一種抗病毒抗病菌取代抗生素的禽畜腸道生態(tài)修復(fù)菌劑及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種抗病毒抗病菌取代抗生素的禽畜腸道生態(tài)修復(fù)菌劑及其制備方法，由釀酒酵母、產(chǎn)朊假絲酵母2株酵母和枯草芽孢桿菌、地衣芽胞桿菌及沼澤紅假單胞菌3株細(xì)菌以及植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌2株乳酸菌等七種菌混合組成。各菌種分別單獨(dú)接種于相應(yīng)的滅菌培養(yǎng)基中進(jìn)行活化、制備一級(jí)種子液，在二級(jí)、三級(jí)發(fā)酵時(shí)按照相近與共生的原則，將2株酵母混合發(fā)酵，3株細(xì)菌混合發(fā)酵，2株乳酸菌混合發(fā)酵，再將三者混合擴(kuò)大培養(yǎng)菌液按1:1:1等體積混合后吸附于滅菌麥麩?米糠上，再經(jīng)過(guò)固體發(fā)酵、低溫干燥而制得固體菌劑。本發(fā)明的修復(fù)菌劑具有高密度、高活性的優(yōu)良特性，并且首次提出益生菌菌劑與檸檬、黃芪水提液相復(fù)合。具有用量小，使用方法簡(jiǎn)便的突出特點(diǎn)。
【專利說(shuō)明】-種抗病毒抗病菌取代抗生素的禽畜腸道生態(tài)修復(fù)菌劑及其 制備方法 所屬技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵技術(shù)，特別是一種抗病毒抗病菌取代抗生素的禽畜腸道生 態(tài)修復(fù)菌劑及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 長(zhǎng)期W來(lái)，在禽畜養(yǎng)殖業(yè)中大量甚至濫用抗生素，不僅使病原微生物產(chǎn)生了抗性， 而且嚴(yán)重破壞了禽畜腸道菌群的生態(tài)平衡，使禽畜出現(xiàn)免疫抑制，免疫力低下，抗病能力減 弱，因此使得病毒性及細(xì)菌性感染增多。每年的春、秋季多發(fā)性禽流感就是明證。而且，面對(duì) 病毒性感冒和病毒性腸道疾病，除了個(gè)別的可W通過(guò)打疫苗預(yù)防外，面對(duì)不斷變異的病毒 感染，幾乎是束手無(wú)策，只能是看著大片的雞群、大量的豬群死亡。另外，大量使用抗生素不 僅會(huì)在禽畜產(chǎn)品中殘留，而且會(huì)造成區(qū)域性±壤、水域的污染，直接威脅到人類的生命健 康。2013年中國(guó)抗生素使用一年達(dá)16.2萬(wàn)噸，約占世界用量的一半，其中52%為獸用，48% 為人用，超過(guò)5萬(wàn)噸抗生素被排放進(jìn)入水±環(huán)境中。復(fù)旦大學(xué)王和興等，對(duì)2013年采集到的 上海地區(qū)的586名8至11歲學(xué)齡兒童尿樣進(jìn)行研究，其中79.6%的學(xué)齡兒童尿液中檢出21種 抗生素中的一種或幾種。所W，禁止在禽畜飼料中添加抗生素是自然法則。經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)的美 國(guó)、歐盟等國(guó)，早在上個(gè)世紀(jì)末就發(fā)出禁令。我國(guó)也在逐步減少或禁止在飼料中添加抗生 素。因此，為了發(fā)展禽畜生態(tài)養(yǎng)殖業(yè)，必須尋找能替代抗生素的制劑，用于禽畜的防病治病。 目前，國(guó)內(nèi)外研究主要集中于在益生菌、益生元、免疫增強(qiáng)劑、中草藥制劑、酶制劑等領(lǐng)域。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明目的在于針對(duì)上述存在問(wèn)題，提供一種高密度、高活性的抗病毒抗病菌取 代抗生素的禽畜腸道生態(tài)修復(fù)菌劑及其制備方法。
[0004] 為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種抗病毒抗病菌取代抗生 素的禽畜腸道生態(tài)修復(fù)菌劑，包括釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ACCC20037、產(chǎn)航 假絲酵母(Candida utilis)ACCC20060、枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)ACCC10114,地 衣芽抱桿菌（Bacillus 1;[。11日]11的1'11113)4〔〔〔10146、沼澤紅假單胞菌（加〇(1〇93日11(1〇111〇]1日8 palust;ris)ACCC10649、植物乳桿菌化actobacillusplanta;rum)ACCC10141和鼠李糖乳桿 |if(Lactobacillus rhamnosus)ACCC10534。
[0005] 還包括巧樣、黃巧的水提物。
[0006] 所述的修復(fù)菌劑的有效活性菌總菌落數(shù)2.〇-3.0*1〇1<^〔。11/肖，其中釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae )ACCC20037和產(chǎn)航假絲酵母(Candida util is )ACCC20060 為 0.5-0.6*l〇iDCFU/g，枯草芽抱桿菌（Bacillus subtil is )ACCC10114+地衣芽抱桿菌 (Bacillus licheniformis)ACCC10146+沼澤紅假單胞菌（lihodopseudomonas palustris) ACCC10649為0.5-0.6*l〇i°CFU/g，植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum)ACCC10141+鼠李 糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus)ACCC10534為 1.0-1.8*l〇i日CFU/g。
[0007] 所述抗病毒抗病菌取代抗生素的禽畜腸道生態(tài)修復(fù)菌劑的制備方法，將各菌種分 別單獨(dú)活化，接種于相應(yīng)的滅菌培養(yǎng)基中進(jìn)行一級(jí)種子液擴(kuò)大培養(yǎng)，在二級(jí)、Ξ級(jí)發(fā)酵時(shí)按 照相近與共生的原則，將2株酵母混合發(fā)酵，3株細(xì)菌混合發(fā)酵，2株乳酸菌混合發(fā)酵，再將Ξ 者混合擴(kuò)大培養(yǎng)菌液按1:1:1等體積混合后吸附于滅菌麥教-米慷上，再經(jīng)過(guò)固體發(fā)酵階 段，最后低溫干燥，制得固體菌劑，具體步驟如下：
[0008] 1)將冰箱冷藏保存的各斜面菌種分別單獨(dú)活化后，分別經(jīng)搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)制成一級(jí) 種子液；
[0009] 2)將上述各菌種的一級(jí)種子液分別在滅菌培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行二級(jí)混合擴(kuò)大培養(yǎng)制成 二級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)液：
[0010] 產(chǎn)航假絲酵母與釀酒酵母的二級(jí)混合培養(yǎng)條件是:接種量各為5-lOwt%、溫度30 ± rc、攬拌速度200-25化/min、壓力0.05MPa，培養(yǎng)時(shí)間20-24h，培養(yǎng)基配方，按質(zhì)量百分 tt:酵母膏 1.0-1.5%，薦糖3.0-5.0%，蛋白腺 1.0-2.0%，牛肉膏0.5-1.0%，pH值7.2-7.4， 余量為水；
[0011] 枯草芽胞桿菌、地衣芽抱桿菌和沼澤紅假單胞菌二級(jí)混合培養(yǎng)條件是:接種量各 為5-lOwt%、溫度37±rC、攬拌速度100-150r/min、壓力0.05MPa，培養(yǎng)時(shí)間15-20h，培養(yǎng)基 配方，按質(zhì)量百分比：牛肉膏1.0-1.5%，蛋白腺2-2.5%，酵母膏0.2-0.5%，薦糖0.5- 1.0%，氯化鋼 1.0-1.5%，pH值7.0-7.2,余量為水；
[0012] 植物乳桿菌與鼠李糖乳桿菌的一級(jí)種子液在滅菌培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行二級(jí)混合擴(kuò)大培 養(yǎng)制成二級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)液，培養(yǎng)條件是:接種量各為5-lOwt%，靜止培養(yǎng)，50-l(K)r/min每小時(shí) 間歇攬拌2-5min，溫度控制30-37°C，培養(yǎng)時(shí)間20-24h，培養(yǎng)基制備：
[0013] a.鮮巧樣+黃巧粉的水提取液的制備:按質(zhì)量份數(shù)，稱取鮮巧樣10份，絞粹，與黃巧 粉10份加入到不誘鋼提取鍋內(nèi)，加入100份水，加熱至90-100°C浸煮30π?η，Ξ層紗布過(guò)濾， 浸煮2次，合并濾液，得到巧樣、黃巧水提取液；
[0014] b.按質(zhì)量百分比：牛肉膏1.0-1.5%，蛋白腺1.0-1.5%，酵母膏0.5-0.8%，薦糖 3.0-3.5 %，醋酸鋼0.5-1.0 %，憐酸氨二鐘0.2-0.4 %，巧樣酸錠0.2-0.5 %，硫酸儀0 . Οδ? ?. 1 % ， 硫酸儘 0.005-0.01 % ， 碳酸巧 0.3-0. 5 % ， 吐溫-80:1 毫升/100 毫升 ，余量為步驟 a 中 制備的巧樣、黃巧水提取液，pH值6.2-6.4;
[0015] 3)將上述各菌的二級(jí)混合擴(kuò)大培養(yǎng)液分別在滅菌培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行Ξ級(jí)混合擴(kuò)大培 養(yǎng)制成Ξ級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)液：
[0016] 產(chǎn)航假絲酵母與釀酒酵母Ξ級(jí)混合擴(kuò)大培養(yǎng)條件是:接種量5-lOwt%、溫度30±1 °C、pH值7.2-7.4、攬拌速度200-250r/min、壓力0.05MPa，培養(yǎng)時(shí)間20-2地，培養(yǎng)基同二級(jí)；
[0017] 枯草芽胞桿菌、地衣芽抱桿菌和沼澤紅假單胞菌Ξ級(jí)混合擴(kuò)大培養(yǎng)條件是:接種 量5-lOwt%、溫度37± rC、pH值7.0-7.2、攬拌速度 150-200r/min、壓力0.05MPa，培養(yǎng)時(shí)間 18-20h，培養(yǎng)基同二級(jí)；
[001引植物乳桿菌與鼠李糖乳桿菌Ξ級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng):接種量5-lOwt%，靜止培養(yǎng)，50-10化/ min每小時(shí)間歇攬拌2-5min，溫度控制30-37°C，培養(yǎng)時(shí)間20-24h，發(fā)酵終止時(shí)調(diào)整pH值 3.8-4.1W增加乳酸菌的穩(wěn)定性，培養(yǎng)基同二級(jí)；
[0019] 4)將上述Ξ類混合菌的Ξ級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)液，按1:1:1等體積混合均勻，得到菌劑混合 液；
[0020] 5)將上述菌劑混合液按照質(zhì)量比0.5:1噴灑于滅菌麥教-米慷上，邊噴灑邊攬拌， 使菌液均勻地吸附、固化于麥教-米慷上，經(jīng)過(guò)固體發(fā)酵、低溫干燥，最后制得固體菌劑；
[0021] 6)將制成的固體菌劑密封于內(nèi)襯聚乙締膜的包裝袋內(nèi)，室溫保存，防潮、防暴曬。
[0022] 所述菌種活化方法是:把瓊脂斜面保存的各菌菌種從冰箱冷藏室取出，放于超凈 工作臺(tái)內(nèi)，在酒精燈火焰旁，分別轉(zhuǎn)接于瓊脂平板培養(yǎng)基上，在30-37 °C下培養(yǎng)20-3化后，平 板上生長(zhǎng)出大大小小的菌落，再?gòu)钠桨迳暇渲刑羧尉滢D(zhuǎn)接于滅菌試管中的培養(yǎng)液 中。
[0023] 所述步驟1)中活化后的每個(gè)菌種單獨(dú)擴(kuò)大培養(yǎng)的培養(yǎng)基分別是：
[0024] 枯草芽胞桿菌、地衣芽抱桿菌與沼澤紅假單胞菌的培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白腺培養(yǎng) 基，按質(zhì)量百分比：牛肉膏0.5-0.8%，蛋白腺1.0-1.5%，氯化鋼0.5-0.8%，余量為水，pH值 7.0-7.2；
[0025] 釀酒酵母與產(chǎn)航假絲酵母的培養(yǎng)基為PDA,制備方法:按質(zhì)量份數(shù)，取去皮馬鈴馨 200-250份，切成小塊，加水1000份煮沸30min，Ξ層紗布過(guò)濾，濾液補(bǔ)足至1000份，加入20- 25份葡萄糖，溶化后115 °C滅菌30min;
[0026] 植物乳桿菌與鼠李糖乳桿菌的培養(yǎng)基為MRS,按質(zhì)量百分比：牛肉膏1.0-1.5%，蛋 白腺1.0-1.5%，酵母膏0.5-0.8%，薦糖3.0-3.5%，醋酸鋼0.5-0.8%，憐酸氨二鐘0.2- 0.5 %，巧樣酸錠0.2-0.5 %，硫酸儀0.05-0.1 %，硫酸儘0.005-0.01 %，碳酸巧0.3-0.5 %， 吐溫-80每100毫升培養(yǎng)基加1毫升，余量為水，pH值6.2-6.4。
[0027] 所述步驟5)中在固體發(fā)酵罐內(nèi)，控制含水率50-60%，30-40°C下發(fā)酵20-2地，再經(jīng) 過(guò)低溫40-45°C干燥，控制菌劑含水率在8-10%，制得固體菌劑，固體菌劑有效活性菌總菌 落數(shù)> 2.0-3.0*l〇iDCFU/g，乳酸菌總菌落數(shù)> 1.0-1.8*l〇iDCFU/g，細(xì)菌總菌落數(shù)>0.5- 0.6*l〇i〇C 即/邑。
[0028] 本發(fā)明的有益效果是:該生態(tài)修復(fù)菌劑具有高密度、高活性的優(yōu)良特性。該生態(tài)修 復(fù)菌劑可W直接添加到禽畜精飼料中，充分混合均勻。對(duì)于大棚養(yǎng)殖雞(維雞、肉雞、蛋雞） 推薦使用量:每只雞每天0.05-0.1 g;對(duì)于養(yǎng)殖豬（乳豬、母豬、育肥豬）：每頭豬每天2.0- 5.Og;對(duì)于奶?；蛉馀Ｍ扑]用量:每頭牛每天20-30g.具有用量小，使用方法簡(jiǎn)便突出特點(diǎn)。 取代所有抗生素，抗病毒抗病菌，修復(fù)調(diào)整禽畜腸道菌群結(jié)構(gòu)，預(yù)防常見(jiàn)呼吸道及腸道疾 病，提高飼料報(bào)酬，降低料肉比，提高禽畜生產(chǎn)性能，經(jīng)濟(jì)效益顯著。具有廣闊的市場(chǎng)應(yīng)用前 景，具有顯著的生態(tài)效益和社會(huì)效益，對(duì)實(shí)現(xiàn)真正意義上的生態(tài)養(yǎng)殖具有重大意義。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 本發(fā)明的抗病毒抗病菌取代抗生素的禽畜腸道生態(tài)修復(fù)菌劑，包括釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)ACCC20037，產(chǎn)航假絲酵母（Candida utilis)ACCC20060,枯 草芽抱桿菌（Bacillus subtil is )ACCC10114,地衣芽抱桿菌（Bacillus licheniformis) 八〔〔〔10146,沼澤紅假單胞菌（拙〇(1〇93日11(1〇111〇]1日8 9日11131：1'13)4〔〔〔10649，植物乳桿菌 化actobacillus planta;rum)ACCC10141 和鼠李糖乳桿菌化actobacillus rhamnosus) ACCC10534等并與巧樣、黃巧水提液混合組成，其中植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌是主打菌， 巧樣、黃巧的水提液主成分是多糖。所有菌種均購(gòu)于中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中屯、 (ACCC)，也是農(nóng)業(yè)部2045號(hào)公告（2013)允許在飼料添加劑中使用的益生菌菌種。巧樣購(gòu)于 我國(guó)巧樣主產(chǎn)地-四川安岳縣，黃巧購(gòu)于黃巧主產(chǎn)地-安徽毫州。
[0030] -種抗病毒抗病菌取代抗生素的禽畜腸道生態(tài)修復(fù)菌劑的制備方法，將各菌種分 別接種于相應(yīng)的滅菌培養(yǎng)基中進(jìn)行活化、制備一級(jí)種子液，二級(jí)、Ξ級(jí)采用相近、共生的原 貝1J，把2株酵母、3株細(xì)菌、2株乳酸菌混合擴(kuò)大培養(yǎng)，將經(jīng)過(guò)Ξ級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)菌液、混合、吸附于 滅菌麥教-米慷上，再經(jīng)過(guò)固體發(fā)酵，最后低溫干燥制得固體菌劑。其中兩株乳酸菌的二級(jí)、 Ξ級(jí)混合擴(kuò)大培養(yǎng)液中含有巧樣+黃巧的水提取液。具體步驟如下：
[0031] 1)將冰箱冷藏保存的各斜面菌種活化后，分別單獨(dú)經(jīng)搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)制成一級(jí)種子 液;所述活化后的每菌種一級(jí)種子液的培養(yǎng)基分別是:枯草芽胞桿菌、地衣芽抱桿菌與沼澤 紅假單胞菌的培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白腺培養(yǎng)基[配方(wt%):牛肉膏0.5-0.8%，蛋白腺1.Ο? ι. 5 % ， 氯化鋼 0.5-0.8 % ， 余量水， pH值 7.0-7.2] 。釀酒酵母與產(chǎn)航假絲酵母的培養(yǎng)基為 PDA (制備方法:取去皮馬鈴馨200-250克，切成小塊(片），加水1000毫升煮沸30min，Ξ層紗布過(guò) 濾，濾液補(bǔ)足至1000毫升，加入20-25克葡萄糖，溶化后115°C滅菌30min)。植物乳桿菌與鼠 李糖乳桿菌的培養(yǎng)基為MRS[配方(wt % ):牛肉膏1.0-1.5 %，蛋白腺1.0-1.5%，酵母膏0.5- 0.8 %，薦糖3.0-3.5 %，醋酸鋼0.5-0.8 %，憐酸氨二鐘0.2-0.5 %，巧樣酸錠0.2-0.5 %，硫 酸儀0.05-0.1 %，硫酸儘0.005-0.01 %，碳酸巧0.3-0.5 %，吐溫-80 1毫升/100毫升，余量 為水，pH 值 6.2-6.4]。
[0032] 2)將上述各菌種一級(jí)種子液分別在相應(yīng)的滅菌培養(yǎng)液內(nèi)進(jìn)行二級(jí)混合擴(kuò)大培養(yǎng) 制成二級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)液。
[0033] 枯草芽胞桿菌、地衣芽抱菌及沼澤紅假單胞菌二級(jí)混合擴(kuò)大培養(yǎng)條件是:培養(yǎng)基 配方(wt%):牛肉膏1.0-1.5%，蛋白腺2.0-2.5%，酵母膏0.2-0.5%，薦糖0.5-1.0%，氯化 鋼1.0-1.5 %，pH值7.0-7.2，余量為水。
[0034] 接種量各為5-lOwt%、溫度37±rC、攬拌速度150-200r/min、壓力0.05MPa，培養(yǎng) 時(shí)間 15-20h.
[0035] 釀酒酵母與產(chǎn)航假絲酵母的二級(jí)混合培養(yǎng)條件是：培養(yǎng)基配方(wt%):酵母膏 1.0-1.5%，薦糖 3.0-5.0%，蛋白腺 1.0-2.0%，牛肉膏 0.5-1.0%，pH 值 7.2-7.4,余量為水。 接種量各為5-lOwt %，溫度30 ± rC，攬拌速度200-250r/min、壓力0.05MPa，培養(yǎng)時(shí)間20- 2地。
[0036] 植物乳桿菌與鼠李糖乳桿菌二級(jí)混合擴(kuò)大培養(yǎng)：
[0037] a.鮮巧樣+黃巧粉的水提取液的制備:按質(zhì)量份數(shù)，稱取鮮巧樣10份，絞粹，與黃巧 粉10份加入不誘鋼提取鍋內(nèi)，加入100份水，加熱至90-100°C浸煮30π?η，Ξ層紗布過(guò)濾，浸 煮2次，合并濾液，得到巧樣、黃巧水提取液；
[003引 6.按質(zhì)量百分比(*1%):牛肉膏1.0-1.5%,蛋白腺1.0-1.5%,酵母膏0.5-0.8%， 薦糖3.0-3.5%，醋酸鋼0.5-1.0%，憐酸氨二鐘0.2-0.4%，巧樣酸錠0.2-0.5%，硫酸儀 0.05-0.1 %，硫酸儘0.005-0.01 %，碳酸巧0.3-0.5 %，吐溫-80:1毫升/100毫升，余量為步 驟a中制備的巧樣、黃巧水提取液，pH值6.2-6.4;
[0039] 二級(jí)混合培養(yǎng)條件:接種量5-lOwt%，靜止培養(yǎng)，50-100r/min每小時(shí)間歇攬拌2- 5min，溫度控制30 ± rC，培養(yǎng)時(shí)間20-24h。
[0040] 3)將上述各菌的二級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)液分別在相應(yīng)滅菌培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行Ξ級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)制 成Ξ級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)液。
[0041] 枯草芽胞桿菌、地衣芽胞桿菌及沼澤紅假單胞菌Ξ級(jí)混合培養(yǎng)條件是:培養(yǎng)基配 方同二級(jí)，接種量5-lOwt%、溫度37±rC、pH值7.0-7.2、攬拌速度150-20化/111111、壓力 0.05MPa，培養(yǎng)時(shí)間 18-20h;
[0042] 釀酒酵母與產(chǎn)航假絲酵母擴(kuò)大培養(yǎng)條件是:培養(yǎng)基配方同二級(jí)，溫度30 ± rC，pH 值7.2-7.4、攬拌速度 200-250r/min、壓力 0.05MPa，培養(yǎng)時(shí)間 20-24h。
[0043] 植物乳桿菌與鼠李糖乳桿菌擴(kuò)大培養(yǎng):培養(yǎng)基配方同二級(jí)，培養(yǎng)條件:接種量5- lOwt%、靜止培養(yǎng)，50-10化/min每小時(shí)間歇攬拌2-5min，溫度控制30±rC，培養(yǎng)時(shí)間20- 2地，發(fā)酵終止時(shí)抑值3.8-4.1
[0044] 4)將上述屯菌種的Ξ級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)液，按1:1:1等體積混合均勻，得到菌劑混合液， 調(diào)整pH值3.8-4.1W增加菌液的穩(wěn)定性。
[0045] 5)將上述菌劑混合液噴灑于滅菌麥教上，邊噴灑邊攬拌，使菌液均勻地吸附于麥 教-米慷上。
[0046] 6)在固體發(fā)酵罐內(nèi)，控制含水率50-60%，30-40°C下發(fā)酵20-24h,
[0047] 再經(jīng)過(guò)低溫40-45°C干燥，控制菌劑含水率在8-10 %，制得固體菌劑。固體菌劑有 效活性菌總菌落數(shù)>2.0-3.0*l〇WCFU/g，2株乳酸菌總菌落數(shù)> 1.0-1.8*l〇WCFU/g，3株細(xì) 菌總菌落數(shù) >0.5-0.6*l〇iDCFU/g，2 株酵母總菌落數(shù) >0.5-0.6*l〇iDCFU/g。
[0048] 7)將制成的固體菌劑密封于內(nèi)襯聚乙締的包裝袋內(nèi)，室溫保存，防潮、防暴曬。存 放于陰涼干燥處。防止霉菌污染。
[0049] 所述的修復(fù)菌劑的有效活性菌總菌落數(shù)2.〇-3.0*1〇1<^〔。11/肖，其中釀酒酵母 (5日。油日1'〇1117。6 3。6'6￥131日6)4〔撕20037和產(chǎn)航假絲酵母（化]1(11(13 111:;[113)4〔〔〔20060為 0.5-0.6*l0iDCFU/g，枯草芽抱桿菌（Bacillus subtil is )ACCC10114+地衣芽抱桿菌 (Bacillus licheniformis)ACCC10146+沼澤紅假單胞菌（lihodopseudomonas palustris) ACCC10649為0.5-0.6*l0i°CFU/g，植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum)ACCC10141+鼠李 糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus)ACCC10534為 1.0-1.8*l0i日CFU/g。
[0050] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明：
[0化1]實(shí)施例1
[0052] -種抗病毒抗病菌取代抗生素的禽畜腸道生態(tài)修復(fù)菌劑，包括釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)ACCC20037、產(chǎn)航假絲酵母（Candida util is)ACCC20060、枯 草芽抱桿菌（Bacillus subtil is )ACCC10114,地衣芽抱桿菌（Bacillus licheniformis) 八〔〔〔10146、沼澤紅假單胞菌（拙〇(1〇93日11(1〇111〇]1日8 9日11131：1'13)4〔〔〔10649、植物乳桿菌 化actobacillus planta;rum)ACCC10141 和鼠李糖乳桿菌化actobacillus rhamnosus) ACCC10534。并含有巧樣、黃巧的水提成分(主成分是多糖）。所有菌種均購(gòu)于中國(guó)農(nóng)業(yè)微生 物菌種保藏管理中屯、(ACCC)，也是農(nóng)業(yè)部允許在飼料添加劑中使用的益生菌菌種。無(wú)毒、無(wú) 害、無(wú)副作用。
[0053] 所述禽畜腸道生態(tài)修復(fù)菌劑的制備方法，將各菌種分別接種于相應(yīng)的滅菌培養(yǎng)基 中進(jìn)行活化、制備一級(jí)種子液;再經(jīng)過(guò)二級(jí)、Ξ級(jí)混合液體擴(kuò)大培養(yǎng)，將擴(kuò)大培養(yǎng)的菌液吸 附于滅菌麥教-米慷上，再經(jīng)過(guò)固體發(fā)酵、低溫干燥制得固體菌劑，具體步驟如下：
[0054] 1)將冰箱冷藏保存的各斜面菌種活化后，分別經(jīng)試管、搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)制成各菌的 一級(jí)種子液(各700毫升）；
[0055] 枯草芽胞桿菌、地衣芽抱桿菌與沼澤紅假單胞菌的培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白腺培養(yǎng) 基，按質(zhì)量百分比：牛肉膏0.5-0.8%，蛋白腺1.0-1.5%，氯化鋼0.5-0.8%，余量為水，pH值 7.0-7.2；
[0056] 釀酒酵母與產(chǎn)航假絲酵母的培養(yǎng)基為PDA,制備方法:按質(zhì)量份數(shù)，取去皮馬鈴馨 200-250份，切成小塊，加水1000份煮沸30min，Ξ層紗布過(guò)濾，濾液補(bǔ)足至1000份，加入20- 25份葡萄糖，溶化后115 °C滅菌30min;
[0057] 植物乳桿菌與鼠李糖乳桿菌的培養(yǎng)基為MRS,按質(zhì)量百分比：牛肉膏1.0-1.5%，蛋 白腺1.0-1.5%，酵母膏0.5-0.8%，薦糖3.0-3.5%，醋酸鋼0.5-0.8%，憐酸氨二鐘0.2- 0.5 %，巧樣酸錠0.2-0.5 %，硫酸儀0.05-0.1 %，硫酸儘0.005-0.01 %，碳酸巧0.3-0.5 %， 吐溫-80每100毫升培養(yǎng)基加1毫升，余量為水，pH值6.2-6.4。
[005引2)將上述各菌種一級(jí)種子液分別在無(wú)菌培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行二級(jí)混合擴(kuò)大培養(yǎng)制成二 級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)液，枯草芽胞桿菌、地衣芽胞桿菌和沼澤紅假單胞菌二級(jí)混合培養(yǎng)條件是:培養(yǎng) 基配方(wt%):牛肉膏1 %，蛋白腺2%，酵母膏0.2%，薦糖0.5%，氯化鋼1 %。接種量各為 700毫升、溫度37± rC、pH值7.0-7.2、攬拌速度lOOr/min、壓力0.05MPa，培養(yǎng)時(shí)間1她.
[0059] 釀酒酵母與產(chǎn)航假絲酵母的二級(jí)混合培養(yǎng)條件是：培養(yǎng)基配方(wt%):酵母膏 1 %，薦糖3 %，蛋白腺1 %，牛肉膏0.5 %，抑值7.2-7.4，接種量各700毫升，溫度30 ± rC，攬 拌速度150r/min、壓力0.05MPa，培養(yǎng)時(shí)間2地。
[0060] 植物乳桿菌與鼠李糖乳桿菌二級(jí)混合擴(kuò)大培養(yǎng)：
[0061] a、巧樣+黃巧粉的水提取液的制備:稱取鮮巧樣10kg，絞粹，與黃巧粉10kg加入不 誘鋼提取鍋內(nèi)，加入100升水，加熱至90-100°C浸煮30min，Ξ層紗布過(guò)濾，浸煮2次，合并濾 液為巧樣+黃巧粉水提液。
[0062] b、按質(zhì)量百分比(wt%):牛肉膏1.5%，蛋白腺1.5%，酵母膏0.8%，薦糖3.5%，醋 酸鋼1.0%，憐酸氨二鐘0.3%，巧樣酸錠0.5%，硫酸儀0.05%，硫酸儘0.01 %，碳酸巧 0.5 %，吐溫-80:1毫升/100毫升，余量為步驟a中制備的巧樣+黃巧水提取液，pH值6.2-6.4; 混合培養(yǎng)條件:接種量各700毫升，靜止培養(yǎng)，lOOr/min每小時(shí)間歇攬拌2-5min，溫度控制37 ±1°(：，培養(yǎng)時(shí)間22}1。
[0063] 3)將上述各菌種二級(jí)混合培養(yǎng)液分別在相應(yīng)滅菌培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行Ξ級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)制 成Ξ級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)液。
[0064] 枯草芽胞桿菌、地衣芽胞桿菌及沼澤紅假單胞菌Ξ級(jí)混合培養(yǎng)條件是:培養(yǎng)基配 方同二級(jí)，接種lOwt%、溫度37±rC、pH值7.0-7.2、攬拌速度15化/111111、壓力0.051?日，培養(yǎng) 時(shí)間 18-20h;
[0065] 釀酒酵母與產(chǎn)航假絲酵母Ξ級(jí)混合擴(kuò)大培養(yǎng)條件是:培養(yǎng)基配方同二級(jí)，接種量 lOwt %，溫度30 ± rC .攬拌速度200r/min，培養(yǎng)時(shí)間2地。
[0066] 植物乳桿菌與鼠李糖乳桿菌混合擴(kuò)大培養(yǎng):培養(yǎng)基配方同二級(jí)，培養(yǎng)條件:接種量 lOwt %，靜止培養(yǎng)，50-100r/min每小時(shí)間歇攬拌2-5min，溫度控制37 ± rC，培養(yǎng)時(shí)間22h. 發(fā)酵終止時(shí)調(diào)整pH值3.8-4.1W增加菌液的穩(wěn)定性。
[0067] 4)將上述屯菌種的Ξ級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)液，按1:1:1等體積混合均勻，得到菌劑混合液；
[0068] 5)將上述菌劑混合液噴灑于滅菌麥教-米慷上，邊噴灑邊攬拌，使菌液均勻地吸附 于滅菌麥教-米慷上。
[0069] 6)再經(jīng)過(guò)固體發(fā)酵、低溫干燥制得固體菌劑。固體發(fā)酵的條件：接種量(wt%) 50 %，罐體溫度40-45 °C，發(fā)酵2地.控溫40-45 °C，干燥20-24h，控制含水率9 %。
[0070] 7)將制成的固體菌劑密封于內(nèi)襯聚乙締膜的包裝袋內(nèi)，室溫保存，防潮、防暴曬。 存放于陰涼干燥處，防止霉菌污染。保質(zhì)期12個(gè)月。
[0071] 該實(shí)施例制備的固體菌劑的測(cè)定。
[0072] 1、質(zhì)量控制指標(biāo)
[0073] 含水率(105°C恒重法)8-10%pH值4.1-5.5有效活性菌總菌落數(shù)>2.5*1〇1咐^/邑， 乳酸菌總菌落數(shù)>1.5*1〇1化即/g，釀酒酵母與產(chǎn)航假絲酵母總菌落數(shù)>0.5*1〇1化即/g，枯 草芽抱桿菌+地衣芽抱桿菌+沼澤紅假單胞菌總菌落數(shù)>〇.5*l〇WCRJ/g。
[0074] 2、養(yǎng)豬場(chǎng)試驗(yàn)效果
[0075] 地點(diǎn):河南尉氏縣某生豬養(yǎng)殖場(chǎng)
[0076] 試驗(yàn)設(shè)計(jì):35日齡仔豬42頭，平均體重7.80kg.隨機(jī)分為對(duì)照組和試驗(yàn)組，每組設(shè)3 個(gè)平行組，每組7頭仔豬。對(duì)照組飼喂仔豬全日糧，免疫程序照舊，自由飲水;試驗(yàn)組在飼喂 仔豬全日糧基礎(chǔ)上，平均每日每頭仔豬添加2克益生菌菌劑，充分混合于飼料(去除抗生素、 脫霉劑、甜味劑的全日糧），不參加免疫程序，其他條件與對(duì)照組完全相同，自由飲水。
[0077] 試驗(yàn)結(jié)果:見(jiàn)表1
[0078] 表1各項(xiàng)測(cè)定指標(biāo)比較
[0079]
[0080] 結(jié)論
[OOW] 試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，料肉比降6.64%，腹瀉率降低98.04%，死淘率降低 83.76%，效果顯著。另外，從對(duì)2周后糞樣檢測(cè)結(jié)果看，對(duì)照組糞樣中仍有大量霉菌，達(dá)5.8* 105CFU/g(58萬(wàn)），而乳酸菌也僅有1.35*105CFU/g，而試驗(yàn)組的霉菌菌僅有290個(gè)，乳酸菌達(dá) 到1.36*106CFU/g，是對(duì)照組的10倍之多。說(shuō)明試驗(yàn)組仔豬腸道菌群調(diào)整到位，乳酸菌占到 優(yōu)勢(shì)，腸道菌群趨于生態(tài)平衡。
[0082]本發(fā)明是益生菌+中藥的腸道生態(tài)修復(fù)菌劑，利用黃巧中的多糖，巧樣中的巧樣 素、多糖W及各益生菌所產(chǎn)胞外多糖，達(dá)到調(diào)整禽畜腸道菌群生態(tài)平衡，提高機(jī)體免疫力， 抗病毒抗病菌的目的。通過(guò)大量試驗(yàn)證實(shí)益生菌+中藥的菌劑，可W明顯提高機(jī)體免疫力， 使腸道的霉菌、大腸桿菌等顯著減少，而乳酸菌(有益菌類)顯著增多。禽畜的呼吸道疾病和 腸道疾病大大降低，料肉比降低，提高飼料報(bào)酬，生產(chǎn)性能提高。完全可W替代抗生素。菌劑 中所用菌種都是國(guó)家農(nóng)業(yè)部2045號(hào)公告（2013)所允許使用的益生菌。所用中藥-黃巧是國(guó) 家Ξ類獸藥。另外，所用的巧樣全果是公認(rèn)的可直接食用的鮮果（四川安岳巧樣生產(chǎn)基地）。 制劑生產(chǎn)過(guò)程中都是采用不誘鋼設(shè)備和玻璃制品制備，不會(huì)引入有毒、有害物質(zhì)，安全可 靠。整個(gè)生產(chǎn)過(guò)程中因都是用電加熱，沒(méi)有"Ξ廢"產(chǎn)生。
[0083] W上所述的實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)思想及特點(diǎn)，其目的在于使人能夠理 解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)W實(shí)施，不能僅W本實(shí)施例來(lái)限定本發(fā)明的專利范圍，即凡本發(fā)明所 掲示的設(shè)計(jì)思路所作的同等變化或修飾，仍屬于本發(fā)明的專利范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種抗病毒抗病菌取代抗生素的禽畜腸道生態(tài)修復(fù)菌劑，其特征在于，包括釀酒酵 母（3&。。11&1'〇1115^68。6代￥丨8丨&6)厶〇(^20037、產(chǎn)|]元假絲酵母（〇&11(1丨(1&111:;[1丨8從〇〇〇20060、 枯草芽抱桿菌(Bacillus subtil is )ACCC10114，地衣芽抱桿菌(Bacillus licheniformis) ACCC10146、沼澤紅假單胞菌（Rhodopseudomonas palustris)ACCC10649、植物乳桿菌 (Lactobaci 1 lus plantarum)ACCC10141 和鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus) ACCC10534。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗病毒抗病菌取代抗生素的禽畜腸道生態(tài)修復(fù)菌劑，其特征 在于，還包括檸檬、黃芪的水提物。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗病毒抗病菌取代抗生素的禽畜腸道生態(tài)修復(fù)菌劑，其特 征在于，所述的修復(fù)菌劑的有效活性菌總菌落數(shù)2.0-3.0*10 1()CFU/g，其中釀酒酵母 (3已(^11&1'〇1115^6 8〇6代￥181&6從(^〇20037和產(chǎn)|]元假絲酵母(〇&11(11(1&111:;[118從〇(^20060為 0.5-〇.6*101QCFU/g，枯草芽抱桿菌（Bacillus subtilis)ACCC10114+地衣芽抱桿菌 (Bacillus licheniformis)ACCC10146+沼澤紅假單胞菌（Rhodopseudomonas palustris) ACCC10649為0.5-0.6*101QCFU/g，植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum)ACCC10141+鼠李 糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus)ACCC10534為1.0-1.8*101QCFU/g〇4. 一種如權(quán)利要求1所述抗病毒抗病菌取代抗生素的禽畜腸道生態(tài)修復(fù)菌劑的制備方 法，其特征在于，將各菌種分別單獨(dú)活化，接種于相應(yīng)的滅菌培養(yǎng)基中進(jìn)行一級(jí)種子液擴(kuò)大 培養(yǎng)，在二級(jí)、三級(jí)發(fā)酵時(shí)按照相近與共生的原則，將2株酵母混合發(fā)酵，3株細(xì)菌混合發(fā)酵， 2株乳酸菌混合發(fā)酵，再將三者混合擴(kuò)大培養(yǎng)菌液按1:1:1等體積混合后吸附于滅菌麥麩-米糠上，再經(jīng)過(guò)固體發(fā)酵階段，最后低溫干燥，制得固體菌劑，具體步驟如下： 1) 將冰箱冷藏保存的各斜面菌種分別單獨(dú)活化后，分別經(jīng)搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)制成一級(jí)種子 液； 2) 將上述各菌種的一級(jí)種子液分別在滅菌培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行二級(jí)混合擴(kuò)大培養(yǎng)制成二級(jí) 擴(kuò)大培養(yǎng)液： 產(chǎn)朊假絲酵母與釀酒酵母的二級(jí)混合培養(yǎng)條件是：接種量各為5-lOwt%、溫度30±1 °C、攪拌速度200-250r/min、壓力0.05MPa，培養(yǎng)時(shí)間20-24h，培養(yǎng)基配方，按質(zhì)量百分比：酵 母膏 1.0-1.5%，蔗糖 3.0-5.0%，蛋白胨 1.0-2.0%，牛肉膏 0.5-1.0%，ρΗ 值 7.2-7.4,余量 為水； 枯草芽胞桿菌、地衣芽孢桿菌和沼澤紅假單胞菌二級(jí)混合培養(yǎng)條件是:接種量各為5-10wt%、溫度37±1°C、攪拌速度100_150r/min、壓力0.05MPa，培養(yǎng)時(shí)間15-20h，培養(yǎng)基配 方，按質(zhì)量百分比：牛肉膏1.0-1.5%，蛋白胨2-2.5%，酵母膏0.2-0.5%，蔗糖0.5-1.0%， 氯化鈉1.0-1.5 %，pH值7.0-7.2，余量為水； 植物乳桿菌與鼠李糖乳桿菌的一級(jí)種子液在滅菌培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行二級(jí)混合擴(kuò)大培養(yǎng)制 成二級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)液，培養(yǎng)條件是:接種量各為5-10wt %，靜止培養(yǎng)，50-100r/min每小時(shí)間歇 攪拌2-5min，溫度控制30-37°C，培養(yǎng)時(shí)間20-24h，培養(yǎng)基制備： a. 鮮檸檬+黃芪粉的水提取液的制備:按質(zhì)量份數(shù)，稱取鮮檸檬10份，絞粹，與黃芪粉10 份加入到不銹鋼提取鍋內(nèi)，加入100份水，加熱至90-100°C浸煮30min，三層紗布過(guò)濾，浸煮2 次，合并濾液，得到檸檬、黃芪水提取液； b. 按質(zhì)量百分比：牛肉膏1.0-1.5%，蛋白胨1.0-1.5%，酵母膏0.5-0.8%，蔗糖3.0- 3.5 %，醋酸鈉0.5-1.0 %，磷酸氫二鉀0.2-0.4 %，檸檬酸銨0.2-0.5 %，硫酸鎂0.05-0.1 %， 硫酸錳0.005-0.01 %，碳酸鈣0.3-0.5%，吐溫-80:1毫升/100毫升，余量為步驟a中制備的 檸檬、黃芪水提取液，pH值6.2-6.4; 3) 將上述各菌的二級(jí)混合擴(kuò)大培養(yǎng)液分別在滅菌培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行三級(jí)混合擴(kuò)大培養(yǎng)制 成三級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)液： 產(chǎn)朊假絲酵母與釀酒酵母三級(jí)混合擴(kuò)大培養(yǎng)條件是：接種量5-lOwt%、溫度30 土 TC、 pH值7 · 2-7 · 4、攪拌速度200-250r/min、壓力0 · 05MPa，培養(yǎng)時(shí)間20-24h，培養(yǎng)基同二級(jí)； 枯草芽胞桿菌、地衣芽孢桿菌和沼澤紅假單胞菌三級(jí)混合擴(kuò)大培養(yǎng)條件是:接種量5-1(^七％、溫度37±1°(：4!1值7.0-7.2、攪拌速度150-20(^/1^11、壓力0.051〇^，培養(yǎng)時(shí)間18-20h，培養(yǎng)基同二級(jí)； 植物乳桿菌與鼠李糖乳桿菌三級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng):接種量5-lOwt %，靜止培養(yǎng)，50-100r/min 每小時(shí)間歇攪拌2-5min，溫度控制30-37 °C，培養(yǎng)時(shí)間20-24h，發(fā)酵終止時(shí)調(diào)整pH值3.8-4.1以增加乳酸菌的穩(wěn)定性，培養(yǎng)基同二級(jí)； 4) 將上述三類混合菌的三級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)液，按1:1:1等體積混合均勻，得到菌劑混合液； 5) 將上述菌劑混合液按照質(zhì)量比0.5 :1噴灑于滅菌麥麩-米糠上，邊噴灑邊攪拌，使菌 液均勻地吸附、固化于麥麩-米糠上，經(jīng)過(guò)固體發(fā)酵、低溫干燥，最后制得固體菌劑； 6) 將制成的固體菌劑密封于內(nèi)襯聚乙烯膜的包裝袋內(nèi)，室溫保存，防潮、防暴曬。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述抗病毒抗病菌取代抗生素的禽畜腸道生態(tài)修復(fù)菌劑的制備方 法，其特征在于，所述菌種活化方法是:把瓊脂斜面保存的各菌菌種從冰箱冷藏室取出，放 于超凈工作臺(tái)內(nèi)，在酒精燈火焰旁，分別轉(zhuǎn)接于瓊脂平板培養(yǎng)基上，在30-37 °C下培養(yǎng)20-30h后，平板上生長(zhǎng)出大大小小的菌落，再?gòu)钠桨迳暇渲刑羧尉滢D(zhuǎn)接于滅菌試管中的 培養(yǎng)液中。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述抗病毒抗病菌取代抗生素的禽畜腸道生態(tài)修復(fù)菌劑的制備方 法，其特征在于，所述步驟1)中活化后的每個(gè)菌種單獨(dú)擴(kuò)大培養(yǎng)的培養(yǎng)基分別是： 枯草芽胞桿菌、地衣芽孢桿菌與沼澤紅假單胞菌的培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，按 質(zhì)量百分比：牛肉膏0.5-0.8%，蛋白胨1.0-1.5%，氯化鈉0.5-0.8%，余量為水，pH值7.0-7.2； 釀酒酵母與產(chǎn)朊假絲酵母的培養(yǎng)基為PDA，制備方法：按質(zhì)量份數(shù)，取去皮馬鈴薯200-250份，切成小塊，加水1000份煮沸30min，三層紗布過(guò)濾，濾液補(bǔ)足至1000份，加入20-25份 葡萄糖，溶化后115°C滅菌30min; 植物乳桿菌與鼠李糖乳桿菌的培養(yǎng)基為MRS，按質(zhì)量百分比：牛肉膏1.0-1.5 %，蛋白胨 1.0-1.5 %，酵母膏0.5-0.8 %，蔗糖3.0-3.5 %，醋酸鈉0.5-0.8 %，磷酸氫二鉀0.2-0.5 %， 檸檬酸銨〇. 2-0.5 %，硫酸鎂0.05-0.1 %，硫酸錳0.005-0.01 %，碳酸鈣0.3-0.5 %，吐溫-80 每100毫升培養(yǎng)基加1毫升，余量為水，pH值6.2-6.4。7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述抗病毒抗病菌取代抗生素的禽畜腸道生態(tài)修復(fù)菌劑的制備方 法，其特征在于，所述步驟5)中在固體發(fā)酵罐內(nèi)，控制含水率50-60%，30-40°C下發(fā)酵20-24h，再經(jīng)過(guò)低溫40-45°C干燥，控制菌劑含水率在8-10%，制得固體菌劑，固體菌劑有效活 性菌總菌落數(shù)彡2.0-3.0*10 1()CFU/g，2株乳酸菌總菌落數(shù)彡1.0-1.8*101()CFU/g，3株細(xì)菌總 菌落數(shù)多 0 · 5-0 · 6*101QCFU/g，2 株酵母總菌落數(shù)多 0 · 5-0 · 6*101QCFU/g。
【文檔編號(hào)】C12R1/01GK106011001SQ201610344955
【公開(kāi)日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年5月23日
【發(fā)明人】張清敏
【申請(qǐng)人】天津蕾檬佰翱科技發(fā)展有限公司