叢枝菌根真菌誘導(dǎo)型啟動(dòng)子及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種叢枝菌根真菌誘導(dǎo)型啟動(dòng)子及其應(yīng)用。具體地，本發(fā)明公開了一種啟動(dòng)子元件，所述的啟動(dòng)子元件包括：(a)核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的多核苷酸；或(b)如SEQ ID NO:1所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短1-60個(gè)(較佳地1-30，更佳地1-6個(gè))核苷酸，且具有叢枝菌根真菌誘導(dǎo)啟動(dòng)功能的多核苷酸。本發(fā)明啟動(dòng)子長(zhǎng)度僅為550bp，即可驅(qū)動(dòng)目的基因響應(yīng)菌根的共生，且在多種物種中均可有效啟動(dòng)。
【專利說明】
叢枝菌根真菌誘導(dǎo)型啟動(dòng)子及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及一種受叢枝菌根真菌誘導(dǎo)啟動(dòng)的 啟動(dòng)子及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 叢枝菌根（arbuscular mycorrhiza, AM)是土壤中的一類有益真菌（叢枝菌根真 菌，簡(jiǎn)稱AM真菌）侵入植物根系后建立形成的互惠共生體（Redecker et al.，2000)。地 球上80%以上的陸生植物都可以與土壤中的AM真菌共生形成叢枝菌根。叢枝菌根共生體 的形成是高等植物適應(yīng)逆境脅迫的重要進(jìn)化機(jī)制之一。形成菌根后AM真菌的一端（根內(nèi)菌 絲）定殖于植物根系皮層細(xì)胞內(nèi)，另一端（根外菌絲）穿越根際養(yǎng)分耗竭區(qū)。宿主植物借助 于AM真菌大量的根外菌絲可多達(dá)幾十倍的擴(kuò)展根系在土壤中的吸收空間，增加對(duì)土壤中 的礦質(zhì)養(yǎng)分（P、N、S、Zn等）和水分的吸收利用，從而改善宿主植株的營養(yǎng)狀況；作為交換， 宿主植株也為AM真菌提供其生長(zhǎng)繁殖所必需的碳水化合物，以維持兩者的共生關(guān)系。研究 表明，宿主植株向根系輸送光合產(chǎn)物的過程同時(shí)也增加了根系細(xì)胞內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)（如可 溶性糖、脯氨酸等）的有效濃度，從而增強(qiáng)了宿主植物對(duì)多種環(huán)境脅迫，如鹽害、干旱、重金 屬毒害的抵御能力。此外，AM真菌的侵染還能夠誘導(dǎo)植株產(chǎn)生系統(tǒng)性防御反應(yīng)，從而抵御 和減輕病原菌的侵染。
[0003] 叢枝菌根形成的一個(gè)重要特征就是，菌絲體侵入到植物皮層細(xì)胞中，并經(jīng) 多次分枝形成叢枝狀結(jié)構(gòu)。包圍著叢枝的是由宿主質(zhì)膜分化產(chǎn)生的環(huán)叢枝膜結(jié)構(gòu) (peri-arbuscular membrane) JM真菌與宿主之間的養(yǎng)分及信號(hào)分子交換也就發(fā)生在環(huán)叢 枝膜與AM真菌質(zhì)膜（fungal plasma membrane)之間的質(zhì)外體中。很多參與物質(zhì)交換（如 磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、氨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、等）和信號(hào)傳遞（如生長(zhǎng)素、獨(dú)腳金內(nèi)酯等）及防御反應(yīng)相關(guān)的 基因也相繼被發(fā)現(xiàn)在形成叢枝的細(xì)胞中特異性表達(dá)。
[0004] 因此，如何讓植物生長(zhǎng)相關(guān)基因（如GH3)在AM真菌聚積處更多地表達(dá)，從而有利 于根系的生長(zhǎng)以及植物的生長(zhǎng)，是本領(lǐng)域迫切需要解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供了一種新的啟動(dòng)子，可以有效地啟動(dòng)植物S1GH3. 4基因在根系中相應(yīng) AM真菌從而進(jìn)行表達(dá)。
[0006] 本發(fā)明第一方面，提供了一種啟動(dòng)子元件，所述的啟動(dòng)子元件包括：
[0007] (a)核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示的多核苷酸；或
[0008] (b)如SEQ ID NO: 1所示多核苷酸的5'端和/或3'端截短1-60個(gè)（較佳地1-30， 更佳地卜6個(gè)）核苷酸，且具有叢枝菌根真菌誘導(dǎo)啟動(dòng)功能的多核苷酸。
[0009] 在另一優(yōu)選例中，所述的啟動(dòng)子元件還包括：
[0010] (C)核苷酸序列與SEQ ID NO: 1所示序列的同源性彡95% (較佳地彡98% )，且 具有叢枝菌根真菌（arbuscular mycorrhiza, AM)誘導(dǎo)啟動(dòng)功能的多核苷酸。
[0011] 在另一優(yōu)選例中，所述的目的基因包括植物GH3基因。
[0012] 在另一優(yōu)選例中，所述的植物GH3基因包括S1GH3. 4、S1GH3. 9、和/或S1GH3. 15。
[0013] 在另一優(yōu)選例中，所述的目的基因是S1GH3. 4(GenBank登錄號(hào)：KP639566)。
[0014] 本發(fā)明第二方面，提供了一種構(gòu)建物，所述的構(gòu)建物含有本發(fā)明第一方面所述的 啟動(dòng)子元件，和與所述啟動(dòng)子元件可操作連接的目的基因。
[0015] 在另一優(yōu)選例中，所述的構(gòu)建物在天然狀態(tài)下不存在。
[0016] 在另一優(yōu)選例中，所述的構(gòu)建物還含有外源性基因。
[0017] 在另一優(yōu)選例中，所述的外源性基因包括抗性基因、篩選標(biāo)記基因、RNAi基因、 microRNA基因、生物制劑基因、或植物品質(zhì)相關(guān)基因。
[0018] 在另一優(yōu)選例中，所述的抗性基因選自下組：卡那霉素、氯霉素、氨芐青霉素、四環(huán) 素、潮霉素、新霉素等抗生素抗性基因，抗病毒基因等。
[0019] 在另一優(yōu)選例中，所述的篩選標(biāo)記基因選自下組：gus(i3_葡萄糖苷酸酶）基因、 hyg(潮霉素）基因 、neo (新霉素）基因、或gfp (綠色熒光蛋白）基因。
[0020] 在另一優(yōu)選例中，所述的生物制劑基因選自下組：a 2b干擾素基因、或胰島素樣 生長(zhǎng)因子基因。
[0021] 在另一優(yōu)選例中，所述的植物品質(zhì)相關(guān)基因選自下組：氣基酸改良相關(guān)基因、脂肪 改良相關(guān)基因、淀粉改良相關(guān)基因、或雄性不育相關(guān)基因。
[0022] 本發(fā)明第三方面，提供了一種表達(dá)盒，所述表達(dá)盒從5'至3'依次具有下述元件： 本發(fā)明第一方面所述的啟動(dòng)子元件、目的基因0RF序列和終止子。
[0023] 在另一優(yōu)選例中，所述的表達(dá)盒還包括選自下組的一種或多種元件：poly(A)元 件、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)運(yùn)元件、或終止子。
[0024] 本發(fā)明第四方面，提供了一種載體，所述的載體含有本發(fā)明第一方面所述的啟動(dòng) 子元件、或本發(fā)明第二方面所述的構(gòu)建物、或本發(fā)明第三方面所述的表達(dá)盒。
[0025] 在另一優(yōu)選例中，所述載體選自：細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、或植物細(xì)胞病毒載 體、穿梭載體。
[0026] 本發(fā)明第五方面，提供了一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞含有本發(fā)明第四方面所述 的載體、或其染色體上整合有外源性的本發(fā)明第一方面所述的啟動(dòng)子元件或整合有本發(fā)明 第二方面所述的構(gòu)建物或整合有本發(fā)明第三方面所述的表達(dá)盒。
[0027] 在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞選自下組：原核細(xì)胞（如大腸桿菌、鏈霉菌屬、 或農(nóng)桿菌）、低等真核細(xì)胞（如酵母細(xì)胞）、或高等真核細(xì)胞（如植物細(xì)胞）。
[0028] 在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞為植物細(xì)胞，更佳地為農(nóng)作物、蔬菜、或花卉的 植物細(xì)胞。
[0029] 本發(fā)明第六方面，提供了第一方面所述的啟動(dòng)子元件、本發(fā)明第二方面所述的構(gòu) 建物、本發(fā)明第三方面所述的表達(dá)盒或本發(fā)明第四方面所述的載體的用途，用于在宿主細(xì) 胞中表達(dá)目的基因，其中所述目的基因與所述的啟動(dòng)子操作性連接，并且所述啟動(dòng)子的具 有叢枝菌根真菌誘導(dǎo)啟動(dòng)功能啟動(dòng)子活性；或用于構(gòu)建受叢枝菌根真菌誘導(dǎo)啟動(dòng)功能并表 達(dá)目的基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)體系。
[0030] 本發(fā)明第七方面，提供了一種調(diào)控目的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平的方法，包括步驟：
[0031] (a)提供本發(fā)明第二方面所述的構(gòu)建物；
[0032] (b)將步驟（a)中得到的構(gòu)建物導(dǎo)入宿主細(xì)胞，獲得轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；
[0033] (c)將所述的宿主細(xì)胞再生為植株；
[0034] (d)在叢枝菌根真菌存在下培養(yǎng)所述的植株，從而使所述的目的基因在所述的植 株中特異性表達(dá)。
[0035] 在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞包括番茄細(xì)胞、煙草細(xì)胞、大豆細(xì)胞。
[0036] 在另一優(yōu)選例中，所述的叢枝菌根真菌感染所述的植株。
[0037] 在另一優(yōu)選例中，所述的目的基因在所述植株的根系中表達(dá)。
[0038] 在另一優(yōu)選例中，所述的根系被AM真菌侵染。
[0039] 在另一優(yōu)選例中，所述的構(gòu)建物通過以下步驟獲得：
[0040] ⑴以番茄基因組為模板，PCR擴(kuò)增SEQ ID NO. : 1所示的序列；
[0041] (ii)PCR擴(kuò)增所述的目的基因多核苷酸片段，其中所述的目的基因?yàn)镾1GH3. 4基 因；
[0042] (iii)可操作連接所述啟動(dòng)子和所述目的基因多核苷酸片段從而得到所述構(gòu)建 物。
[0043] 在另一優(yōu)選例中，用于PCR擴(kuò)增SEQ ID N0. :1所示序列的引物序列如SEQID NO. :9-10 所示。
[0044] 本發(fā)明第八方面，提供了一種細(xì)胞培養(yǎng)物，所述的細(xì)胞培養(yǎng)物含有本發(fā)明第五方 面所述的宿主細(xì)胞，和外源添加的叢枝菌根真菌。
[0045] 本發(fā)明第九方面，提供了一種植物愈傷組織或植物體細(xì)胞胚胎，所述的愈傷組織 或體細(xì)胞胚胎含有本發(fā)明本發(fā)明第四方面所述的載體、或其染色體上整合有外源性的本發(fā) 明第一方面所述的啟動(dòng)子元件或整合有本發(fā)明第二方面所述的構(gòu)建物或整合有本發(fā)明第 三方面所述的表達(dá)盒，其中，所述的植物包括番茄、煙草、或大豆。
[0046] 應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實(shí)施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附圖說明】
[0047] 圖1顯示了 6個(gè)S1GH3基因在接種和不接種AM真菌的番茄中的表達(dá)分析縱坐標(biāo)： 相對(duì)表達(dá)量；橫坐標(biāo)為根系和葉片；-AMF:不接種AM真菌；+AMF:接種AM真菌。
[0048] 圖2顯示了 pSlGH3. 4-2258驅(qū)動(dòng)⑶S基因的在轉(zhuǎn)基因煙草根系中的表達(dá)分析（a) 為正常培養(yǎng)的根系（N) ;(b-c)為AM真菌侵染的根系；綠色箭頭指示為沒有被菌絲侵染的 細(xì)胞；粉紅色箭頭指示為被菌絲侵染形成叢枝的細(xì)胞。
[0049] 圖3顯示了 pSlGH3. 4-654(a)和pSlGH3. 4-550(b)驅(qū)動(dòng)⑶S基因的在轉(zhuǎn)基因煙草 根系中的表達(dá)分析，其中+AMF表示接種AM真菌的處理。
[0050] 圖4顯示了 pSlGH3. 4-2258(b)和pSlGH3. 4-550(c)驅(qū)動(dòng)⑶S基因的在大豆轉(zhuǎn)基 因根系中的表達(dá)分析，其中（a)N :正常培養(yǎng)；+IAA :IAA處理；+AMF接種AM真菌的處理。
【具體實(shí)施方式】
[0051] 本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，利用生物信息學(xué)方法進(jìn)行設(shè)計(jì)篩選，獲得了一 個(gè)受叢枝菌根真菌共生特異性誘導(dǎo)啟動(dòng)的、長(zhǎng)度僅為550bp的啟動(dòng)子。具體地，本發(fā)明利 用基因工程植物轉(zhuǎn)化技術(shù)，構(gòu)建不同長(zhǎng)度啟動(dòng)子的植物表達(dá)載體，再將表達(dá)載體轉(zhuǎn)染多種 植物，研究不同長(zhǎng)度啟動(dòng)子在叢枝菌根共生處理時(shí)對(duì)特定基因的作用。研究發(fā)現(xiàn)，550bp的 啟動(dòng)子就可以驅(qū)動(dòng)目的基因響應(yīng)菌根共生。采用本發(fā)明啟動(dòng)子更易于在表達(dá)載體中進(jìn)行表 達(dá)。在此基礎(chǔ)上，完成了本發(fā)明。
[0052] 本發(fā)明啟動(dòng)子
[0053] 在本發(fā)明中，術(shù)語"具有叢枝菌根真菌誘導(dǎo)啟動(dòng)功能的啟動(dòng)子"指的是能夠在叢枝 菌根真菌共生（感染）狀態(tài)下的誘導(dǎo)型表達(dá)的啟動(dòng)子。通常，叢枝菌根真菌定植于植物根 系的皮層細(xì)胞，因此，本發(fā)明啟動(dòng)子也多在根系內(nèi)受叢枝菌根真菌誘導(dǎo)啟動(dòng)。
[0054] 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在S1GH3. 4基因長(zhǎng)達(dá)2000余bp的啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)，僅550bp的啟動(dòng) 子即可響應(yīng)叢枝菌根真菌的共生誘導(dǎo)，并啟動(dòng)相應(yīng)的目的基因進(jìn)行表達(dá)。
[0055] 本文所用的術(shù)語"啟動(dòng)子"或"啟動(dòng)子區(qū)（域）"是指一種有效起始基因轉(zhuǎn)錄功能 的核酸序列及能夠影響該基因轉(zhuǎn)錄水平的核酸序列，引導(dǎo)基因核酸序列轉(zhuǎn)錄為RNA，其通常 存在于目的基因編碼序列的上游（5'端），一般地，啟動(dòng)子或啟動(dòng)子區(qū)域提供RNA聚合酶和 正確起始轉(zhuǎn)錄所必需的其它因子、以及能夠調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄水平的相關(guān)因子的識(shí)別位點(diǎn)。優(yōu) 選地，本發(fā)明啟動(dòng)子序列如SEQ ID N0. :1所示。
[0056] 根據(jù)S1GH3. 4基因以及本發(fā)明啟動(dòng)子的序列后，可根據(jù)本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)篩選并獲 得擴(kuò)增相應(yīng)啟動(dòng)子區(qū)域的引物。優(yōu)選地，用于擴(kuò)增SEQ ID N0. :1所示序列的引物如SEQ ID NO. :9-10 所示。
[0057] 在本文中，所述啟動(dòng)子或啟動(dòng)子區(qū)（域）包括啟動(dòng)子的變體，啟動(dòng)子變體可以通過 插入或刪除核酸序列，進(jìn)行隨機(jī)或定點(diǎn)突變等來獲得。
[0058] 鑒于本發(fā)明的教導(dǎo)和現(xiàn)有技術(shù)，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)理解，盡管本發(fā)明的實(shí)施 例中提供的啟動(dòng)子序列如SEQ ID N0. :1所示，但本發(fā)明還應(yīng)包括與本發(fā)明的啟動(dòng)子序列 (SEQ ID N0:1)具有50%或以上（優(yōu)選60%以上，70%以上，80%以上，更優(yōu)選90%以上， 更優(yōu)選95%以上，最優(yōu)選98%以上，如99%)同源性的核酸，只要所述核酸也具有叢枝菌根 真菌誘導(dǎo)啟動(dòng)功能。"同源性"是指按照位置相同的百分比，兩條或多條核酸之間的相似水 平（即序列相似性或同一性）。更優(yōu)選地，本發(fā)明啟動(dòng)子的變體必須包含S1GH3. 4編碼基因 上游90-97位TATA box核心啟動(dòng)子區(qū)域（TATAAATA)。
[0059] 目的基因、外源基因和構(gòu)建物
[0060] 本發(fā)明所用的"目的基因"指的是任何與本發(fā)明啟動(dòng)子直接或間接可操作連接，并 能夠受本發(fā)明啟動(dòng)子啟動(dòng)并表達(dá)的基因。本發(fā)明的啟動(dòng)子可以可操作地與目的基因連接， 該目的基因相對(duì)于啟動(dòng)子可以是來源于同一個(gè)物種，也可以來自不同的物種。本文所述的 目的基因沒有特別限制，可以是RNA的基因或編碼具有特定功能蛋白的基因。
[0061] 優(yōu)選地，所述的目的基因包括植物的GH3基因，GH3基因被發(fā)現(xiàn)以來其功能就一 直被認(rèn)為與生長(zhǎng)素信號(hào)及其傳導(dǎo)途徑密切相關(guān)。近年來的研究表明，在擬南芥、水稻、番茄 等很多高等植物的基因組中都存在著多個(gè)GH3同源基因。可用于本發(fā)明的GH3基因包括 S1GH3. 4、S1GH3. 9、和/或S1GH3. 15,優(yōu)選為S1GH3. 4。此外，本發(fā)明所述"外源基因"指的 是也可為本發(fā)明啟動(dòng)子啟動(dòng)的基因，或在質(zhì)粒中可以獨(dú)立表達(dá)的、不屬于宿主細(xì)胞的基因。 因此，本發(fā)明"外源基因"中一部分也是"目的基因"，例如，本發(fā)明所采用的⑶S基因。
[0062] 本發(fā)明提供的構(gòu)建物通常含有本發(fā)明的啟動(dòng)子元件，以及可操作連接的目的基因 (或外源基因）。優(yōu)選地，本發(fā)明為含有SEQ ID N0. :1以及S1GH3.4基因序列的核苷酸片 段。
[0063] 表達(dá)盒、載體、宿主細(xì)胞
[0064] 本發(fā)明還提供了所述表達(dá)盒從5'至3'依次具有下述元件：本發(fā)明第一方面所 述的啟動(dòng)子元件、目的基因0RF序列和終止子。優(yōu)選地，所述啟動(dòng)子元件的序列如SEQ ID NO. :1所示或與SEQ ID NO. :1所示序列的同源性彡95%，較佳地彡98%，更佳地彡99%。 [0065] 本發(fā)明還提供了一種載體，其包含本發(fā)明的啟動(dòng)子和/或基因表達(dá)盒。在優(yōu)選的 實(shí)施方式中，所述載體的啟動(dòng)子下游包含多克隆位點(diǎn)或至少一個(gè)酶切位點(diǎn)。需要表達(dá)目的 基因時(shí)，將目的基因連接入適合的多克隆位點(diǎn)或酶切位點(diǎn)，從而可操作地連接目的基因與 啟動(dòng)子。
[0066] 在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述重組載體在5'到3'方向上包括：?jiǎn)?dòng)子，目的基 因和終止子。如果需要，所述重組載體還可以包括以下元件：蛋白純化標(biāo)簽；3'多聚核苷 酸化信號(hào)；非翻譯核酸序列；轉(zhuǎn)運(yùn)和靶向核酸序列；選擇標(biāo)記（抗生素抗性基因、熒光蛋白 等）；增強(qiáng)子；或操作子。
[0067]用于制備重組載體的方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。表達(dá)載體可以是細(xì)菌 質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動(dòng)物細(xì)胞病毒或其他載體?？傊?，只要其能夠 在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以被米用。
[0068] 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以采用熟知的方法構(gòu)建含有本發(fā)明啟動(dòng)子和/或目的基 因序列的載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。
[0069] 本發(fā)明的啟動(dòng)子、表達(dá)盒或載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使宿主轉(zhuǎn)錄目 的RNA或表達(dá)目的蛋白質(zhì)。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如農(nóng)桿菌\大腸桿菌、谷氨酸棒桿 菌、黃色短桿菌、鏈霉菌屬：或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如植物細(xì) 胞。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當(dāng)?shù)妮d體和宿主細(xì)胞。用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì) 胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物（如大腸桿菌）時(shí)，可以 用CaCV法處理，也可用電穿孔法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法： 磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法（如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等）。轉(zhuǎn)化植物也可使用 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化或基因槍轉(zhuǎn)化等方法，例如葉盤法、幼胚轉(zhuǎn)化法、花芽浸泡法等。對(duì)于轉(zhuǎn)化的植 物細(xì)胞、組織或器官可以用常規(guī)方法再生成植株，從而獲得轉(zhuǎn)基因的植物。
[0070] 術(shù)語"可操作連接"是指將準(zhǔn)備轉(zhuǎn)錄表達(dá)的目的基因以一種本領(lǐng)域的常規(guī)方式連 接到它的控制序列以被表達(dá)。
[0071] 本發(fā)明有益效果
[0072] 通過對(duì)番茄中GH3基因在接種AM真菌處理?xiàng)l件下的熒光定量PCR分析，結(jié)果顯示 S1GH3. 4基因在根系中被誘導(dǎo)強(qiáng)烈表達(dá)。本發(fā)明人篩選到一段長(zhǎng)度僅為550bp的啟動(dòng)子片 段，其在轉(zhuǎn)化煙草和大豆等植物后，該啟動(dòng)子片段還能夠驅(qū)動(dòng)GUS基因在接種AM真菌的煙 草和大豆中強(qiáng)烈表達(dá)，表達(dá)部位也是集中在被侵染形成叢枝和內(nèi)生菌絲的皮層細(xì)胞中。本 發(fā)明啟動(dòng)子片段的長(zhǎng)度僅為原啟動(dòng)子片段的1/4,仍然保持著AM真菌誘導(dǎo)啟動(dòng)活性，且活 性并無降低，因此，該短啟動(dòng)子片段更有利于表達(dá)載體的構(gòu)建。此外，實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明啟動(dòng) 子能在多種物種中啟動(dòng)S1GH3. 4基因，應(yīng)用十分廣泛。
[0073] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本 發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照 常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否 則百分比和份數(shù)是重量百分比和重量份數(shù)。
[0074] 實(shí)施例1番茄GH3基因?qū)仓捻憫?yīng)
[0075] 將番前（Solanum lycopersicum，Micro Tom)種子接種到 MS 培養(yǎng)基上，在 25°C培 養(yǎng)室里發(fā)芽和無菌培養(yǎng)2周后，無菌苗轉(zhuǎn)移出來用沙培營養(yǎng)液澆灌盆栽培養(yǎng)。營養(yǎng)液配方 為ImM硝酸銨，2mM硝酸鉀，0. 05mM磷酸二氫鈉，0. 5mM硝酸鈣，0. 25mM氯化鈣，0. 5mM硫酸 鎂，20 μ M Fe-EDTA，9 μ Μ氯化猛，46 μ Μ硼酸，8 μ Μ硫酸鋅，3 μ Μ硫酸銅和0. 03 μ Μ鉬酸銨。 番前設(shè)接種AM真菌和不接種AM真菌（Rhizophagus irregularis，菌株DA0M197198)處理。 在接種后不同時(shí)期采樣分析AM真菌的侵染水平和番茄根系和葉片中基因的表達(dá)量。RNA提 取、cDNA合成及熒光定量RT-PCR分析同上。
[0076] 分析結(jié)果顯示，在接種AM真菌一個(gè)月的根系，S1GH3. 4基因的表達(dá)被特異性強(qiáng)烈 誘導(dǎo)，在沒有接種AM真菌的根系中，幾乎檢測(cè)不到S1GH3. 4的表達(dá)。此外，在接種AM真菌 的根系中，S1GH3. 9和S1GH3. 15基因的表達(dá)量與對(duì)照相比也顯著上調(diào)（圖1)。
[0077] 實(shí)施例2番茄基因組DNA的提取及S1GH3. 4基因的啟動(dòng)子候選片段的獲得
[0078] 2. 1.番茄基因組DNA提取
[0079] (1) DNA提取緩沖液配制
[0080] 溶液 A (500ml):
[0081] 1M Tris-HCl(pH7. 5) 0. lM(50ml)
[0082] 0. 5M EDTA (pH8. 0) 5mM(5ml)
[0083] 山梨糖醇 0· 35M(3L 85g)
[0084] 溶液 B (500ml):
[0085]
[0086] 溶液 C :
[0087] 5 %月桂?；“彼徕c溶液
[0088] 在溶液B中添加 pvpp，添加量為總提取液的1 %，然后按1 :1 :0· 4的比例分別混合 溶液A、B、C即DNA提取緩沖液
[0089] (2) ·提取DNA的步驟：
[0090] 1)稱取0. l_0.3g新鮮葉片在液氮中研磨成粉末，轉(zhuǎn)移至2ml Ep管中，添加 300-500 μ 1 DNA提取緩沖液后，充分渦旋混勻。
[0091] 2) 65°Cta溫水浴 15_20min，每 5min 禍旋樣品一次。
[0092] 3)添加等體積氯仿-異戊醇（比例24 :1)，搖床上慢速混勾10_15min。
[0093] 4) 4°C，7500rpm 離心 15min。
[0094] 5)轉(zhuǎn)移上清至新的1.5ml Ep管中，用500 μ 1的酚/氯仿（1:1)抽提1次，再用等 體積的氯仿抽提一次。
[0095] 6)小心轉(zhuǎn)移上清至新的1. 5ml Ep管，添加1ml無水乙醇，上下顛倒幾次，放 置-20°C 下 lOmin。
[0096] 7) 7500rpm離心5min，沉淀DNA，棄去多余液體。
[0097] 8)用75 %的乙醇洗滌DNA，棄去乙醇，空氣中充分干燥。
[0098] 9)添加 30-50 μ 1 TER(TE+RNase，RNase 終濃度 50 μ g/ml)緩沖液溶解 DNA。
[0099] 2· 2. S1GH3. 4基因的啟動(dòng)子候選片段的獲得
[0100] 利用S1GH3. 4基因的DNA序列（GenBank登錄號(hào)：ΚΡ639566)為檢索序列，選擇 S1GH3. 4起始密碼子ATG上游2500bp作為啟動(dòng)子候選片段。
[0101] 根據(jù)S1GH3. 4基因啟動(dòng)子的序列，分別設(shè)計(jì)正向引物F1和F2 (5'端引入Hind III 酶切位點(diǎn)）以及反向引物R(5'端引入BamH I酶切位點(diǎn)），具體的引物序列見表1。以番茄 基因組DNA為模板，進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增出三條分別長(zhǎng)2258bp、654bp、550bp和335bp的啟動(dòng) 子片段（SEQ ID NO. : 1-4)。
[0102] 表 1
[0103]
[0104] 實(shí)施例3不同長(zhǎng)度的啟動(dòng)子插入表達(dá)載體，構(gòu)建轉(zhuǎn)染載體
[0105] 將實(shí)驗(yàn)2. 2中的擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到到pEasy-blunt克隆載體（北京全式金生物公 司），并測(cè)序驗(yàn)證陽性克隆。用限制性內(nèi)切酶Hind III和BamH I將啟動(dòng)子從克隆載體中切 下，并同時(shí)用Hind III和BamH I雙酶切切下雙元表達(dá)載體pBI 121質(zhì)粒的CaMV35S啟動(dòng) 子。通過T4DNA連接酶將去除⑶S基因的線性化pBI 121質(zhì)粒與不同長(zhǎng)度的S1GH3.4啟動(dòng) 子片段連接構(gòu)建重組表達(dá)載體pBI 121-pSlGH3.4,并測(cè)序驗(yàn)證。將上述正確的載體點(diǎn)擊轉(zhuǎn) 化根癌農(nóng)桿菌EHA105,然后通過葉盤法轉(zhuǎn)化煙草。
[0106] 實(shí)施例4通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入煙草植物
[0107] (1)煙草無菌苗的培養(yǎng)
[0108] 將煙草種子放入100ml無菌三角瓶中，用70%酒精消毒lmin ;倒去酒精，加0. 1% HgC12溶液浸泡5min ;倒去HgC12溶液，無菌水清洗4-5遍，最后一遍浸泡30min。將種子 小心轉(zhuǎn)移到無菌濾紙上吸干，用無菌的鑷子將種子小心地置入滅菌的MS固體培養(yǎng)基上，在 組培室中28 °C培養(yǎng)4-6周。
[0109] (2)農(nóng)桿菌與組織愈傷共培養(yǎng)
[0110] 挑取攜帶有重組質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌EHA105單菌落接種于5ml含有50mg/LStr和 Kan抗生素的YEP液體培養(yǎng)基中，28°C，250rpm，振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期，從中吸取lml重 新接種到50ml新鮮的YEP液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至0D600為0. 2-0. 3 ;5000rpm離心后將 農(nóng)桿菌沉淀用MS培養(yǎng)液重懸，待用。
[0111] 剪取煙草無菌苗葉片，剪成約〇. 5X0. 5cm的小塊，將剪好的葉片在用MS培養(yǎng)液重 懸的農(nóng)桿菌中浸泡5-10min ;用無菌的濾紙將葉片表面的菌液吸干，置于MS共培養(yǎng)培養(yǎng)基 中，28°C，黑暗培養(yǎng)3天左右。
[0112] (3)分化
[0113] 共培養(yǎng)后的葉片外植體先用無菌水洗滌4次，再用含250mg/L羧芐青霉素（Car) 的無菌水浸泡5min，然后用無菌濾紙吸干，轉(zhuǎn)入到MS分化選擇培養(yǎng)基中組培室28°C恒溫培 養(yǎng)。每10天更換一次培養(yǎng)基。
[0114] (4)生根及移栽
[0115] 等芽長(zhǎng)至l-2cm左右時(shí)，切下，移入MS生根選擇培養(yǎng)基中，促其生根。等長(zhǎng)出4-5 片真葉后，將其中一片葉片剪成1X lcm的小塊重新置于MS分化選擇培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)繁。根 系發(fā)育好后，從組培室移入到常規(guī)溫室進(jìn)行日常管理。
[0116] (5)轉(zhuǎn)基因煙草的PCR檢測(cè)
[0117] 為了進(jìn)一步鑒定抗卡那霉素?zé)煵葜仓甏_實(shí)為轉(zhuǎn)基因植株，根據(jù)pBI 121載體中 ⑶S基因序列設(shè)計(jì)了一條通用的反向引物⑶SR1(SEQ ID N0. 13)，并通過F4引物和⑶SR1 以對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行PCR檢測(cè)。
[0118] 實(shí)施例5不同長(zhǎng)度PS1GH3. 4啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)⑶S基因在煙草中表達(dá)的組織化學(xué)檢測(cè) 分析
[0119] 對(duì)PCR檢測(cè)為陽性苗的轉(zhuǎn)基因煙草株系，進(jìn)行接種AM真菌處理。AM真菌接種30 天后，剪取不同長(zhǎng)度啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因苗的根系浸入GUS染液中，37 °C反應(yīng)8h后FAA固定液 (福爾馬林，冰醋酸和70%乙醇按體積1:1:18混合配制而成）中脫色固定10h，鏡檢成像 (BX500LYPUS 顯微鏡）。
[0120] 結(jié)果顯示2258bp長(zhǎng)度的S1GH3. 4啟動(dòng)子（pSlGH3. 4-2258)驅(qū)動(dòng)⑶S基因在接種AM 真菌的根系中大量表達(dá)，表達(dá)部位主要集中在含有叢枝和內(nèi)生菌絲的根系皮層細(xì)胞中（圖 2) 〇
[0121] 此外，654bp 和 550bp 長(zhǎng)度的 S1GH3.4 啟動(dòng)子（pSlGH3.4-654 和 pSlGH3.4-550)也 能夠驅(qū)動(dòng)⑶S基因在接種AM真菌的根系中大量表達(dá)，表達(dá)部位同樣主要集中在含有叢枝和 內(nèi)生菌絲的根系皮層細(xì)胞中（圖3a，b)，但335bp長(zhǎng)度的S1GH3. 4啟動(dòng)子已經(jīng)不能驅(qū)動(dòng)⑶S 基因在接種AM真菌的根系中大量表達(dá)（圖3c)。
[0122] 實(shí)施例6:不同長(zhǎng)度PS1GH3. 4啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)⑶S基因在大豆中表達(dá)的組織化學(xué)檢測(cè) 分析
[0123] 將構(gòu)建好的PS1GH3. 4-2258和pSlGH3. 4-550載體通過點(diǎn)擊轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入到發(fā)根 農(nóng)桿菌K599菌株中，LB培養(yǎng)液體培養(yǎng)基培養(yǎng)到0D600約為0. 5左右，通過注射器注射20ul 菌液到發(fā)芽3天的大豆下胚軸中，保持傷口在黑暗和濕潤的環(huán)境下生長(zhǎng)至傷口處長(zhǎng)出發(fā)根 (約14天左右），剪去大豆自身的根系。將長(zhǎng)出發(fā)根的大豆接種AM真菌沙培營養(yǎng)液培養(yǎng)， 一個(gè)月后染色檢測(cè)根系中⑶S的表達(dá)情況。
[0124] 結(jié)果顯示pSlGH3. 4-2258和pSlGH3. 4-550在大豆中也能夠驅(qū)動(dòng)⑶S基因在接種 的根系中特異性表達(dá)，表達(dá)模式與在煙草中的表達(dá)模式相同。即PS1GH3. 4-2258能夠驅(qū)動(dòng) GUS基因在接種AM真菌的根系中表達(dá)，表達(dá)部位主要集中在含有叢枝和內(nèi)生菌絲的根系皮 層細(xì)胞中。而PS1GH3. 4-550也能夠驅(qū)動(dòng)⑶S基因在接種AM真菌的根系中表達(dá)，表達(dá)部位 也集中在含有叢枝和內(nèi)生菌絲的根系皮層細(xì)胞中（圖4)。
[0125] 在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú) 引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范 圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種啟動(dòng)子元件，其特征在于，所述的啟動(dòng)子元件包括： (a) 核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示的多核苷酸；或 (b) 如SEQ ID NO: 1所示多核苷酸的5'端和/或3'端截短1-60個(gè)（較佳地1-30,更 佳地卜6個(gè)）核苷酸，且具有叢枝菌根真菌誘導(dǎo)啟動(dòng)功能的多核苷酸。2. 如權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子元件，其特征在于，所述的目的基因包括植物GH3基因。3. -種構(gòu)建物，其特征在于，所述的構(gòu)建物含有權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子元件，和與所 述啟動(dòng)子元件可操作連接的目的基因。4. 一種表達(dá)盒，其特征在于，所述表達(dá)盒從5'至3'依次具有下述元件：權(quán)利要求1所 述的啟動(dòng)子元件、目的基因0RF序列和終止子。5. -種載體，其特征在于，所述的載體含有權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子元件、或權(quán)利要求 3所述的構(gòu)建物、或權(quán)利要求4所述的表達(dá)盒。6. -種宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞含有本發(fā)明權(quán)利要求5所述的載體、或其 染色體上整合有外源性的權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子元件或整合有權(quán)利要求3所述的構(gòu)建物 或整合有權(quán)利要求4所述的表達(dá)盒。7. 權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子元件、權(quán)利要求3所述的構(gòu)建物、權(quán)利要求4所述的表達(dá)盒 或權(quán)利要求5所述的載體的用途，其特征在于，用于在宿主細(xì)胞中表達(dá)目的基因，其中所述 目的基因與所述的啟動(dòng)子操作性連接，并且所述啟動(dòng)子的具有叢枝菌根真菌誘導(dǎo)啟動(dòng)功能 啟動(dòng)子活性；或用于構(gòu)建受叢枝菌根真菌誘導(dǎo)啟動(dòng)功能并表達(dá)目的基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)體系。8. -種調(diào)控目的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平的方法，其特征在于，包括步驟： (a) 提供權(quán)利要求3所述的構(gòu)建物； (b) 將步驟（a)中得到的構(gòu)建物導(dǎo)入宿主細(xì)胞，獲得轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞； (c) 將所述的宿主細(xì)胞再生為植株； (d) 在叢枝菌根真菌存在下培養(yǎng)所述的植株，從而使所述的目的基因在所述的植株中 特異性表達(dá)。9. 如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述的構(gòu)建物通過以下步驟獲得： (i) 以番茄基因組為模板，PCR擴(kuò)增SEQ ID NO. :1所示的序列； (ii) PCR擴(kuò)增所述的目的基因多核苷酸片段，其中所述的目的基因?yàn)镾1GH3. 4基因； (iii) 可操作連接所述啟動(dòng)子和所述目的基因多核苷酸片段從而得到所述構(gòu)建物。10. -種細(xì)胞培養(yǎng)物，其特征在于，所述的細(xì)胞培養(yǎng)物含有權(quán)利要求6所述的宿主細(xì) 胞，和外源添加的叢枝菌根真菌。
【文檔編號(hào)】C12N15/82GK105985959SQ201510083342
【公開日】2016年10月5日
【申請(qǐng)日】2015年2月15日
【發(fā)明人】陳愛群, 陳瀟, 廖德華, 孫淑斌, 徐國華
【申請(qǐng)人】南京農(nóng)業(yè)大學(xué)