構(gòu)建測(cè)序文庫的方法及裝置的制造方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了構(gòu)建測(cè)序文庫的方法及裝置，所述方法包括：(a)在RNA分子的3’端連接第一接頭，以便獲得第一連接產(chǎn)物；(b)在第一連接產(chǎn)物的5’端連接第二接頭，以便獲得第二連接產(chǎn)物；(c)對(duì)第二連接產(chǎn)物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以便獲得反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；(d)利用一對(duì)PCR引物對(duì)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增，以便獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，其中，一對(duì)PCR引物之一含有鏈霉親和素；(e)從PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分離單鏈DNA分子；以及(f)將單鏈DNA分子進(jìn)行環(huán)化處理，以便獲得環(huán)化產(chǎn)物，環(huán)化產(chǎn)物構(gòu)成測(cè)序文庫。該方法可有效用于RNA分子測(cè)序文庫構(gòu)建，操作簡單、效果好，具有較高的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。
【專利說明】
構(gòu)建測(cè)序文庫的方法及裝置
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及構(gòu)建測(cè)序文庫的方法及裝置。
【背景技術(shù)】
[0002] 小分子RNA(small RNA)是生物體內(nèi)一類長度在18~30nt的RNA分子，主要包括 miRNA、siRNA和piRNA。Small RNA能夠調(diào)控基因的表達(dá)，在細(xì)胞的生長、發(fā)育、代謝等基礎(chǔ) 生物學(xué)過程中扮演著重要的角色，甚至在癌癥等相關(guān)疾病形成過程中起著關(guān)鍵的作用。
[0003] 目前隨著二代高通量測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展，小分子RNA測(cè)序技術(shù)也日趨成熟。 通常小分子RNA樣品制備方法主要基于連接法，但是該方法在在連接過程中為了提高連接 效率會(huì)投入過量的接頭，這些過量的接頭會(huì)給后續(xù)反應(yīng)帶來很多困擾。另外，現(xiàn)有技術(shù)構(gòu)建 的小分子RNA文庫都是雙鏈線性的文庫，這種線性文庫不能用于Complete Genomcis測(cè)序 平臺(tái)。目前，對(duì)于小分子RNA測(cè)序中單鏈環(huán)狀文庫的構(gòu)建方法還是空白，沒有文獻(xiàn)和專利報(bào) 道過這種方法?，F(xiàn)有NGS測(cè)序平臺(tái)提供的小分子RNA標(biāo)準(zhǔn)方法建庫效果不錯(cuò)，但是并不適 合Complete Genomcis測(cè)序平臺(tái)。且小分子RNA標(biāo)準(zhǔn)建庫流程中需要經(jīng)過多步聚丙烯酰胺 膠電泳切膠純化去除過量的接頭，該方法雖然有效的去除了多余的接頭，但是需要多次切 膠回收，目的產(chǎn)物損耗嚴(yán)重，周期長，也不利于自動(dòng)化實(shí)現(xiàn)。此外，目前小分子RNA文庫構(gòu)建 方法通常是在PCR的引物上含有標(biāo)簽，PCR之后每個(gè)標(biāo)記上標(biāo)簽的樣品才能進(jìn)行混合測(cè)序。
[0004] 因而，目前關(guān)于小分子RNA樣品制備方法仍有待改進(jìn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決相關(guān)技術(shù)中的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的 一個(gè)目的在于提出一種操作簡單、成本低廉的構(gòu)建測(cè)序文庫的方法。
[0006] 在本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種構(gòu)建測(cè)序文庫的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí) 施例，該方法包括：(a)在RNA分子的3'端連接第一接頭，以便獲得第一連接產(chǎn)物；(b)在所 述第一連接產(chǎn)物的5'端連接第二接頭，以便獲得第二連接產(chǎn)物；（c)對(duì)所述第二連接產(chǎn)物 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以便獲得反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；（d)利用一對(duì)PCR引物對(duì)所述反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增，以 便獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，其中，所述一對(duì)PCR引物之一含有鏈霉親和素；（e)從所述PCR擴(kuò)增產(chǎn) 物分離單鏈DNA分子；以及（f)將所述單鏈DNA分子進(jìn)行環(huán)化處理，以便獲得環(huán)化產(chǎn)物，所 述環(huán)化產(chǎn)物構(gòu)成所述測(cè)序文庫。。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，該方法可有效用于RNA分子測(cè)序文庫構(gòu)建， 操作簡單、效果好，具有較高的穩(wěn)定性和可重復(fù)性，且結(jié)果真實(shí)可靠。另外，該方法可以用于 小分子RNA測(cè)序文庫構(gòu)建，且適用于Complete Genomcis測(cè)序平臺(tái)，同時(shí)也能適用于其它需 要單鏈環(huán)狀文庫的測(cè)序平臺(tái)。
[0007] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述RNA分子的長度18~30nt。
[0008] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述第一接頭和所述第二接頭至少之一中包含標(biāo)簽序列。
[0009] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述標(biāo)簽序列為選自SEQ ID NO. 1~SEQ ID N0. 8中的至 少之一。
[0010] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，步驟（a)和（b)是在相同容器中進(jìn)行的，其中，在步驟（a) 中采用過量的所述第一接頭，并且在進(jìn)行步驟（b)之前，向步驟（a)所得到的反應(yīng)產(chǎn)物中添 加特異性識(shí)別所述第一接頭的屏蔽序列，以便對(duì)剩余的所述第一接頭進(jìn)行屏蔽處理。
[0011] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述屏蔽序列包括雙鏈區(qū)和5'突出端，其中，所述5'突出 端能夠與所述第一接頭的至少一部分匹配。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，向步驟（a)所得到的反應(yīng)產(chǎn)物中添加特異性識(shí)別所述第一 接頭的屏蔽序列之前，預(yù)先對(duì)所述屏蔽序列進(jìn)行預(yù)處理，所述預(yù)處理包括：將含有所述屏蔽 序列和緩沖液的混合物置于95攝氏度下5分鐘，然后以0. 1攝氏度/秒的速率梯度降溫至 25攝氏度，所述緩沖液為含有0. 05M NaCl的0. 01M Tris-HCl溶液。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，從所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分離單鏈DNA分子進(jìn)一步包括：使所 述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與磁珠接觸，以便形成磁珠-DNA復(fù)合物，其中，所述磁珠上連接有鏈霉親和 素；將所述磁珠-DNA復(fù)合物與pH高于7的溶液接觸，以便獲得所述單鏈DNA片段。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述pH高于7的溶液為氫氧化鈉溶液。
[0015] 在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了一種針對(duì)RNA分子構(gòu)建測(cè)序文庫的裝置。根 據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該裝置包括：連接單元，所述連接單元用于依次在RNA分子的3'端連接 第一接頭，以便獲得第一連接產(chǎn)物；以及在所述第一連接產(chǎn)物的5'端連接第二接頭，以便 獲得第二連接產(chǎn)物；反轉(zhuǎn)錄單元，所述反轉(zhuǎn)錄單元用于對(duì)所述第二連接產(chǎn)物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以 便獲得反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；擴(kuò)增單元，所述擴(kuò)增單元用于利用一對(duì)PCR引物對(duì)所述反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn) 行擴(kuò)增，以便獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，其中，所述一對(duì)PCR引物之一含有鏈霉親和素；分離單元， 所述分離單元用于從所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分離單鏈DNA分子；以及環(huán)化單元，所述環(huán)化單元用 于將所述單鏈DNA分子進(jìn)行環(huán)化處理，以便獲得環(huán)化產(chǎn)物，所述環(huán)化產(chǎn)物構(gòu)成所述測(cè)序文 庫。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，利用本發(fā)明的該裝置，可以有效實(shí)施前面所述的構(gòu)建測(cè)序文庫的方法，用 于RNA分子測(cè)序文庫構(gòu)建，且操作簡單、效果好，成本低廉，且具有較高的穩(wěn)定性和可重復(fù) 性，結(jié)果真實(shí)可靠。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述RNA分子的長度18~30nt。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述第一接頭和所述第二接頭至少之一中包含標(biāo)簽序列。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述標(biāo)簽序列為選自SEQ ID NO. 1~SEQ ID N0. 8中的至 少之一。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，進(jìn)一步包括：屏蔽單元，所述屏蔽單元用于在所述第一連接 產(chǎn)物的5'端連接第二接頭之前，向所述連接單元中添加特異性識(shí)別所述第一接頭的屏蔽序 列，以便對(duì)剩余的所述第一接頭進(jìn)行屏蔽處理。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述屏蔽序列包括雙鏈區(qū)和5'突出端，其中，所述5'突出 端能夠與所述第一接頭的至少一部分匹配。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述屏蔽單元進(jìn)一步包括：預(yù)處理模塊，所述預(yù)處理模塊用 于在向所述連接單元中添加特異性識(shí)別所述第一接頭的屏蔽序列之前，預(yù)先對(duì)所述屏蔽序 列進(jìn)行預(yù)處理，所述預(yù)處理包括：將含有所述屏蔽序列和緩沖液的混合物置于95攝氏度下 5分鐘，然后以0. 1攝氏度/秒的速率梯度降溫至25攝氏度，所述緩沖液為含有0.05M NaCl 的 0. 01M Tris-HCl 溶液。
[0022] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述分離單元進(jìn)一步包括：吸附模塊，所述吸附模塊用于使 所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與磁珠接觸，以便形成磁珠-DNA復(fù)合物，其中，所述磁珠上連接有鏈霉親 和素；洗脫模塊，所述洗脫模塊用于使所述磁珠-DNA復(fù)合物與pH高于7的溶液接觸，以便 獲得所述單鏈DNA片段。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述pH高于7的溶液為氫氧化鈉溶液。
【附圖說明】
[0024] 圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，泡狀結(jié)構(gòu)示意圖；
[0025] 圖2顯示了根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，溫度條件（1)與三種緩沖溶液處理接頭屏蔽子 的電泳檢測(cè)結(jié)果；
[0026] 圖3顯示了根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，溫度條件（3)與緩沖溶液II和緩沖溶液III處 理接頭屏蔽子的電泳檢測(cè)結(jié)果；
[0027] 圖4顯示了根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，PCR產(chǎn)物10% PAGE電泳膠圖；以及
[0028] 圖5顯示了根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，構(gòu)建獲得的文庫用6%的TBE變性膠檢測(cè)電泳 圖。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例。下面描述的實(shí)施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā) 明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件的，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文 獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均 為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0030] 在本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種構(gòu)建測(cè)序文庫的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí) 施例，該方法包括以下步驟：
[0031] (a)在RNA分子的3'端連接第一接頭，以便獲得第一連接產(chǎn)物。
[0032] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述RNA分子的長度18~30nt。
[0033] (b)在所述第一連接產(chǎn)物的5'端連接第二接頭，以便獲得第二連接產(chǎn)物。
[0034] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述第一接頭和所述第二接頭至少之一中可以包含標(biāo)簽 序列。使用帶標(biāo)簽（Barcode)的接頭，在連接過程中可以將不同的樣品標(biāo)記上不同的 barcode，然后這些不同的連接產(chǎn)物能夠混合在一起進(jìn)行下游反轉(zhuǎn)錄、PCR擴(kuò)增、單鏈環(huán)化等 操作，不僅大幅度提高了通量，而且減少了反轉(zhuǎn)錄等下游反應(yīng)的成本。
[0035] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述標(biāo)簽序列為選自SEQ ID NO. 1~SEQ ID N0. 8中的至 少之一。
[0036] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，步驟（a)和（b)是在相同容器中進(jìn)行的，其中，在步驟（a) 中采用過量的所述第一接頭，并且在進(jìn)行步驟（b)之前，向步驟（a)所得到的反應(yīng)產(chǎn)物中添 加特異性識(shí)別所述第一接頭的屏蔽序列，以便對(duì)剩余的所述第一接頭進(jìn)行屏蔽處理。通過 接頭屏蔽試劑屏蔽過量的第一接頭，可以使得步驟（a)和（b)在同一個(gè)容器中進(jìn)行，不僅可 以簡化多步切膠純化的步驟，縮短文庫構(gòu)建的周期，且大大降低了文庫構(gòu)建的成本。
[0037] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述屏蔽序列包括雙鏈區(qū)和5'突出端，其中，所述5'突出 端能夠與所述第一接頭的至少一部分匹配。由此，能夠有效屏蔽過量的第一接頭，效果理 想。
[0038] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，向步驟（a)所得到的反應(yīng)產(chǎn)物中添加特異性識(shí)別所述第一 接頭的屏蔽序列之前，預(yù)先對(duì)所述屏蔽序列進(jìn)行預(yù)處理，所述預(yù)處理包括：將含有所述屏蔽 序列和緩沖液的混合物置于95攝氏度下5分鐘，然后以0. 1攝氏度/秒的速率梯度降溫至 25攝氏度，所述緩沖液為含有0. 05M NaCl的0. 01M Tris-HCl溶液。由此，能夠有效提高屏 蔽效率和屏蔽效果。
[0039] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，屏蔽序列和緩沖液的比例不受特別限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員 可以根據(jù)RNA分子、3'接頭等的用量等靈活選擇。
[0040] (c)對(duì)所述第二連接產(chǎn)物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以便獲得反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。在該步驟中，可以將 含有不同標(biāo)簽的第二連接產(chǎn)物混合在一起進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，不僅大幅度提高了通量，且進(jìn)一步 簡化操作、降低成本。
[0041] (d)利用一對(duì)PCR引物對(duì)所述反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增，以便獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，其中， 所述一對(duì)PCR引物之一含有鏈霉親和素。由此，有利于在后續(xù)步驟分離純化目標(biāo)產(chǎn)物。
[0042] (e)從所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分離單鏈DNA分子。
[0043] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，從所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分離單鏈DNA分子進(jìn)一步包括：使所 述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與磁珠接觸，以便形成磁珠 -DNA復(fù)合物，其中，所述磁珠上連接有鏈霉親和 素；將所述磁珠 -DNA復(fù)合物與pH高于7的溶液接觸，以便獲得所述單鏈DNA片段。由此， 能夠有效分離獲得單鏈DNA片段，操作簡單方便，且收率高，目標(biāo)產(chǎn)物損失小。
[0044] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述pH高于7的溶液為氫氧化鈉溶液。由此，有利于提高 分離效率。
[0045] (f)將所述單鏈DNA分子進(jìn)行環(huán)化處理，以便獲得環(huán)化產(chǎn)物，所述環(huán)化產(chǎn)物構(gòu)成所 述測(cè)序文庫。
[0046] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，在從所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分離單鏈DNA分子之前，可以預(yù)先對(duì) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離，以便獲得小分子RNA，由此，能夠快速有效地針對(duì)小分子RNA構(gòu) 建測(cè)序文庫。
[0047] 發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，該方法可有效用于RNA分子測(cè)序文庫構(gòu)建，操作簡單、效果好，具有 較高的穩(wěn)定性和可重復(fù)性，且結(jié)果真實(shí)可靠。另外，該方法可以用于小分子RNA測(cè)序文庫構(gòu) 建，且適用于Complete Genomcis測(cè)序平臺(tái)，同時(shí)也能適用于其它需要單鏈環(huán)狀文庫的測(cè)序 平臺(tái)。
[0048] 在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了一種針對(duì)RNA分子構(gòu)建測(cè)序文庫的裝置。根 據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該裝置包括：
[0049] 連接單元，所述連接單元用于依次在RNA分子的3'端連接第一接頭，以便獲得第 一連接產(chǎn)物；以及在所述第一連接產(chǎn)物的5'端連接第二接頭，以便獲得第二連接產(chǎn)物。
[0050] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述RNA分子的長度18~30nt。
[0051] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述第一接頭和所述第二接頭至少之一中包含標(biāo)簽序列。 使用帶標(biāo)簽（Barcode)的接頭，在連接過程中將不同的樣品標(biāo)記上不同的barcode,然后這 些不同的連接產(chǎn)物能夠混合在一起進(jìn)行下游反轉(zhuǎn)錄、PCR擴(kuò)增、單鏈環(huán)化等操作，不僅大幅 度提高了通量，而且減少了反轉(zhuǎn)錄等下游反應(yīng)的成本。
[0052] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述標(biāo)簽序列為選自SEQ ID NO. 1~SEQ ID N0. 8中的至 少之一。
[0053] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，進(jìn)一步包括：屏蔽單元，所述屏蔽單元用于在所述第一連接 產(chǎn)物的5'端連接第二接頭之前，向所述連接單元中添加特異性識(shí)別所述第一接頭的屏蔽序 列，以便對(duì)剩余的所述第一接頭進(jìn)行屏蔽處理。通過接頭屏蔽試劑屏蔽過量的接頭，可以連 接單元中進(jìn)行第一接頭和第二接頭的連接，能夠簡化多步切膠純化的步驟，不僅縮短了文 庫構(gòu)建的周期，且能夠大大降低文庫構(gòu)建的成本。
[0054] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述屏蔽序列包括雙鏈區(qū)和5'突出端，其中，所述5'突出 端能夠與所述第一接頭的至少一部分匹配。由此，能夠有效屏蔽過量的第一接頭，效果理 想。
[0055] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述屏蔽單元進(jìn)一步包括：預(yù)處理模塊，所述預(yù)處理模塊用 于在向所述連接單元中添加特異性識(shí)別所述第一接頭的屏蔽序列之前，預(yù)先對(duì)所述屏蔽序 列進(jìn)行預(yù)處理，所述預(yù)處理包括：將含有所述屏蔽序列和緩沖液的混合物置于95攝氏度下 5分鐘，然后以0. 1攝氏度/秒的速率梯度降溫至25攝氏度，所述緩沖液為含有0.05M NaCl 的0. 01M Tris-HCl溶液。由此，能夠有效提高屏蔽效率和屏蔽效果。
[0056] 反轉(zhuǎn)錄單元，所述反轉(zhuǎn)錄單元用于對(duì)所述第二連接產(chǎn)物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以便獲得反 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。在反轉(zhuǎn)錄單元中，可以將含有不同標(biāo)簽的第二連接產(chǎn)物混合在一起進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄， 不僅大幅度提高了通量，且進(jìn)一步簡化操作、降低成本。
[0057] 擴(kuò)增單元，所述擴(kuò)增單元用于利用一對(duì)PCR引物對(duì)所述反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增，以 便獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，其中，所述一對(duì)PCR引物之一含有鏈霉親和素。由此，有利于在后續(xù) 步驟分離純化目標(biāo)產(chǎn)物。
[0058] 分離單元，所述分離單元用于從所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分離單鏈DNA分子。
[0059] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述分離單元進(jìn)一步包括：吸附模塊，所述吸附模塊用于使 所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與磁珠接觸，以便形成磁珠-DNA復(fù)合物，其中，所述磁珠上連接有鏈霉親 和素；洗脫模塊，所述洗脫模塊用于使所述磁珠-DNA復(fù)合物與pH高于7的溶液接觸，以便 獲得所述單鏈DNA片段。由此，能夠有效分離獲得單鏈DNA片段，操作簡單方便，且收率高， 目標(biāo)產(chǎn)物損失小。
[0060] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述pH高于7的溶液為氫氧化鈉溶液。由此，有利于提高 分離效率。
[0061] 環(huán)化單元，所述環(huán)化單元用于將所述單鏈DNA分子進(jìn)行環(huán)化處理，以便獲得環(huán)化 產(chǎn)物，所述環(huán)化產(chǎn)物構(gòu)成所述測(cè)序文庫。
[0062] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以進(jìn)一步包括電泳分離單元，所述電泳分離單元用于在 從所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分離單鏈DNA分子之前，預(yù)先對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離，以便獲得 小分子RNA，由此，能夠快速有效地針對(duì)小分子RNA構(gòu)建測(cè)序文庫。
[0063] 發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，利用本發(fā)明的該裝置，可以有效實(shí)施前面所述的構(gòu)建測(cè)序文庫的方 法，用于RNA分子測(cè)序文庫構(gòu)建，且操作簡單、效果好，成本低廉，且具有較高的穩(wěn)定性和可 重復(fù)性，結(jié)果真實(shí)可靠。
[0064] 實(shí)施例1
[0065] 實(shí)驗(yàn)樣本來源：有標(biāo)準(zhǔn)品 universal human reference RNA(安捷倫）、human brain reference RNA(Ambion)
[0066] 按照如下實(shí)驗(yàn)步驟，進(jìn)行四組平行試驗(yàn)：
[0067] 1、3'接頭連接
[0068] 1)取總 RNA 1 μ g(1110ng/ μ 1,不小于 200ng/ μ 1),補(bǔ) RNase-free 水至 2· 5 μ 1 (不超過5 μ 1)，加入1 μ 1 10 μ M的腺苷?；?'接頭（3'接頭的序列為：5' -GTCTC CAGTCGAAGCCCGATCNNNNNNNNNNGAGCTTGTCT-3'（SEQ ID NO. 13)，其中，N 表示標(biāo)簽序列，標(biāo)簽 序列為SEQ ID NO. 1~SEQ ID N0. 8中的任意一種）。PCR儀中70°C變性2min。
[0069]
[0070] 2)在上步RNA及接頭的管中加入如下反應(yīng)混合液：
[0071]
[0072] 3)混勻離心后，PCR儀中25°C反應(yīng)2h。
[0073] 2、接頭屏蔽
[0074] 1)接頭屏蔽試劑包括3部分組成（核苷酸序列即接頭屏蔽子、緩沖溶液、經(jīng)過一定 的溫度條件處理），核苷酸序列可以為SEQ ID N0. 9~SEQ ID N0. 12中的任意一種，其包含 一段互補(bǔ)序列，在5'端突出一段序列與3'接頭全部序列互補(bǔ)配對(duì)或者部分序列互補(bǔ)配對(duì)， 在一定條件下形成一個(gè)泡狀結(jié)構(gòu)（泡狀結(jié)構(gòu)見圖1)。為了獲得穩(wěn)定的泡狀結(jié)構(gòu)，測(cè)試了 3 種不同緩沖溶液、3種不同溫度處理?xiàng)l件。
[0075]
[0076] 緩沖溶液1:1 X TE緩沖液ΡΗ7· 5
[0077] 緩沖溶液 Π:0· ΟδΜ NaCl、0. 01Μ Tris-HCl、0.1 mM EDTA
[0078] 緩沖溶液 111:0. 05M NaCl、0. 01M Tris-HCl
[0079] 溫度條件：（1)水浴95°C5min，關(guān)閉電源水浴自然降溫至室溫；（2)熱循環(huán)儀 95°C 5min，關(guān)閉電源自然降溫至室溫；（3)熱循環(huán)儀95°C 5min，0. 1°C /秒速率梯度降溫至 25。。。
[0080] 溫度條件（1)與三種緩沖溶液處理接頭屏蔽子的電泳檢測(cè)結(jié)果見圖2,其中，泳道 1為緩沖溶液II與溫度條件（1)處理的接頭屏蔽子，泳道2為緩沖溶液III與溫度條件（1) 處理的接頭屏蔽子，泳道3為緩沖溶液I與溫度條件（1)處理的接頭屏蔽子，泳道4為10bp DNA ladder。溫度條件（3)與緩沖溶液II和緩沖溶液III處理接頭屏蔽子的電泳檢測(cè)結(jié) 果見圖3,其中，泳道1為10bp DNA ladder，泳道2為緩沖溶液II與溫度條件（3)處理的 接頭屏蔽子，泳道3為緩沖溶液III與溫度條件（3)處理的接頭屏蔽子。由圖2和圖3可 知，緩沖溶液III和溫度條件（3)組合能夠獲得穩(wěn)定和單一的泡狀結(jié)構(gòu)，因此，選擇緩沖溶 液III和溫度條件（3)組合作為接頭屏蔽子進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
[0081] 2)在3'接頭連接完成的反應(yīng)管中加入接頭屏蔽試劑（SEQ ID NO. 11+緩沖溶液 II1+溫度條件（3)得到的30 μ Μ屏蔽試劑）1 μ 1，混勻離心。
[0082] 3)PCR儀中30°C 15min進(jìn)行反應(yīng)，使得過量的3'接頭被屏蔽，避免其與后面加入 的5'接頭連接。
[0083] 3、5'接頭連接
[0084] 1)取 1 μ 1 10 μ Μ 的 5' 接頭（5' 接頭的序列為：5' -UCCUAAGACCGCUUGGCCUCCGACU U-3'（SEQ ID NO. 14)，70°C變性2min，冰上冷卻lmin后加入經(jīng)接頭屏蔽試劑處理的反應(yīng)液。
[0085] 2)上步的反應(yīng)液中再加入下面的反應(yīng)混合液：
[0086]
[0087] 3)混勻離心后，PCR儀中20°C反應(yīng)lh。
[0088] 4、樣品混合（pooling)
[0089] 將8個(gè)不同標(biāo)簽的5'接頭連接連接產(chǎn)物樣品混合在一起，乙醇沉淀純化，最后溶 解于 10 μ 1 RNase-free 水。
[0090] 5、反轉(zhuǎn)錄
[0091] 1)上步反應(yīng)液中加入反應(yīng)混合液：
[0092]
[0093] 其中，0N0639具有SEQ ID N0. 15所示的序列，short反轉(zhuǎn)錄引物具有SEQ ID N0. 16 所示的序列。
[0094]
[0095] 2)反應(yīng)程序：
[0096]
[0097] 6、PCR
[0098] 1)取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物10 μ 1進(jìn)行PCR，配制PCR反應(yīng)混合液：
[0099]

[0100]
[0101] 其中0N0639具有SEQ ID NO. 15所示的序列，short反轉(zhuǎn)錄引物具有SEQ ID NO. 16 所示的序列，混勻后分為兩管進(jìn)行PCR，其中，引物0N0639含有生物標(biāo)記素。
[0102] 2) PCR儀中設(shè)置反應(yīng)程序：
[0103]
[0104] 7、10% PAGE 電泳分離 miRNA
[0105] 1)取10% TBE PAGE膠，卡好楔子加入緩沖液，拔出梳子，不用預(yù)電泳和沖洗膠孔。
[0106] 2)向每50μ 1的PCR產(chǎn)物中加10μ 1 6X加樣緩沖液（或10X)，分3個(gè)加樣孔 上樣；另取2 μ 1 20bp DNA梯狀標(biāo)志加樣于中間一孔。
[0107] 3) 180V電泳約30分鐘，溴酚藍(lán)跑到距下沿約1/5處，即可停止電泳。染膠4 - 5 分鐘。，10% TBE PAGE電泳膠圖見圖4,其中，實(shí)線箭頭所示為80~100bp目的片段大小，虛 線箭頭所示為67bp接頭自連片段大小，泳道1為10bp DNA ladder，泳道2、3分別為反轉(zhuǎn)錄 條件42攝氏度反應(yīng)30分鐘，70攝氏度反應(yīng)15分鐘后PCR產(chǎn)物，泳道4、5分別為反轉(zhuǎn)錄條 件48攝氏度反應(yīng)30分鐘，70攝氏度反應(yīng)15分鐘后PCR產(chǎn)物。由圖4可知，當(dāng)反轉(zhuǎn)錄條件 48攝氏度反應(yīng)30分鐘，70攝氏度反應(yīng)15分鐘時(shí)，獲得相對(duì)集中的目的產(chǎn)物，且接頭自連產(chǎn) 物明顯減少，非特異性擴(kuò)增得到有效控制。
[0108] 4)切下約85_97bp (80-100bp)的條帶，將切下的主帶膠塊置于0. 5ml已扎孔的離 心管（套在2ml離心管上），13600rpm離心2分鐘，使膠塊通過小孔擠成碎膠。
[0109] 5)在碎膠中加入200-300μ 1 1XNEB 2(NEB2是10X的，用前稀釋10倍），室溫 下混勻器或thermomixer上2小時(shí)，洗脫DNA。用TE或水代替IXNEB2也可以。
[0110] 6)將碎膠和緩沖液轉(zhuǎn)入Spin - X濾器，13600rpm離心2分鐘。
[0111] 7)向洗脫液中加入2 μ 1完全融化的糖原，20-30 μ 1 3M醋酸鈉（NaAC，NaAC的體 積=1/10倍的洗脫液體積），650-975 μ 1 100%乙醇（乙醇體積按照洗脫液的體積計(jì)算）。 混勻后-80°C放置30分鐘或更長，以提高回收效率，4°C 13600rpm離心30分鐘。
[0112] 8)離心后會(huì)見到白色沉淀，棄上清，再用700μ 1 70%或75%乙醇洗滌沉淀，晾 干，用30 μ 1 ΕΒ溶液溶解白色沉淀。
[0113] 9) qubit HS染料定量檢測(cè)濃度，每兩個(gè)8ρ〇〇1后的樣品取等量混合，總量不超過 150ng，進(jìn)行后續(xù)的單鏈分離及環(huán)化過程。
[0114] 8、單鏈分離
[0115] 在PCR的過程中，通過引物0N0639在PCR產(chǎn)物的一條鏈上的5'端引入了生物素 標(biāo)記，該生物素標(biāo)記能夠穩(wěn)定結(jié)合到鏈霉素磁珠上，并在強(qiáng)堿性條件下解離出不帶生物標(biāo) 記的一條鏈，獲得單鏈DNA分子，具體步驟如下：
[0116] a)將上述EB溶液溶解的DNA樣品補(bǔ)1 X TE至總體積為60 μ 1。
[0117] b)提前準(zhǔn)備以下試劑：鏈親和素磁珠，0. 3Μ 3-(Ν_嗎啉基）丙磺酸（MOPS)，0. 1Μ NaOH，其中0· 1M NaOH，鏈親和素磁珠需現(xiàn)配現(xiàn)用。
[0118] c)提前 15min 配制 0· 1M NaOH
[0119]
[0120] d)鏈親和素磁珠洗滌方法如下：
[0121] 1)每個(gè)樣品取30 μ 1鏈親和素磁珠：加入3-5倍體積的1 XBBB (磁珠結(jié)合緩沖液， 110mM Tris-HCl，200mM NaCl)，混勻后置于磁力架上靜止吸附，調(diào)整不粘管的方向，使得磁 珠在1 XBBB洗液中前后游動(dòng)，棄上清液后，重復(fù)上述操作一次，
[0122] 2)取出不粘管加入1倍體積（30 μ 1) 1 XBBB懸浮，混勻后室溫靜置。
[0123] e)向60 μ 1上述步驟7中獲得的產(chǎn)物樣品中加入20 μ 1 4ΧΒΒΒ混勻，然后轉(zhuǎn)移 到上步驟含有30 μ 1 1ΧΒΒΒ溶解的磁珠的不粘管中混勻，此110 μ 1混合物室溫下結(jié)合 15min，中間輕輕彈勻一次。
[0124] f)將上述不粘管磁力架放置3_5min，棄去上清液，用1ml的1 XBWB (磁珠洗滌緩 沖液，10mM Tris-HCl，40mM NaCl)洗滌2次，方法同鏈親和素磁珠的洗滌方法
[0125] g)向上述磁珠中加入26 μ 1 0. 1M NaOH，吹打混勻后放置10min，再置于磁力架上 3_5min，取上清到新的1. 5ml EP管中。
[0126] h)向上述1. 5ml EP管中加入13μ 1 0. 3M M0PS，混勻備用。
[0127] i)此步驟產(chǎn)物可以凍存于_20°C。
[0128] 9、環(huán)化
[0129] a)向上一步得到的39μ 1的樣品中加入2· 5μ 1的20μΜ 0N1587(0N1587具有SEQ ID Ν0· 17所示的序列）；
[0130] 0N1587 :5, -TCGAGCTTGTCTTCCTAAGACCGC-3，（SEQ ID Ν0· 17)
[0131] b)提前5分鐘準(zhǔn)備連接酶反應(yīng)混合液，配制如下：
[0132]
[0133]
[0134] c)將連接酶反應(yīng)混合液震蕩充分混勻，離心后，向已經(jīng)加入引物反應(yīng)混合液的EP 管中加入連接酶反應(yīng)混合液18. 5 μ 1，震蕩10s混勻，瞬時(shí)離心。
[0135] d)置于 PCR 儀中 37°C 孵育 1. 5h。
[0136] e)反應(yīng)完成后，取出5 μ 1樣品，待6 %變性膠電泳檢測(cè)，剩余的約55 μ 1體積，進(jìn) 入下一步酶反應(yīng)。
[0137] 10、酶切消化
[0138] a)提前5分鐘左右準(zhǔn)備引物反應(yīng)混合液，配制如下：
[0139]
[0140] b)將上述混合液震蕩充分混勻，離心后，向上一步得到的55 μ 1的樣品中分別加 入3. 8 μ 1的反應(yīng)混合液；
[0141] c)震蕩10s混勻離心，置于PCR儀中37°C孵育30min。
[0142] d)酶切30min完成后，向樣品中加入2. 5 μ 1 500mM EDTA終止酶反應(yīng)。
[0143] e)上述樣品轉(zhuǎn)移至一新的1. 5ml離心管，補(bǔ)水40μ 1，再加入10μ 1 NaAc，2y 1糖 原，300μ 1無水乙醇，混勻后-80°c沉淀30分鐘以上，4°C 13600rpm離心30分鐘，棄上清， 再用600 μ 1 70 %或75%乙醇洗滌沉淀。
[0144] f)室溫下晾干后用27 μ 1 ΤΕ回溶，分別得到測(cè)序文庫UHRR1、UHRR2、UHRR3和 UHRR4 ；
[0145] g)將最終得到產(chǎn)物用Qubit?ssDNA Assay Kit定量。
[0146] h)取5μ 1上述獲得的測(cè)序文庫樣品至PCR管中與5μ 1 2XTBE加樣緩沖液混勻， 同時(shí)取1. 5 μ 1低倍率sRNA梯（ladder，已與等體積的2 X RNA加樣緩沖液混合）到PCR管， 將樣品與ladder置于PCR儀中70°C變性2min，迅速轉(zhuǎn)移至冰上冷卻2min，再進(jìn)行6%的TBE 變性膠檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見圖5,其中，泳道1和2是單鏈環(huán)狀文庫，泳道3是低范圍ssRNA梯 (low range ssRNA ladder)〇
[0147] 11.測(cè)序方法和下機(jī)數(shù)據(jù)
[0148] 把上述步驟f)獲得的四組單鏈環(huán)狀文庫分別進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制，制備成DNA納米球
[0149] (DNB)，然后用復(fù)合探針-錨定分子連接（Combinatorial probe-anchor ligation，cPAL)方式進(jìn)行測(cè)序，得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，接頭自連比例在1. 1%以下，結(jié)果見 表1。
[0150] 表 1
[0151]
[0152] 從表1的結(jié)果可知，4個(gè)樣品的接頭自連比例控制在較低的水平，能有效的節(jié)約接 頭自連帶來數(shù)據(jù)浪費(fèi)。同時(shí)四個(gè)平行文庫結(jié)果顯示接頭自連比例波動(dòng)較小，該方法在控制 接頭自連作用穩(wěn)定重復(fù)性好。
[0153] 在本說明書的描述中，參考術(shù)語"一個(gè)實(shí)施例"、"一些實(shí)施例"、"示例"、"具體示 例"、或"一些示例"等的描述意指結(jié)合該實(shí)施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特 點(diǎn)包含于本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施例或示例中。在本說明書中，對(duì)上述術(shù)語的示意性表述不 必須針對(duì)的是相同的實(shí)施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)可以在任 一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例或示例中以合適的方式結(jié)合。此外，在不相互矛盾的情況下，本領(lǐng)域的技 術(shù)人員可以將本說明書中描述的不同實(shí)施例或示例以及不同實(shí)施例或示例的特征進(jìn)行結(jié) 合和組合。
[0154] 盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，可以理解的是，上述實(shí)施例是示例 性的，不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對(duì)上述 實(shí)施例進(jìn)行變化、修改、替換和變型。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種針對(duì)RNA分子構(gòu)建測(cè)序文庫的方法，其特征在于，包括： (a) 在RNA分子的3'端連接第一接頭，以便獲得第一連接產(chǎn)物； (b) 在所述第一連接產(chǎn)物的5'端連接第二接頭，以便獲得第二連接產(chǎn)物； (c) 對(duì)所述第二連接產(chǎn)物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以便獲得反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物； (d) 利用一對(duì)PCR引物對(duì)所述反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增，以便獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，其中，所述 一對(duì)PCR引物之一含有鏈霉親和素； (e) 從所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分離單鏈DNA分子；以及 (f) 將所述單鏈DNA分子進(jìn)行環(huán)化處理，以便獲得環(huán)化產(chǎn)物，所述環(huán)化產(chǎn)物構(gòu)成所述測(cè) 序文庫。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述RNA分子的長度18~30nt。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一接頭和所述第二接頭至少之一 中包含標(biāo)簽序列， 任選地，所述標(biāo)簽序列為選自SEQ ID NO. 1~SEQ ID NO. 8中的至少之一。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（a)和（b)是在相同容器中進(jìn)行的， 其中，在步驟（a)中采用過量的所述第一接頭，并且在進(jìn)行步驟（b)之前，向步驟（a) 所得到的反應(yīng)產(chǎn)物中添加特異性識(shí)別所述第一接頭的屏蔽序列，以便對(duì)剩余的所述第一接 頭進(jìn)行屏蔽處理， 任選地，所述屏蔽序列包括雙鏈區(qū)和5'突出端， 其中，所述5'突出端能夠與所述第一接頭的至少一部分匹配， 任選地，向步驟（a)所得到的反應(yīng)產(chǎn)物中添加特異性識(shí)別所述第一接頭的屏蔽序列之 前，預(yù)先對(duì)所述屏蔽序列進(jìn)行預(yù)處理，所述預(yù)處理包括： 將含有所述屏蔽序列和緩沖液的混合物置于95攝氏度下5分鐘，然后以0. 1攝氏度/ 秒的速率梯度降溫至25攝氏度， 所述緩沖液為含有〇. 05M NaCl的0. 01M Tris-HCl溶液。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，從所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分離單鏈DNA分子進(jìn) 一步包括： 使所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與磁珠接觸，以便形成磁珠-DNA復(fù)合物，其中，所述磁珠上連接有 鏈霉未和素； 將所述磁珠-DNA復(fù)合物與pH高于7的溶液接觸，以便獲得所述單鏈DNA片段， 任選地，所述pH高于7的溶液為氫氧化鈉溶液。6. -種針對(duì)RNA分子構(gòu)建測(cè)序文庫的裝置，其特征在于，包括： 連接單元，所述連接單元用于依次在RNA分子的3'端連接第一接頭，以便獲得第一連 接產(chǎn)物；以及在所述第一連接產(chǎn)物的5'端連接第二接頭，以便獲得第二連接產(chǎn)物； 反轉(zhuǎn)錄單元，所述反轉(zhuǎn)錄單元用于對(duì)所述第二連接產(chǎn)物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以便獲得反轉(zhuǎn)錄 產(chǎn)物； 擴(kuò)增單元，所述擴(kuò)增單元用于利用一對(duì)PCR引物對(duì)所述反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增，以便獲 得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，其中，所述一對(duì)PCR引物之一含有鏈霉親和素； 分離單元，所述分離單元用于從所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分離單鏈DNA分子；以及 環(huán)化單元，所述環(huán)化單元用于將所述單鏈DNA分子進(jìn)行環(huán)化處理，以便獲得環(huán)化產(chǎn)物， 所述環(huán)化產(chǎn)物構(gòu)成所述測(cè)序文庫。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的裝置，其特征在于，所述RNA分子的長度18~30nt。8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的裝置，其特征在于，所述第一接頭和所述第二接頭至少之一 中包含標(biāo)簽序列， 任選地，所述標(biāo)簽序列為選自SEQ ID NO. 1~SEQ ID NO. 8中的至少之一。9. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的裝置，其特征在于，進(jìn)一步包括： 屏蔽單元，所述屏蔽單元用于在所述第一連接產(chǎn)物的5'端連接第二接頭之前，向所述 連接單元中添加特異性識(shí)別所述第一接頭的屏蔽序列，以便對(duì)剩余的所述第一接頭進(jìn)行屏 蔽處理， 任選地，所述屏蔽序列包括雙鏈區(qū)和5'突出端， 其中，所述5'突出端能夠與所述第一接頭的至少一部分匹配， 任選地，所述屏蔽單元進(jìn)一步包括： 預(yù)處理模塊，所述預(yù)處理模塊用于在向所述連接單元中添加特異性識(shí)別所述第一接頭 的屏蔽序列之前，預(yù)先對(duì)所述屏蔽序列進(jìn)行預(yù)處理，所述預(yù)處理包括： 將含有所述屏蔽序列和緩沖液的混合物置于95攝氏度下5分鐘，然后以0. 1攝氏度/ 秒的速率梯度降溫至25攝氏度， 所述緩沖液為含有〇. 05M NaCl的0. 01M Tris-HCl溶液。10. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的裝置，其特征在于，所述分離單元進(jìn)一步包括： 吸附模塊，所述吸附模塊用于使所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與磁珠接觸，以便形成磁珠-DNA復(fù) 合物，其中，所述磁珠上連接有鏈霉親和素； 洗脫模塊，所述洗脫模塊用于使所述磁珠-DNA復(fù)合物與pH高于7的溶液接觸，以便獲 得所述單鏈DNA片段， 任選地，所述pH高于7的溶液為氫氧化鈉溶液。
【文檔編號(hào)】C40B50/06GK105986020SQ201510072010
【公開日】2016年10月5日
【申請(qǐng)日】2015年2月11日
【發(fā)明人】張春燕, 祝珍珍, 耿春雨, 章文蔚, 蔣慧
【申請(qǐng)人】深圳華大基因研究院