一種體內(nèi)檢測(cè)car-t細(xì)胞數(shù)的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種體內(nèi)檢測(cè)CAR?T細(xì)胞數(shù)的方法，包括如下步驟：(1)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品，步驟如下：針對(duì)CAR?T細(xì)胞的靶點(diǎn)基因設(shè)計(jì)特異性引物；使用PCR技術(shù)擴(kuò)增出相應(yīng)靶點(diǎn)基因特異性片段，并連接重組到T載體中；將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)擴(kuò)增，純化和測(cè)序鑒定；根據(jù)質(zhì)粒的濃度和分子量，計(jì)算出相應(yīng)的拷貝數(shù)，并且以此為標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行絕對(duì)定量；(2)待測(cè)樣本處理，步驟如下：抽提樣本的全基因組；檢測(cè)待測(cè)樣本基因組的濃度和純度；運(yùn)用熒光定量PCR儀，上機(jī)檢測(cè)樣本中目的基因的具體拷貝數(shù)；(3)數(shù)據(jù)處理。本發(fā)明操作方便，測(cè)量結(jié)果精確，通過(guò)定期抽取患者全血或骨髓，可獲知CAR?T細(xì)胞在體內(nèi)的變化情況，對(duì)患者進(jìn)一步細(xì)胞治療方案提供依據(jù)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種體內(nèi)檢測(cè)CAR-T細(xì)胞數(shù)的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及體內(nèi)CAR-T細(xì)胞數(shù)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種體內(nèi)檢測(cè)CAR-T細(xì)胞數(shù) 的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 腫瘤的細(xì)胞治療始于上世紀(jì)80年代。第一代細(xì)胞治療技術(shù)屬于采用非特異性的細(xì) 胞治療，其主要方法包括LAK、NK、CIK等。第二代細(xì)胞治療技術(shù)興起于上世紀(jì)90年代，主要代 表為DC-CIK，這種治療技術(shù)屬于誘導(dǎo)腫瘤特異性細(xì)胞治療。第一代和第二代細(xì)胞治療技術(shù) 由于療效有限等原因，在美歐等主要國(guó)家已幾乎不再開(kāi)展。第三代細(xì)胞治療技術(shù)始于本世 紀(jì)初，屬于基因重組細(xì)胞治療，主要有CAR-T、CAR-NK等。其中，最新的CAR-T技術(shù)不僅解決了 T細(xì)胞的靶向性、殺傷性的問(wèn)題，還解決了其體內(nèi)有效增殖的難題。目前如何確定體內(nèi)CAR-T 細(xì)胞的數(shù)量，獲知CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)的變化情況，進(jìn)而對(duì)患者的進(jìn)一步細(xì)胞治療方案提供依 據(jù)，成為目前亟需解決的技術(shù)問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明提出了一種體內(nèi)檢測(cè)CAR-T細(xì)胞數(shù)的方法，操作方便，測(cè)量結(jié)果精確，通過(guò) 定期抽取患者全血或骨髓，可獲知CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)的變化情況，對(duì)患者進(jìn)一步細(xì)胞治療方 案提供依據(jù)。
[0004] 本發(fā)明提出的一種體內(nèi)檢測(cè)CAR-T細(xì)胞數(shù)的方法，包括如下步驟：
[0005] (1)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品，步驟如下：
[0006] S1、針對(duì)CAR-T細(xì)胞的靶點(diǎn)基因設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物；
[0007] S2、通過(guò)普通PCR擴(kuò)增出相應(yīng)片段，運(yùn)用T載體構(gòu)建出一個(gè)新的克隆質(zhì)粒；
[0008] S3、將新的克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，鑒定，培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒；
[0009] S4、根據(jù)質(zhì)粒的濃度和分子量，計(jì)算出相應(yīng)的拷貝數(shù)，并且以此為標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)待測(cè) 樣本進(jìn)行絕對(duì)定量；
[0010] 其中，拷貝數(shù)計(jì)算公式為:拷貝數(shù)=6 · 02 X 1023 X核酸濃度+ (DNA 1 ength X 660); 拷貝數(shù)的單位為copies/ml，核酸濃度單位為g/ml;
[0011] (2)待測(cè)樣本處理，步驟如下：
[0012] S1、抽提樣本的全基因組；
[0013] S2、檢測(cè)待測(cè)樣本基因組的濃度和純度；
[0014] S3、運(yùn)用熒光定量PCR儀，上機(jī)檢測(cè)樣本中目的基因的具體拷貝數(shù)；
[0015] ⑶數(shù)據(jù)處理
[0016] 將熒光定量PCR儀得到的目的基因的具體拷貝數(shù)換算得出每微克中含目的基因的 拷貝數(shù)，進(jìn)而得出CAR-T細(xì)胞的數(shù)量。
[0017 ] 優(yōu)選地，在構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品過(guò)程中，CAR-T細(xì)胞的靶點(diǎn)基因?yàn)镃D 19、EpCAM、EGFR、HER2、 CD123 和/或 LMP1。
[0018] 優(yōu)選地，在待測(cè)樣本處理過(guò)程中，樣本包括患者的全血和/或骨髓。
[0019] 本發(fā)明可有效檢測(cè)出體內(nèi)CAR-T細(xì)胞的細(xì)微變化。進(jìn)一步的以腫瘤靶向性T細(xì)胞 (CAR-T)治療為主的細(xì)胞生物治療服務(wù)，包含的腫瘤靶點(diǎn)有：CD19、EpCAM、EGFR、HER2、 CD123、LMP1，獨(dú)立構(gòu)建關(guān)于腫瘤靶點(diǎn)的質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品，運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)體內(nèi)CAR-T細(xì)胞數(shù)的變化情況，進(jìn)而為患者病情評(píng)估和治療方案提供有力依據(jù)。在臨床上，通過(guò)定期 抽取患者全血或骨髓，可獲知CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)的變化情況，對(duì)患者進(jìn)一步細(xì)胞治療方案提 供依據(jù)。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 下面，通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
[0021] 實(shí)施例1
[0022] -種體內(nèi)檢測(cè)CAR-T細(xì)胞數(shù)的方法，包括如下步驟：
[0023] (1)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品，步驟如下：
[0024] S1、針對(duì)CAR-T細(xì)胞的靶點(diǎn)基因設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物；
[0025] S2、通過(guò)普通PCR擴(kuò)增出相應(yīng)片段，運(yùn)用T載體構(gòu)建出一個(gè)新的克隆質(zhì)粒；
[0026] S3、將新的克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，鑒定，培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒；
[0027] S4、根據(jù)質(zhì)粒的濃度和分子量，計(jì)算出相應(yīng)的拷貝數(shù)，并且以此為標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)待測(cè) 樣本進(jìn)行絕對(duì)定量；
[0028] 其中，拷貝數(shù)計(jì)算公式為：(：(^丨68 = 6.02\ 1023 \核酸濃度+(0嫩161^讓\660); copies單位為ml，核酸濃度單位為g/ml;
[0029] (2)待測(cè)樣本處理，步驟如下：
[0030] S1、抽提樣本的全基因組；
[0031] S2、檢測(cè)待測(cè)樣本基因組的濃度和純度；
[0032] S3、運(yùn)用熒光定量PCR儀，上機(jī)檢測(cè)樣本中目的基因的具體拷貝數(shù)；
[0033] (3)數(shù)據(jù)處理
[0034] 將熒光定量PCR儀得到的目的基因的具體拷貝數(shù)換算得出每微克中含目的基因的 拷貝數(shù)，進(jìn)而得出CAR-T細(xì)胞的數(shù)量。
[0035] 實(shí)施例2
[0036] -種體內(nèi)檢測(cè)CAR-T細(xì)胞數(shù)的方法，包括如下步驟：
[0037] (1)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品，步驟如下：
[0038] 31、針對(duì)0厶1?-1'細(xì)胞的靶點(diǎn)基因（0)194?0厶146?1?、冊(cè)1?2、0)123和/或110 31)設(shè)計(jì)一 對(duì)特異性引物，如下表1所示；
[0039] 表1針對(duì)CAR-T細(xì)胞的靶點(diǎn)基因 （CD 19、EpCAM、EGFR、HER2、CD 12 3和/或LMP1)設(shè)計(jì)的 一對(duì)特異性引物表
[0041] S2、通過(guò)普通PCR擴(kuò)增出相應(yīng)片段，運(yùn)用T載體構(gòu)建出一個(gè)新的克隆質(zhì)粒；
[0042] S3、將新的克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，鑒定，培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒；
[0043] S4、根據(jù)質(zhì)粒的濃度和分子量，計(jì)算出相應(yīng)的拷貝數(shù)，并且以此為標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)待測(cè) 樣本進(jìn)行絕對(duì)定量；
[0044] 其中，拷貝數(shù)計(jì)算公式為:拷貝數(shù)=6.02 X 1023 X核酸濃度+ (DNA length X 660); 拷貝數(shù)的單位為copies/ml，核酸濃度單位為g/ml;
[0045]標(biāo)準(zhǔn)品可以根據(jù)拷貝數(shù)計(jì)算公式稀釋成105、104、103、10 2，由此可得到一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲 線，儀器就可檢測(cè)出該樣本的拷貝數(shù)。
[0046] (2)待測(cè)樣本處理，步驟如下：
[0047] S1、抽提樣本的全基因組，其中樣本包括患者的全血和/或骨髓；
[0048] S2、檢測(cè)待測(cè)樣本基因組的濃度和純度;其中，實(shí)驗(yàn)室通過(guò)采用紫外-可見(jiàn)光分光 光度計(jì)可直接檢測(cè)出對(duì)樣本基因組的濃度和純度；
[0049] S3、運(yùn)用熒光定量PCR儀，上機(jī)檢測(cè)樣本中目的基因的具體拷貝數(shù)；
[0050] (3)數(shù)據(jù)處理
[0051] 將熒光定量PCR儀得到的目的基因的具體拷貝數(shù)換算得出每微克中含目的基因的 拷貝數(shù)，進(jìn)而得出CAR-T細(xì)胞的數(shù)量。
[0052] 具體的，通過(guò)分光光度計(jì)可獲知待測(cè)樣本的濃度，取?μL樣本作為模板進(jìn)行熒光定 量PCR檢測(cè)，得到該ΙμL模板的拷貝數(shù)，由于該ΙμL樣本的濃度已知，可計(jì)算出lyg含目的基因 的拷貝數(shù)，進(jìn)而得到CAR-T細(xì)胞的數(shù)量。
[0053]以上所述，僅為本發(fā)明較佳的【具體實(shí)施方式】，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此， 任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其 發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種體內(nèi)檢測(cè)CAR-T細(xì)胞數(shù)的方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品，步驟如下： 51、 針對(duì)CAR-T細(xì)胞的靶點(diǎn)基因設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物； 52、 通過(guò)普通PCR擴(kuò)增出相應(yīng)片段，運(yùn)用T載體構(gòu)建出一個(gè)新的克隆質(zhì)粒； 53、 將新的克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，鑒定，培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒； 54、 根據(jù)質(zhì)粒的濃度和分子量，計(jì)算出相應(yīng)的拷貝數(shù)，并且以此為標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)待測(cè)樣本 進(jìn)行絕對(duì)定量； 其中，拷貝數(shù)計(jì)算公式為:拷貝數(shù)=6.02 X IO23 X核酸濃度+ (DNA Iength X 660);拷貝 數(shù)的單位為copies/ml，核酸濃度單位為g/ml; (2) 待測(cè)樣本處理，步驟如下： 51、 抽提樣本的全基因組； 52、 檢測(cè)待測(cè)樣本基因組的濃度和純度； 53、 運(yùn)用熒光定量PCR儀，上機(jī)檢測(cè)樣本中目的基因的具體拷貝數(shù)； (3) 數(shù)據(jù)處理 將熒光定量PCR儀得到的目的基因的具體拷貝數(shù)換算得出每微克中含目的基因的拷貝 數(shù)，進(jìn)而得出CAR-T細(xì)胞的數(shù)量。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的體內(nèi)檢測(cè)CAR-T細(xì)胞數(shù)的方法，其特征在于，在構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品過(guò) 程中，CAR-T 細(xì)胞的靶點(diǎn)基因?yàn)镃D 19、EpCAM、EGFR、HER2、CD 123和/或LMP1。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的體內(nèi)檢測(cè)CAR-T細(xì)胞數(shù)的方法，其特征在于，在待測(cè)樣本處理 過(guò)程中，樣本包括患者的全血和/或骨髓。
【文檔編號(hào)】C12Q1/06GK105950761SQ201610483001
【公開(kāi)日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年6月24日
【發(fā)明人】凌發(fā)忠, 許國(guó)貞, 劉振云, 熊伍平, 程豐偉
【申請(qǐng)人】安徽未名細(xì)胞治療有限公司