為氧化微桿菌LCT-H6，保存于中國普通微生物菌種保藏中心，保藏號(hào)為CGMCC N0.12574。
[0024]2.革蘭氏染色:取50ul樣品離心，棄上清，加入無菌水50ul，吸取20ul于載玻片上進(jìn)行固定;初染，吸取革蘭氏染色1(結(jié)晶紫)2滴于載玻片樣品上進(jìn)行初染lmin，然后用自來水沖洗染液;媒染，吸取革蘭氏染色Π (碘液)2滴覆蓋涂面染約Imin，然后用自來水沖洗染液，用吸水紙吸取涂面上的水分;脫色，吸取革蘭氏染色ΠΚ酒精)2滴滴在涂面上約30s，用水沖洗載玻片，用吸水紙吸取涂面上的水分;復(fù)染，吸取革蘭氏染色I(xiàn)V(番紅)2滴滴在涂面上約lmin，用水沖洗載玻片，用吸水紙吸取涂面上的水分;觀察，先用顯微鏡低倍鏡找到目標(biāo)視野，然后再用油鏡(100X)進(jìn)行觀察，判定并記錄結(jié)果、拍照，見圖1。氧化微桿菌LCT-H6為革蘭氏陽性桿菌，菌體單個(gè)、成雙或成串狀排列。
[0025]3.氧化微桿菌LCT-H6菌株16s rDNA鑒定:16S rDNA是16S rRNA序列的基因，長約
1.5kb。將已分純的單菌直接經(jīng)菌液PCR擴(kuò)增16S rDNA，部分通過菌液PCR較難擴(kuò)增的單菌經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后提取基因組后擴(kuò)增，擴(kuò)增所用引物序列如下:
SgF: AGAGTTTGATCATGGCTCAGSgR: TAGGGTTACCTTGTTACGACTT
16S rDNA PCR產(chǎn)物用96孔mi I Ipore純化系統(tǒng)純化后準(zhǔn)確定量，經(jīng)ABI 3730x1全自動(dòng)序列分析儀測序，測序結(jié)果使用Sequence scanner、Seqman等序列分析軟件，將兩向測序結(jié)果去掉首尾不可信序列后拼接，余下的約1350bp(雙向測序)即用于同源性分析。所得16SrDNA序列在Eztaxon server 2.1數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(duì)，確定菌株大致的分類地位。所有單菌16S序列全部導(dǎo)入seqman，輸出single file(fasta)后，經(jīng)Mega 5.0軟件cIusterW多重比對(duì)，輸出meg文件重新導(dǎo)入構(gòu)建Neighbor-Joining tree。其中，phylogeny test method為bootstrap參數(shù)設(shè)置為1000。16s rDNA鑒定結(jié)果顯不LCT-H6與微桿菌Microbacteriummaritypicum 相似性為 99%(圖 2)。
[0026]4.腐蝕性實(shí)驗(yàn):選擇航天器已采用的5種高分子材料環(huán)氧樹脂、酯類聚氨酯、醚類聚氨酯、硫化天然橡膠和聚乙烯醇聚縮醛為氧化微桿菌LCT-H6腐蝕特性研究對(duì)象。
[0027]分別以這5種高分子材料為唯一碳源對(duì)菌株LCT-H6進(jìn)行培養(yǎng)，在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行取樣并測定培養(yǎng)液在600 nm波長下的吸光度(0D600)，以判斷細(xì)菌利用單一高分子材料作為唯一碳源的生長情況。具體操作如下:向100 mL無菌三角燒瓶中倒入40 mL無機(jī)鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基，每個(gè)培養(yǎng)瓶中加入10個(gè)高分子材料試樣，接種5 mL菌懸液，透氣膜封口，放入32°C，相對(duì)濕度為75%的恒溫培養(yǎng)箱中。每株菌和每個(gè)材料準(zhǔn)備3個(gè)平行樣品。設(shè)置4個(gè)時(shí)間點(diǎn):1、3、
6、10周取樣。測定各個(gè)時(shí)間點(diǎn)培養(yǎng)液600 nm波長下的吸光度，判斷細(xì)菌利用高分子材料作為唯一碳源的生長情況。結(jié)果(圖3、5、7、9)表明在I至10周內(nèi)，以環(huán)氧樹脂、酯類聚氨酯、醚類聚氨酯和硫化天然橡膠4種高分子材料為唯一碳源生長實(shí)驗(yàn)中，菌株LCT-H6的0D600均大于對(duì)照菌株，具有明顯的增長現(xiàn)象。以聚乙烯醇縮甲醛為唯一碳源生長實(shí)驗(yàn)中，菌株LCT-H6的0D600與對(duì)照菌株相差較小，增長效果不明顯(圖11)。
[0028]高分子材料表面微生物膜和腐蝕形態(tài)SEM觀察:將環(huán)氧樹脂膜加工成尺寸為1mm(直徑)X0.5_(厚度)圓片;醚類聚氨酯、酯類聚氨酯泡沫和聚乙烯醇縮甲醛泡沫分別加工成10 mm(長)X 10 mm(寬)X 5mm(厚度)的小方塊;硫化橡膠膜加工成尺寸為6mm(直徑)X
0.5mm(厚度)圓片;所有樣品用丙酮浸泡I天，5%乙醇/水溶液中15min滅菌，無菌水清洗至中性。將培養(yǎng)的菌株LCT-H6分別接種至5種高分子材料膜表面，在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)高分子材料膜表面用掃描電子顯微鏡(SEM)進(jìn)行觀察，如圖4、6、8、10所示，I至10周內(nèi)菌株LCT-H6能在環(huán)氧樹脂、酯類聚氨酯、醚類聚氨酯和硫化天然橡膠4種高分子材料膜表面形成微生物膜，說明菌株LCT-H6具有降解和腐蝕這4種高分子材料的潛力。而在聚乙烯醇縮甲醛表面未形成微生物膜，說明菌株LCT-H6無腐蝕聚乙烯醇縮甲醛的潛力(圖12)。
[0029 ] 二、空間氧化微桿菌LCT-H6全基因組測序
培養(yǎng)氧化微桿菌LCT-H6并提取基因組DNA，首先采用超聲法將檢測合格的DNA樣品隨機(jī)打斷，得到一系列DNA片段，經(jīng)T4 DNA聚合酶、Klenow DNA聚合酶和T4多聚核苷酸激酶等處理后，回收目的片段，得到測序文庫，利用Illumina的Genome Analyzer II測序;測序結(jié)束后得到的reads，經(jīng)過濾處理后進(jìn)行組裝和分析。采用Glimmerf.0軟件從組裝結(jié)果中獲得基因序列并將基因的序列與各數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，得到對(duì)應(yīng)的功能注釋信息。LCT-H6的全基因組序列總長度為4.1 IMbp，GC含量為67.75%。其蛋白被分類注釋為22類COG家族，包含蛋白數(shù)目最多的COG為“能量產(chǎn)生和轉(zhuǎn)化”、“氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝”、“糖轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝”、“無機(jī)鹽離子轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝”、“翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和形成”，以及其他(圖13)。
[0030]本發(fā)明的特點(diǎn)和應(yīng)用價(jià)值:本研究是我國第一次利用自己研發(fā)的空間技術(shù)獲得對(duì)常用航天高分子材料具有腐蝕性的太空艙定植氧化微桿菌LCT-H6，為研究載人航天器微生物腐蝕提供了寶貴的樣本。對(duì)該菌的進(jìn)一步研究，將有助于深化對(duì)載人航天器中微生物風(fēng)險(xiǎn)的認(rèn)識(shí)和加強(qiáng)相關(guān)技術(shù)儲(chǔ)備，有助于探索更加有效的載人航天器微生物綜合控制措施。
[0031]
關(guān)于保藏的LCT-H6菌株說明A.菌種的保藏單位名稱和地址名稱:中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院微生物研究所
B.交機(jī)構(gòu)保藏的日期2016年6月I日
C.保藏機(jī)構(gòu)給予的保藏號(hào)CGMCC N0.12574
D.分類命名氧化微桿菌 Microbacterium Oxydans0
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種空間氧化微桿菌LCT-H6，其特征在于:保藏號(hào)為CGMCC 12574。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的氧化微桿菌LCT-H6，其特征在于:革蘭陽性菌，微桿菌Microbacterium maritypicum親緣關(guān)系最為相近;對(duì)環(huán)氧樹脂、酯類聚氨酯、醚類聚氨酯和硫化天然橡膠4種高分子材料具有腐蝕能力。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的氧化微桿菌LCT-H6，其特征在于:LCT-H6的全基因組序列總長度為4.1 IMbp，GC含量為67.75%。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的氧化微桿菌LCT-H6，其特征在于:其蛋白被分類注釋為22類COG家族，包含蛋白數(shù)目最多的COG為“能量產(chǎn)生和轉(zhuǎn)化”、“氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝”、“糖轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝”、“無機(jī)鹽離子轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝”、“翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和形成”。
【文檔編號(hào)】C12R1/01GK106011011SQ201610455943
【公開日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年6月22日
【發(fā)明人】劉長庭, 張學(xué)林, 方向群, 郭英華, 王俊峰, 姜學(xué)革, 李天志, 周宏 , 劉巖, 潘磊, 徐綢, 黃兵, 李佳, 余昳
【申請(qǐng)人】中國人民解放軍總醫(yī)院