一種檢測人類C-Kit基因11號外顯子突變的診斷試劑盒和方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種檢測人類c?kit基因突變類型的試劑盒，它包括SEQ ID NO.1～283所示的引物對和SEQ ID NO.284所示的探針。本發(fā)明還公開了一種檢測人類c?kit基因11號外顯子突變的方法。本發(fā)明試劑盒和方法可以準(zhǔn)確檢測人類c?kit基因11號外顯子的所有突變類型，為GIST患者的用藥提供指導(dǎo)，臨床應(yīng)用前景良好。
【專利說明】
一種檢測人類C-K i t基因11號外顯子突變的診斷試劑盒和 方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于基因檢測領(lǐng)域，具體涉及一種檢測人類c-Kit基因11號外顯子突變的 診斷試劑盒和方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 胃腸道間質(zhì)瘤（gastrointestinal stromaltumors，GIST)是一類起源于胃腸道間 葉組織的腫瘤，是胃腸道最常見的間葉源性腫瘤，多發(fā)于中老年患者，男女發(fā)病率無明顯差 異。Mazur等在1983年提出，GIST是一類區(qū)別于平滑肌瘤和神經(jīng)源性腫瘤的獨(dú)立腫瘤類型， 其直接病因是癌基因獲得性功能突變。
[0003] 早期治療GIST主要依賴手術(shù)切除，但是即使腫瘤完全切除，也有很多患者死于腫 瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，而傳統(tǒng)的放療和化療也沒有明顯的療效。靶向藥物特別是酪氨酸激酶抑 制劑伊馬替尼的出現(xiàn)使得GIST治療發(fā)生了根本性的改變，現(xiàn)在對于GIST的治療已發(fā)展為針 對不同病情，采取包括手術(shù)、輔助治療和新輔助治療的個(gè)性化綜合治療。目前臨床上治療 GIST的一線靶向藥物是格列衛(wèi)（伊馬替尼，諾華制藥），二線藥物索坦(舒尼替尼，輝瑞制 藥），每個(gè)患者年消費(fèi)均為十余萬人民幣。
[0004] 但靶向藥物的療效與有GIST患者有無基因突變及突變位點(diǎn)密切相關(guān)，不同的基因 突變類型患者，輔助治療的獲益存在差異，因此靶向治療之前需進(jìn)行基因檢測，以預(yù)測靶向 治療的療效并指導(dǎo)靶向藥物種類和劑量的選用。其規(guī)范的用藥方案已經(jīng)進(jìn)入《中國胃腸間 質(zhì)瘤診斷治療共識》(2013年版）。
[0005] GIST患者根據(jù)其基因突變類型，可從分子水平分為3類:C-Kit突變型（80~85%)， roGFRa突變型（5~10%)和野生型GIST(10%)。其中，C-Kit基因位于人染色體4ql2_13,全 長5230bp，含21個(gè)外顯子。C-Kit基因的突變形式多樣，包括缺失突變、點(diǎn)突變和插入突變， 突變位點(diǎn)主要發(fā)生在第9號（10%)、11號(70%)、13號（1%)、17號外顯子(1%)。
[0006] 研究表明，C-Kit基因突變不僅可協(xié)助明確診斷GIST，而且其突變位點(diǎn)與GIST靶向 藥物的治療反應(yīng)、用藥劑量和預(yù)后有關(guān)。其中，從伊馬替尼治療反應(yīng)上看，C-Kit基因有突變 的GIST病例比C-Kit野生型病例治療反應(yīng)效果好，患者腫瘤無明顯進(jìn)展的生存期長;其中， C-Kit基因有突變的GIST病例中，11號外顯子突變患者對伊馬替尼最敏感，藥物療效最好。 因此，檢測GIST患者是否出現(xiàn)11號外顯子突變，對于指導(dǎo)GIST患者的合理用藥，以進(jìn)行GIST 個(gè)體化診療，具有重要參考價(jià)值。
[0007] 但是，目前檢測人類C-Kit基因11號外顯子突變，主要是通過傳統(tǒng)的測序方式，測 序的耗費(fèi)時(shí)間長且成本高，不利用普通的臨床檢測。即使有少數(shù)使用熒光定量PCR法的報(bào) 道，也是僅對11號外顯子的其中某一個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行檢測，檢測位點(diǎn)單一，無法對11號外顯子進(jìn) 行多突變位點(diǎn)的全面評估，不能滿足實(shí)際應(yīng)用的需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于提供一種新的定量PCR檢測人類C-Kit基因突變的試劑盒和方 法。
[0009] c-Kit基因11號外顯子是GIST患者中最易發(fā)生突變的外顯子，突變幾乎涉及該外 顯子的每一個(gè)密碼子。本發(fā)明設(shè)計(jì)的特定引物，可以用于檢出已知11號外顯子的所有突變 類型。
[0010] c-Kit基因11號外顯子突變的部分已知突變類型如下：

[0013] 本發(fā)明提供了一種檢測人類c-kit基因突變類型的試劑盒，它包括SEQ ID N0.1~ 283所示的引物對和SEQ ID NO.284所示的探針。
[0014] 其中，它還包括質(zhì)控引物與質(zhì)控探針：SEQ ID NO.285~287所示引物對與SEQ ID NO. 284所示的探針。
[0015] 本發(fā)明還提供了上述試劑盒在制備檢測人類C-kit基因11號外顯子突變的試劑中 的用途。
[0016] 本發(fā)明還提供了SEQ ID NO. 1~283所示引物對。
[0017] 本發(fā)明還提供了SEQ ID N0.284所示的探針。
[0018]本發(fā)明還提供了一種檢測人類c-kit基因11號外顯子突變的方法，它包括如下步 驟：
[0019] (1)提取樣本DNA:取待檢組織，提取其中的DNA;
[0020] (2)基因擴(kuò)增:用上述試劑盒對待檢樣本中的DNA進(jìn)行擴(kuò)增；
[0021] (3)結(jié)果檢測:對DNA擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行檢測。
[0022]只要本發(fā)明檢測試劑盒和方法測出有突變，就可以確認(rèn)C-Kit基因的11號外顯子 至少存在一種突變。從而可以預(yù)測GIST患者對靶向藥物的治療反應(yīng)。
[0023]本發(fā)明提供的試劑盒可以同時(shí)準(zhǔn)確檢測待檢人群是否出現(xiàn)C-Kit基因的11號外顯 子上的274種突變位點(diǎn)，更能準(zhǔn)確判斷待檢GIST患者的藥物反應(yīng)，為GIST患者的用藥提供指 導(dǎo)，且靈敏度高，特異性好，而且檢測快速、簡便，成本低廉，可以大量推廣使用，臨床應(yīng)用前 景良好。
[0024] 顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離 本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
[0025] 以下通過實(shí)施例形式的【具體實(shí)施方式】，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說 明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容 所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
【附圖說明】
[0026]圖1為突變型樣本測序結(jié)果圖，所述突變?yōu)橐阎狢11D組突變。
[0027]圖2為特異性檢測結(jié)果圖。
[0028]圖3為靈敏度檢測結(jié)果圖：編號1-5分別為濃度為8ng/ul、4ng/ul、2ng/ul、lng/ul、 0.5ng/ul的DNA擴(kuò)增結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 下面以實(shí)施例作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明不局限于這些實(shí)施例。
[0030] 本發(fā)明所用的實(shí)驗(yàn)試劑與儀器如下：
[0031] FastStartTaq DNA Polymerase:購自Roche公司，Cat No. 12 032 937 001;
[0032] Uracil DNA Glycosylase(UNG)，heat labile 200U 2u/l:購自大連Takara公司， Cat No.2820；
[0033] dU plus dNTP Mixture(12.5X)(dATP 2.5mM,dGTP 2.5mM,dCTP 2.5mM,dUTP 7 · 5mM,):購自大連Takara公司，Cat No · 4035。
[0034] 實(shí)施例1本發(fā)明檢測C-Kit基因11號外顯子突變的試劑盒和檢測方法 [0035] 一、本發(fā)明試劑盒的組成
[0036] PCR擴(kuò)增試劑(1人份）：
[0038] c-kit基因11號外顯子突變的擴(kuò)增引物以及檢測探針：
[0039]引物如下：（引物均為5'-3'方向）
[0040](注:編號由三個(gè)數(shù)字+-個(gè)字母組成，其中，前兩個(gè)數(shù)字代表第5XX位氨基酸;第三 個(gè)數(shù)字代表該氨基酸密碼子的第幾個(gè)核苷酸;字母代表突變?yōu)槟撤N核苷酸。
[0041 ] 例如，471A代表第547位氨基酸的三聯(lián)密碼子第1個(gè)核苷酸突變?yōu)锳。
[0042]本發(fā)明共涉及30個(gè)氨基酸的突變，共計(jì)274個(gè)突變位點(diǎn)）
[0043]








[0057]二、采用本發(fā)明試劑盒檢測C-Kit基因 11號外顯子突變
[0058] 1、樣本DNA提取:可以使用Qiagen公司、天根公司、Promega公司等DNA提取試劑盒 提取。
[0059]以石蠟組織樣本，用Qiagen公司試劑盒為例，提取DNA。
[0060] 1)利用手術(shù)刀取出組織邊界無用的石蠟；
[0061 ] 2)將石蠟包埋組織切成4μπι厚的薄片；
[0062] 3)迅速用滅菌小鑷子取2-6枚裝入DNase/RNase Free ΕΡ管中（每張攤開面積500 (最大)mm2,即邊長1.6cm的正方形大?。?br>[0063] 4)加入800μ1二甲苯，振蕩器上震蕩10s，最大轉(zhuǎn)數(shù)離心3分鐘；
[0064] 5)加入800μ1二甲苯，振蕩器上震蕩10s，最大轉(zhuǎn)數(shù)離心3分鐘；
[0065] 6)棄二甲苯，加入800μ1無水乙醇，最大轉(zhuǎn)數(shù)離心3分鐘；
[0066] 7)棄無水乙醇，揮干樣品；
[0067] 8)加入 180μ1 ALT buffer及20μ1 proteinase K，56°C -小時(shí)以上，直至清亮；
[0068] 9) 90 Γ -小時(shí)；
[0069] 10)離心6000g lmin，取上清；（此步驟是防止沉淀物阻塞柱子）
[0070] 11)加入200μ1 AL，混勻，加入200μ1乙醇，再混勻；
[0071] 12)簡單離心清潔管壁；
[0072] 13)將全部混合液加入到DNA分離柱，關(guān)蓋，離心6000g lmin，換新的收集管；
[0073] 14)加入500μ1 AWl，6000g 離心 lmin;換收集管；
[0074] 15)加入500μ1 AW2,6000g 離心 lmin，換收集管；
[0075] 16)全速離心3min，干燥柱子；
[0076] 17)換一只干凈的1.5ml收集管，準(zhǔn)備收集DNA;加入20-30μ1 ATE，在室溫保持lmin 以溶解DNA。全速離心lmin收集DNA。
[0077] 2、定量PCR擴(kuò)增
[0078] c-kit基因突變的擴(kuò)增引物以及檢測探針：
[0079] C11引物組合共7種，每個(gè)突變位點(diǎn)的引物為除開正常堿基序列外的三種堿基(如： 471位點(diǎn)正常人為T，則引物最后一個(gè)堿基分別為A，G，C)，X則代表三種堿基。
[0080] 引物母液濃度均為lOOnM/ml。
[0081] C11A引物：




[0098] c-kit外控引物溶液(Primer溶液)配制如下，配制出引物溶液后，在定量PCR體系 中加入lul即可。
[0101] 1)定量PCR體系配制：
[0103]按照如下表格加樣入8個(gè)PCR管：
[0108] 3、結(jié)果判讀：
[0109] 以外控信號為標(biāo)準(zhǔn)，其信號Ct值在15-25,表明上樣DNA的量在允許范圍以內(nèi)。所有 實(shí)驗(yàn)樣本的外控曲線均應(yīng)該升起，否則重新提取DNA檢測。讀取待檢孔(孔號1) Ct值，Ct值為 〇(或者無擴(kuò)增曲線)或者大于29判讀陰性，判定為無 C11突變;Ct值小于28判讀該信號孔陽 性。28~29重復(fù)實(shí)驗(yàn)，若仍然在28~29判讀C11弱陽性突變。
[0110] 其中，陽性、弱陽性:代表樣品至少有一個(gè)位點(diǎn)突變。 以下用實(shí)驗(yàn)例的方式說明本發(fā)明的有益效果：
[0112] 實(shí)驗(yàn)例1本發(fā)明試劑盒以及方法的準(zhǔn)確度檢測和特異性檢測
[0113] 1、待檢樣本
[0114] 選取已知突變類型為c-kit基因11號外顯子突變的臨床GIST石蠟組織樣本各1例 (共計(jì)90例，涉及本發(fā)明引物能夠檢測的所有氨基酸;其中第547位氨基酸的突變類型測序 結(jié)果見圖1)和已知野生型臨床GIST石蠟組織樣本1例，檢測人類c-kit基因突變類型。
[0115] 2、檢測方法
[0116]本發(fā)明方法:采用實(shí)施例1的試劑盒，按照實(shí)施例1的方法進(jìn)行檢測。
[0117]樣本DNA提取方法:用Qiagen公司試劑盒提?。?br>[0118] 1)利用手術(shù)刀取出組織邊界無用的石蠟；
[0119] 2)將石蠟包埋組織切成4μπι厚的薄片；
[0120] 3)迅速用滅菌小鑷子取2-6枚裝入DNase/RNase Free ΕΡ管中（每張攤開面積500 (最大)mm2,即邊長1.6cm的正方形大??；
[0121] 4)加入800μ1二甲苯，振蕩器上震蕩10s，最大轉(zhuǎn)數(shù)離心3分鐘；
[0122] 5)加入800μ1二甲苯，振蕩器上震蕩10s，最大轉(zhuǎn)數(shù)離心3分鐘；
[0123] 6)棄二甲苯，加入800μ1無水乙醇，最大轉(zhuǎn)數(shù)離心3分鐘；
[0124] 7)棄無水乙醇，揮干樣品；
[0125] 8)加入 180μ1 ALT buffer及20μ1 proteinase K，56°C -小時(shí)以上，直至清亮；
[0126] 9)90°C -小時(shí)；
[0127] 10)離心6000g lmin，取上清；（此步驟是防止沉淀物阻塞柱子）
[0128] 11)加入200μ1 AL，混勻，加入200μ1乙醇，再混勻；
[0129] 12)簡單離心清潔管壁；
[0130] 13)將全部混合液加入到DNA分離柱，關(guān)蓋，離心6000g lmin，換新的收集管；
[0131] 14)加入500μ1 AWl，6000g 離心 lmin;換收集管；
[0132] 15)加入500μ1 AW2,6000g 離心 lmin，換收集管；
[0133] 16)全速離心3min，干燥柱子；
[0134] 17)換一只干凈的1.5ml收集管，準(zhǔn)備收集DNA;加入20-30μ1 ATE，在室溫保持lmin 以溶解DNA。全速離心lmin收集DNA。
[0135] 3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0136] 如果突變型樣本信號Ct值在28以內(nèi)，則表示樣本出現(xiàn)了c-kit基因11號外顯子檢 測突變類型(本發(fā)明30個(gè)氨基酸的突變)中至少一種突變。
[0137] 本發(fā)明90例突變型樣本信號Ct值均在28以內(nèi)，其中第547位氨基酸突變樣本測序 結(jié)果如圖2所示。圖2中，曲線1是突變型樣本信號；曲線2是外控信號，曲線3是陰性對照(野 生型對照)信號，樣本信號Ct值在28以內(nèi)，表示該樣本出現(xiàn)了c-kit基因11號外顯子的第547 位氨基酸發(fā)生突變。
[0138] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，本發(fā)明方法和試劑盒的檢測結(jié)果與已知檢測結(jié)果比較:結(jié)果一致， 說明本發(fā)明方法和試劑盒可以準(zhǔn)確c-kit基因11號外顯子突變，準(zhǔn)確性強(qiáng)；另外，陰性對照 樣本Ct值大于30,為陰性，說明了本發(fā)明方法和試劑盒的特異性好。
[0139] 實(shí)驗(yàn)例2本發(fā)明試劑盒以及方法的靈敏度分析
[0140] 1、試驗(yàn)方法
[0141] 取含有人類c-kit基因11號外顯子突變的DNA，定量至濃度為8ng/ul，進(jìn)行等比稀 釋，稀釋后的濃度分別為8ng/ul、4ng/ul、2ng/ul、lng/ul、0.5ng/ul
[0142] 用實(shí)施例1的試劑盒，按照實(shí)施例1的定量PCR擴(kuò)增進(jìn)行檢測。
[0143] 2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0144] 如圖3所示，本發(fā)明試劑盒可以檢測到濃度為0.5ng/ul的低濃度樣本，靈敏度高。
[0145] 綜上，本發(fā)明提供的試劑盒可以準(zhǔn)確檢測人類C-Kit基因11號外顯子突變，特異性 和靈敏度高，檢測快速、簡便，成本低廉，可以大量推廣使用，臨床應(yīng)用前景良好。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種檢測人類c-kit基因突變類型的試劑盒，其特征在于：它包括SEQ ID NO. 1~275 所示的引物對和SEQ ID NO.276所示的探針。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于：它還包括質(zhì)控引物與質(zhì)控探針：SEQ ID NO.277~279所示引物對與SEQ ID NO.276所示的探針。3. 權(quán)利要求1或2所述的試劑盒在制備檢測人類c-kit基因11號外顯子突變的試劑中的 用途。 4.SEQ ID N0.1~275所示引物對。 5 .SEQ ID NO.276所示的探針。6. -種檢測人類c-kit基因11號外顯子突變的方法，其特征在于:它包括如下步驟： (1) 提取樣本DNA:取待檢組織，提取其中的DNA; (2) 基因擴(kuò)增:用權(quán)利要求1或2所述的試劑盒對待檢樣本中的DNA進(jìn)行擴(kuò)增； (3) 結(jié)果檢測:對DNA擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行檢測。
【文檔編號】C12Q1/68GK105950758SQ201610440446
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年6月17日
【發(fā)明人】肖林, 葉豐, 陳卉嬌
【申請人】四川大學(xué)華西醫(yī)院