從貽貝中提取天然牛磺酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及從貽貝中提取天然?；撬岬姆椒?，屬于化學(xué)提取技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明從貽貝中提取天然?；撬岬姆椒ò铝胁襟E：S1利用貽貝制備含?；撬岬那逡?；S2將所述清液除蛋白；S3將所述步驟S3的產(chǎn)品進(jìn)行分離純化。本發(fā)明的有益效果為：原料取用大連地區(qū)最普遍貽貝作為原料，價(jià)格低廉，屬于低端海產(chǎn)品，和方式提取，不存在環(huán)境污染的問題。且工藝操作簡單，產(chǎn)量大。采用從含牛磺酸量最高的海產(chǎn)品中提取，溫繼而經(jīng)過一列的操作后，無有機(jī)溶劑殘留，做到天然提取。
【專利說明】
從貽貝中提取天然?；撬岬姆椒?br>技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于化學(xué)提取技術(shù)領(lǐng)域，特別是一種從貽貝中提取天然?；撬岬姆椒?。
【背景技術(shù)】
[0002] ?；撬崾且环N含硫的β氨基酸，具有廣泛的生物學(xué)功能，主要有促進(jìn)大腦發(fā)育，增 強(qiáng)視力，調(diào)節(jié)神經(jīng)傳導(dǎo)，促進(jìn)吸收、消化脂肪，參與膽固醇的代謝，維護(hù)心腦血管，內(nèi)分泌機(jī) 能，抗氧化等的作用。因而具有提高記憶力，增強(qiáng)視力，減脂，降低膽固醇，保護(hù)心腦血管，抗 衰老，提高免疫力等都具有一定功效。隨著對(duì)?；撬岬淖饔脵C(jī)理的深入研究，其應(yīng)用也將越 來越廣泛。?；撬嶙鳛槿撕蛣?dòng)物的一種重要營養(yǎng)物質(zhì)，從天然產(chǎn)物中提取一直備受重視。
[0003] 普通食物中?；撬岷繕O低或還有待發(fā)現(xiàn)，但海產(chǎn)品卻含有很高的含量。我國海 洋生物資源豐富，例如牡蠣、扇貝、章魚等海產(chǎn)品中含量豐富，但產(chǎn)品本身價(jià)格比較昂貴，如 果從他們中提取?；撬釀t成本較高。本課題通過前期調(diào)查研究，發(fā)現(xiàn)貽貝、海虹和蝦頭及蝦 的下腳料中同樣含有豐富的?；撬?。這些產(chǎn)品在大連地區(qū)廣泛存在，且價(jià)格低廉。從海產(chǎn)品 中提取?；撬岬墓に嚭唵味鵁o污染，并且用水產(chǎn)品的下腳料提取?；撬嵊志哂协h(huán)保的意 義，前景非常好。
[0004] 自1950年初以來，在世界上開始人工合成?；撬?。目前，國內(nèi)外市場(chǎng)上使用的?；?酸有化學(xué)合成的?；撬岷吞烊慌；撬?，但其中多為化學(xué)合成法生產(chǎn)。雖然合成法?；撬醿r(jià) 格低廉，但存在原料毒性大，工藝操作復(fù)雜，環(huán)境污染等問題。隨著人民生活水平的提高和 綠色化學(xué)的進(jìn)展，人們?cè)絹碓教岢褂锰烊惶崛〉呐；撬?。因此，從天然產(chǎn)物中提取?；撬?成為市場(chǎng)迫切需求，具有很大的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，將?；撬嵬ㄟ^除蛋白、脫色、分離純化等 方法從蝦中提取。
[0006] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題是采取以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:從貽貝中提取天然?；撬岬?方法，包含下列步驟:S1利用貽貝制備含?；撬岬那逡?S2將所述清液除蛋白；S3將所述步 驟S2的產(chǎn)品進(jìn)行分離純化。
[0007] 優(yōu)選地，所述步驟S1包含下列步驟:S1.1將貽貝清洗去殼取出貽貝肉；S1.2將將貽 貝肉放入到組織搗碎機(jī)中勻漿;S1.3將勻漿后貽貝肉稱重并用3倍質(zhì)量的水稀釋;S1.4調(diào)節(jié) pH值;S1.5放入恒溫培養(yǎng)箱里進(jìn)行水提取;S1.6將水提取產(chǎn)物進(jìn)行過濾，取濾液。
[0008] 優(yōu)選地，所述步驟S2包含下列步驟:S2.1除酸性蛋白；S2.2除堿性蛋白。
[0009] 優(yōu)選地，所述步驟S2.1除酸性蛋白采用鹽酸將所述步驟S1產(chǎn)物的pH調(diào)至3-4,然后 在4500r/min下離心20分鐘，并收集上清液。
[0010] 優(yōu)選地，所述步驟S2.2除堿性蛋白采用氫氧化鈉將所述步驟S2.1的產(chǎn)物的pH調(diào)至 9-10,在4500r/min下離心20分鐘，收集上清液。
[0011] 優(yōu)選地，所述步驟S3的具體步驟為:S3.1調(diào)節(jié)所述步驟S2產(chǎn)物的pH到4-5; S3.2將 所述步驟S3.1的產(chǎn)物注入強(qiáng)酸性陽離子樹脂交換柱，并采用蒸餾水進(jìn)行洗脫;S3.3收集吸 光度最高峰值〇. 55左右的部分流出液。
[0012] 優(yōu)選地，所述步驟S2與所述步驟S3之間存在對(duì)所述步驟S2產(chǎn)物進(jìn)行脫色的步驟。
[0013] 優(yōu)選地，所述脫色步驟具體包含：向所述步驟S2的產(chǎn)物中加入活性炭進(jìn)行脫色。
[0014] 優(yōu)選地，向每100mL所述步驟S2的產(chǎn)物中加入2~3g活性炭。
[0015] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是:原料無毒性益獲取，不存在環(huán)境污染的問題。且工藝 操作簡單，產(chǎn)量大。采用從含?；撬崃孔罡叩暮．a(chǎn)品中提取，取用大連地區(qū)最普遍的貽貝作 為原料。溫和方式提取，繼而經(jīng)過一列的操作后，無有機(jī)溶劑殘留，做到天然提取。
【附圖說明】
[0016] 圖1為?；撬岬臉?biāo)準(zhǔn)曲線圖；
[0017] 圖2為pH對(duì)?；撬崽崛∮绊懬€圖；
[0018] 圖3為酶解時(shí)間對(duì)?；撬崽崛∮绊懬€圖；
[0019] 圖4為酶解溫度對(duì)牛磺酸提取影響曲線圖；
[0020] 圖5為各因素效應(yīng)曲線圖；
[0021 ]圖6為?；撬針?biāo)準(zhǔn)品紅外光譜圖；
[0022] 圖7為實(shí)驗(yàn)提取牛磺酸的紅外光譜圖；
[0023] 圖8為牛磺酸標(biāo)準(zhǔn)品核磁共振氫譜圖；
[0024] 圖9為?；撬針悠菲泛舜殴舱駳渥V圖。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 下面結(jié)合附圖、通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳述。以下實(shí)施例只是描述性 的，不是限定性的，不能以此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例中所述實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說 明，均為常規(guī)方法;如無特殊說明，所述試劑和器材，均可從商業(yè)途徑獲得。
[0026] 實(shí)驗(yàn)試劑
[0028]實(shí)驗(yàn)儀器
[0030]標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程的確定
[0031 ]分別取 10mmol/L 牛橫酸標(biāo)準(zhǔn)液 OmL、lmL、2mL、4mL、6mL、8mL、10mL，定容至 10mL，各 取一毫升，加入lml顯色劑、8ml lmol/L醋酸鈉，在400nm下測(cè)量0D值，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線（如圖 1)〇
[0032] 顯色劑由10ml lmol/L醋酸鈉、0.4ml乙酰丙酮、lml甲醛用去離子水定容至25ml配 制，需臨用現(xiàn)配。顏色反應(yīng)背后的原因是，在含有醋酸鈉的溶液中，牛磺酸與乙酰丙酮和甲 醛在高溫條件下可以產(chǎn)生N-取代基2，6-二甲基3，5-二乙?；?，4二氫吡啶。這種配合物能 夠呈現(xiàn)出明顯的黃色，并且?；撬岷吭礁?，則顏色越明顯，最大吸收波長為390~400nm。
[0033] 本發(fā)明所使用的?；撬犸@色原理為：在醋酸鈉存在下，?；撬崤c乙酰丙酮和甲醛 經(jīng)加熱反應(yīng)生成N-取代基2，6-二甲基3，5-二乙?；?，4二氫吡啶配合物。該配合物顯黃色， 其吸光度與?；撬岷吭谝欢ǚ秶鷥?nèi)成正比，最大吸收波長為390~400nm。
[0034] 實(shí)施例1
[0035]步驟1:含?；撬崆逡旱闹苽?br>[0036]將貽貝肉粉碎，加入純水，攪拌10min，攪拌器轉(zhuǎn)速30r/min，將經(jīng)過勻漿的蝦肉用 等量體積的水稀釋后調(diào)節(jié)pH值至中性。
[0037] 步驟2:超聲破碎
[0038]為方便?；撬岣玫娜谌雱驖{液中，根據(jù)實(shí)驗(yàn)組的不同，使用超聲波破碎儀分別 進(jìn)行5min、10min、15min、20min、25min的破碎，利用水循環(huán)抽濾機(jī)對(duì)勾衆(zhòng)液進(jìn)行過濾，取濾 液。
[0039]步驟3:酶法粗提牛磺酸
[0040] 取破碎好的勾衆(zhòng)液30ml，向其中加入0.5g中性木瓜蛋白酶，混勾后調(diào)節(jié)pH至指定 值放入指定溫度恒溫水域鍋中，靜置20min，中間攪動(dòng)幾次。將提取完成的勻漿液，放入100 攝氏度的水浴鍋中加熱15min，使木瓜蛋白酶在高溫作用下失去活性。
[0041]單因素實(shí)驗(yàn)過程中，取三個(gè)變量，除上述提到的超聲波破碎時(shí)間，還有酶提取的溫 度和pH，每個(gè)變量各設(shè)五個(gè)水平。經(jīng)查詢，實(shí)驗(yàn)所使用的木瓜蛋白酶的使用pH為6~7，使用 溫度為55~65°C，我將其pH范圍擴(kuò)至5.5~7.5，并以每相差0.5為一個(gè)檔進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)； 將其溫度范圍擴(kuò)至45~65°C，并以每5°C為一個(gè)檔。
[0042]正交實(shí)驗(yàn)過程當(dāng)中，依據(jù)鐘形曲線，從五個(gè)條件設(shè)置中選出四個(gè)條件，進(jìn)行三因素 四水平的正交實(shí)驗(yàn)。
[0043] 步驟4:除蛋白
[0044] 取滅酶后的蛤蜊肉勻漿液(提取液），使用循環(huán)水真空抽濾裝置反復(fù)抽濾2~3次至 提取液呈微微發(fā)白的清澈溶液。
[0045] 用5%HC1(質(zhì)量比，下文所提到的所有百分比均為質(zhì)量比）調(diào)節(jié)提取液pH至4~5， 常溫、4500r/min離心15min。留上清液。
[0046] 上一步中獲得的上清液用濃度為5%Na0H調(diào)節(jié)pH至9~10,并繼續(xù)在常溫條件下、 以4500r/min的速度離心15min。留上清液。
[0047] 步驟5:脫色
[0048]向收集的上清液中加入適量的活性炭進(jìn)行脫色，優(yōu)選方案為每100mL加入2~3g， 將過濾后的溶液pH用5 % HC1調(diào)節(jié)至4.5，待用。
[0049] 步驟6:分離純化
[0050]吸取8. OmL收集的溶液注入7cm X 60cm強(qiáng)酸性陽離子樹脂交換柱，并采用蒸餾水進(jìn) 行洗脫，洗脫速度在2mL/min，收集吸光度最高峰值左右的部分流出液。
[0051 ]步驟7:提取量的測(cè)定
[0052] 采用甲醛-乙酰丙酮法測(cè)定?；撬岬奶崛×?。取lmL流出液或其稀釋液，加 lmol/L 醋酸鈉溶液8mL，加入1 mL甲醛-乙酰丙酮作為顯色齊I」，配制1 OmL溶液，在10 0 °C水浴中保溫15 分鐘，冷卻至室溫，在400nm波長處測(cè)定吸光度，通過?；撬針?biāo)準(zhǔn)溶液吸收曲線（如圖1所 示），確定?；撬岬奶崛×?。
[0053]步驟8:檢測(cè)結(jié)晶
[0054]采用紫外分光光度法檢測(cè)含有?；撬岬慕M分，將其放到4°C冰箱中放置2h，得到牛 磺酸粗品結(jié)晶。將粗品重新溶解于水，過濾后，再加入無水乙醇，放置于4°C重結(jié)晶，將固液 進(jìn)行分離，如此結(jié)晶，再反復(fù)重結(jié)晶，即可得到純的牛磺酸晶體。
[0055]單因素實(shí)驗(yàn)
[0056]取50克貽貝肉，加入150克去離子水，放入組織粉粹機(jī)制成勻漿液;將勻漿液分成 均等的5份，并依次將勻漿液pH值調(diào)成5、5.5、6、6.5、7，溫度控制在55 °C，加入濃度為0.6 % 的木瓜蛋白酶，在超聲波細(xì)胞破碎儀作用下進(jìn)行細(xì)胞破碎提取15min。得出pH對(duì)?；撬崽崛?的影響結(jié)果如圖2所示。
[0057]根據(jù)圖2及數(shù)據(jù)分析得pH= 5.5時(shí)牛磺酸提取得率最高，在pH5.5以后，?；撬岬牡?率在依次下降。故確定最佳pH條件為5.5。
[0058]取50克貽貝肉，加入150克去離子水，放入組織粉粹機(jī)制成勻漿液;將勻漿液分成 均等的5份，并依次設(shè)置超聲波_酶解破碎時(shí)酶解時(shí)間為5min、10min、15min、20min、25min， pH控制在5.5，酶解溫度為55°C。加入濃度為0.6%的木瓜蛋白酶，在超聲波細(xì)胞破碎儀作用 下進(jìn)行細(xì)胞破碎提取。
[0059]根據(jù)圖3可知酶解時(shí)間在20min時(shí)，?；撬岬奶崛÷蔬_(dá)到峰值，酶解20min以后?；?酸得率呈下降趨勢(shì)，故確定最適酶解時(shí)間為20min。
[0060]取50克貽貝肉，加入150克去離子水，放入組織粉粹機(jī)制成勻漿液;將勻漿液分成 均等的5份，并依次設(shè)置超聲波酶解破碎時(shí)酶解溫度依次為45°C、50°C、55°C、60°C、65°C，pH 控制在5.5，加入濃度為0.6 %的木瓜蛋白酶，在超聲波細(xì)胞破碎儀作用下進(jìn)行細(xì)胞破碎提 取15min。得酶解溫度對(duì)牛磺酸提取的影響結(jié)果如圖4所示。
[0061] 根據(jù)圖4可知，最初提取時(shí)間逐漸延續(xù)，牛磺酸的提取得率也隨著時(shí)間的延續(xù)極顯 著提高，且60°C前?；撬崽崛〉寐试黾于厔?shì)十分明顯，當(dāng)提取時(shí)間在60°C時(shí)，?；撬岬奶崛?得率最大，此后時(shí)間再延續(xù)，?；撬岬奶崛〉寐示陀?0°C時(shí)的得率，故選擇60°C為最佳提 取時(shí)間。
[0062] 正交實(shí)驗(yàn) [0063] 表1實(shí)驗(yàn)因素表
[0066]根據(jù)設(shè)計(jì)的正交實(shí)驗(yàn)表進(jìn)行操作，得到正交結(jié)果表2。
[0067] 表2正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果直觀分析表
[0068]
[0069]根據(jù)分光光度法測(cè)定牛磺酸的提取量，確定標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為￥ = 2.22571_ 0.01857，R2 = 0.99118,可確定材料蛤蜊中所選擇的單因素條件符合線性規(guī)律，可作為正交 實(shí)驗(yàn)的水平條件，確定信息如圖5所示。
[0070] 根據(jù)直觀分析表中數(shù)據(jù)可知，酶解溫度、PH、破碎時(shí)間的極差依次減小，說明酶解 溫度、pH、破碎時(shí)間對(duì)牛磺酸提取實(shí)驗(yàn)的影響順序依次為酶解溫度〉pH>破碎時(shí)間。根據(jù)表確 定最佳提取條件為pH為5.5，超聲波-酶解破碎時(shí)間為20min，破碎溫度為60 °C。
[0071] 紅外檢測(cè)
[0072] 在?；撬岬募t外檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，采用了溴化鉀壓片法，具體實(shí)驗(yàn)的實(shí)施是參照國家 標(biāo)準(zhǔn)GB/T 6040-2002《紅外光譜分析方法通則》進(jìn)行的。如圖6、7,比對(duì)樣品和?；撬針?biāo)準(zhǔn)品 的紅外吸收峰圖片，可獲知經(jīng)無水乙醇處理析出的白色針狀晶體就是高純度天然?；撬帷?[0073]核磁檢測(cè)
[0074]如圖8、9,所示，核磁共振譜圖中出現(xiàn)三個(gè)信號(hào)，說明有三種不同種類的H，非別是δ 4.646、δ3.296和δ3.132[27 ]經(jīng)比對(duì)，這些數(shù)據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)品相類似，說明從蝦勻漿液中獲取的 白色針狀晶體為高純度天然?；撬峋w。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 從貽貝中提取天然?；撬岬姆椒?，其特征在于，包含下列步驟： Sl利用貽貝制備含?；撬岬那逡?； S2將所述清液除蛋白； S3將所述步驟S2的產(chǎn)品進(jìn)行分離純化。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的從貽貝中提取天然?；撬岬姆椒?，其特征在于，所述步驟Sl包 含下列步驟： Sl. 1將貽貝清洗去殼取出貽貝肉； Sl. 2將貽貝肉放入到組織搗碎機(jī)中勻漿； SI.3將勻漿后貽貝肉稱重并用3倍質(zhì)量的水稀釋； SI. 4調(diào)節(jié)pH值； Sl. 5放入恒溫培養(yǎng)箱里進(jìn)行水提??； Sl. 6將水提取產(chǎn)物進(jìn)行過濾，取濾液。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的從貽貝中提取天然?；撬岬姆椒ǎ涮卣髟谟?，所述步驟S2包 含下列步驟： S2.1除酸性蛋白； S2.2除喊性蛋白。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的從貽貝中提取天然?；撬岬姆椒?，其特征在于，所述步驟S2.1 除酸性蛋白采用鹽酸將所述步驟Sl產(chǎn)物的pH調(diào)至3-4,然后在4500r/min下離心20分鐘，并 收集上清液。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的從貽貝中提取天然?；撬岬姆椒?，其特征在于，所述步驟S2.2 除堿性蛋白采用氫氧化鈉將所述步驟S2.1的產(chǎn)物的pH調(diào)至9-10,在4500r/min下離心20分 鐘，收集上清液。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的從貽貝中提取天然?；撬岬姆椒?，其特征在于，所述步驟S3的 具體步驟為： S3.1調(diào)節(jié)所述步驟S2產(chǎn)物的pH到4.5; S3.2將所述步驟S3.1的產(chǎn)物注入強(qiáng)酸性陽離子樹脂交換柱，并采用蒸餾水進(jìn)行洗脫； S3.3收集吸光度最高峰值0.55左右的部分流出液。7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6任一權(quán)利要求所述的從貽貝中提取天然牛磺酸的方法，其特征在 于，所述步驟S2與所述步驟S3之間存在對(duì)所述步驟S2產(chǎn)物進(jìn)行脫色的步驟。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的從貽貝中提取天然?；撬岬姆椒?，其特征在于，所述脫色步驟 具體包含：向所述步驟S2的產(chǎn)物中加入活性炭進(jìn)行脫色。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的從貽貝中提取天然?；撬岬姆椒?，其特征在于，向每IOOmL所 述步驟S2的產(chǎn)物中加入2~3g活性炭。
【文檔編號(hào)】C07C309/14GK105949089SQ201610556023
【公開日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年7月14日
【發(fā)明人】馬金龍, 于克春, 劉璇, 孫垚, 嚴(yán)鑫
【申請(qǐng)人】大連民族大學(xué)