一種用于檢測植物microRNA靶基因的載體及檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于檢測植物microRNA靶基因的載體及檢測方法，可用于所有植物microRNA與靶基因相互作用的研究。該載體構建，主要通過PCR、純化、酶切、連接和轉(zhuǎn)化等分子生物學手段，在Luc基因的3′端添加多克隆位點，便于將靶基因與microRNA相互作用的堿基添加到載體中。將含有microRNA過表達載體的根癌農(nóng)桿菌工程菌和microRNA靶基因根癌農(nóng)桿菌工程菌共侵染本氏煙，通過Luc/Ren的相對表達檢測microRNA與靶基因是否存在相互作用。本發(fā)明可簡單、快速的檢測植物microRNA與靶基因的相互作用。
【專利說明】
-種用于檢測植物m i croRNA卽基因的載體及檢測方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術領域，具體設及一種用于檢測植物microRNA祀基因的載體及 應用方法。
【背景技術】
[0002] 近年來，microRNA(miRNA)已成為科學研究的熱點。miRNA廣泛存在于動植物體內(nèi)， 是由內(nèi)源基因編碼的長度約21~25nt的一類非編碼單鏈RNA，與祀基因mRNA結合，在轉(zhuǎn)錄后 水平上介導祀基因mRNA的降解或抑制祀基因的翻譯。
[0003] 目前，基于高通量測序的應用，在擬南芥、水稻、番茄和玉米等植物種均發(fā)現(xiàn)了大 量的miRNA,而且在生長發(fā)育、信號轉(zhuǎn)導和逆境響應中發(fā)揮重要作用。生長素是一種重要的 植物激素，調(diào)芐基因的表達影響植物的生長和發(fā)育，其中生長素響應因子(Auxin response factors，ARFs)位于生長素的下游調(diào)控相關基因的表達。擬南芥ARF6和ARF8促進花莖的伸 長及花瓣、雄蕊和雌蕊后期的發(fā)育。番茄中過表達擬南芥miR167a，降低了 ARF6和ARF8的表 達，節(jié)間短縮，導致雄性不育。水稻miR397負調(diào)控LAC，控制谷粒的大小和花序的分支。此外， miR169是與植物抗旱相關的miRNA。干旱和ABA處理抑制擬南芥miR169的表達，其祀基因 NFYA5被干旱和ABA誘導，過表達miR169a抑制了 NFYA5的表達，增加了葉片失水率和干旱的 敏感性。miR399參與憐元素的代謝，被低憐脅迫所誘導，保持體內(nèi)憐的平衡和穩(wěn)定。
[0004] miRNA在生物進程中發(fā)揮重要的作用，盡管高通量測序等技術便于發(fā)掘新的和特 異性表達的miRNA,但是如何尋找和驗證miRNA的祀基因尚不完善。有些學者利用GFP等巧光 蛋白的強度檢測miRNA的祀基因，但是農(nóng)桿菌的活力、煙草的生長狀態(tài)均會影響巧光的強 弱。利用miRNA的過表達植株檢測祀基因的相對表達，結果可靠但周期長。因此探索一項簡 單、快速、可靠的檢測miRNA的祀基因的方法具有重要的理論和現(xiàn)實意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供一種用于檢測植物microRNA祀基因的載體及應用，簡單、快速、可靠的 檢測HiRNA的祀基因。
[0006] -種用于檢測植物microRNA祀基因的載體，包括原始載體和依次插入原始載體的 35S啟動子、Ren基因和LUC基因，所述Luc基因的y端添加多克隆位點。
[0007] 優(yōu)選地，所述原始載體為pFG巧941載體。
[000引本發(fā)明還提供一種用于檢測植物microRNA祀基因的載體的構建方法，包括如下步 驟：
[0009] (1)將35S啟動子連入pGreenII Luc載體得重組載體pACOOl，將Ren基因連入 PFGC5941載體中得重組載體PAC002;
[0010] (2)根據(jù)Luc序列設計特異性引物，并在引物上分別加上限制性酶切位點AscI和 SmaI,然后W所述重組載體pACOOl為模板對Luc基因進行擴增，擴增產(chǎn)物連入重組載體 PAC002中即得。
[0011] 本發(fā)明還提供一種檢測植物microRNA祀基因的方法，包括如下步驟：
[0012] (1)構建含有植物microRNA過表達載體的根癌農(nóng)桿菌工程菌A;構建含待檢測基因 和報告基因的融合表達載體的根癌農(nóng)桿菌工程菌B;
[0013] (2)將所述根癌農(nóng)桿菌工程菌A和根癌農(nóng)桿菌工程菌B共侵染本氏煙，通過報告基 因的表達量判斷待檢測基因是否為所述植物microRNA的目標基因。
[0014] 優(yōu)選地，所述根癌農(nóng)桿菌工程菌B的構建方法如下：
[0015] (1)將35S啟動子連入pGreenII Luc載體得重組載體pACOOl，將Ren基因連入 PFGC5941載體中得重組載體PAC002;
[0016] (2)根據(jù)Luc序列設計特異性引物，并在引物上分別加上限制性酶切位點AscI和 SmaI,然后W所述重組載體pACOOl為模板對Luc基因進行擴增，擴增產(chǎn)物連入重組載體 PAC002中得重組載體PAC006;
[0017] (3)將帶檢測基因連入重組載體PAC006的Luc基因的y端多克隆位點，得重組載體 重組載體PAC004;
[0018] (4)將所得重組載體PAC004轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌GV3101得所述根癌農(nóng)桿菌工程菌B。
[0019] 35S啟動子的擴增引物序列：
[0020] pGreenII35S-F：CCGCTCGAGGTACCCCTACTCCAAAAATG
[0021] pGreenII35S-R：ACGCGTCGACGTCCTCTCCAAATGAAATG；
[0022] Ren基因的擴增引物序列：
[0023] pGreenII Ren-F：attcgagctcGTACCCCTACTCCAAAAATGTCAAA
[0024] pGreenII Ren-R：gattgggcgcgccGATCTGGATTTTAGTACTGGATTTTGG；
[0025] Luc基因的擴增引物序列：
[00%] pGreenII Luc-F:gatcggcgcgccGTACCCCTACTCCAAAAATGTCAAA
[0027] pGreenII Luc-R:tagtcccgg巧TAATTAATCTAGAGGATCCTTACACGGCGATCTTTCCGC。
[00%]優(yōu)選地，所述根癌農(nóng)桿菌工程菌A的構建方法如下：
[0029] 將植物microRNA前體序列連入PFGC1008載體中，得過表達載體，將過表達載體轉(zhuǎn) 入根癌農(nóng)桿菌GV3101即得。
[0030] 植物microRNA為本領域常見的所有植物microRNA，優(yōu)選地，所述植物microRNA為 miR6027〇
[0031] 當所述植物microRNA為miR6027時，優(yōu)選地，所述待檢測基因為ATGl&i基因。
[0032] 本發(fā)明通過報告基因的表達量判斷待檢測基因是否為所述植物microRNA的目標 基因，檢測原理如下：
[0033] 當microRNA與目標基因結合時，會促進Luc的降解或抑制其翻譯，與對照相比， Luc/Ren的相對表達降低；如果microRNA與目標基因不能結合，對Luc沒有影響，Luc/Ren的 相對表達與對照保持一致。本發(fā)明將待檢測基因與Luc/Ren進行融合表達，根據(jù)連接待檢測 基因后Luc/Ren的相對表達是否降低判斷該待檢測基因是否為microRNA的目標基因，連接 待檢測基因后與對照相比，Luc/Ren的相對表達降低，證明該待檢測基因microRNA的目標基 因；連接待檢測基因后Luc/Ren的相對表達與對照保持一致，證明該待檢測基因不是 microRNA的目標基因。
[0034] 本發(fā)明采用含有雙巧光素酶報告基因（巧光素酶Luc和海腎巧光素酶Ren)的質(zhì)粒 pGreenII Luc，經(jīng)過PCR、純化、酶切、連接、轉(zhuǎn)化，將35S啟動子和Ren和Luc序列連在 pFG巧941載體上，在Luc序列y端添加酶切位點，將質(zhì)粒命名為PAC006。
[0035] 本發(fā)明主要設及miRNA祀基因的研究。設計圍繞miRNA與祀基因相互作用，將互作 的區(qū)域連在PAC006載體酶切位點處，增力曲iRNA祀基因研究的靈活性和簡便性。
[0036] 與現(xiàn)有方法相比，本發(fā)明的有益效果如下：請補充本發(fā)明無需轉(zhuǎn)基因，可快速、方 便的檢測miRNA的祀基因，克服了轉(zhuǎn)基因操作繁瑣、耗時長的缺陷，解決了不適合轉(zhuǎn)基因物 種祀基因驗證的難題，而且可W集約化、批量化操作。
【附圖說明】
[0037] 圖1為PAC006質(zhì)粒圖譜示意圖。
[003引圖2為35S的PCR擴增結果圖。M，DNA maker;1，35S的PCR產(chǎn)物；2,無模板的陰性對 照。
[0039] 圖3為為Ren的PCR擴增結果圖。M，DNA maker; 1，Ren的PCR產(chǎn)物；2，無模板的陰性對 照。
[0040] 圖4為Luc的PCR擴增結果圖。M，DNA maker; 1，Luc的PCR產(chǎn)物；2，無模板的陰性對 照。
[0041 ] 圖5為miR6027的PCR擴增結果圖。M，DNA maker;l，miR6027的PCR產(chǎn)物;2,無模板的 陰性對照。
[0042] 圖6A和圖她為miR6027與ATG1&1的堿基配對圖。
[0043] 圖6C為侵染后72h miR6027的相對表達量。
[0044] 圖抓為侵染后72h Luc/Ren的相對表達。
【具體實施方式】
[0045] 下述實施例中所用實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法，包括PCR、純化、酶切、 連接、轉(zhuǎn)化、測序等幾個步驟。
[0046] 下述實施例中所用實驗材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0047] 下面結合具體實施例對本發(fā)明進一步進行描述。
[004引實施例1
[0049] 35S啟動子連入pGreenII Luc載體
[0050] 1. PCR 擴增
[0化1] 根據(jù)35S序列設計特異性引物(表1中的pGreenII35S-F和pGreenII35S-R)，并在引 物上分別加上限制性酶切位點(XhoI和Sail),然后對35S啟動子進行擴增，純化、酶切，連接 到pGreenII Luc載體中，PCR電泳圖如圖2。
[0化2] PCR反應體系如下：
[0化3]
[0化4]
[0化5]
[0056] 2.純化
[0057] PCR反應結束后根據(jù)普通PCR產(chǎn)物純化試劑盒(TIANGEN)操作說明書進行，具體步 驟如下：
[005引（1)柱平衡步驟：向吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中）加入500化的平衡液化， 12，OOOrpm(~13，400 X g)離屯、Imin，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB2重新放回收集管 中；
[0059] (2)估計PCR反應液或酶切反應液的體積，向其中加入5倍體積的結合液PB，充分混 勻；
[0060] (3)將第(2)步所得溶液加入一個吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中），室溫放置 2min，12,000巧m(~13,400Xg)離屯、30-60sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB2放入收 集管中；
[0061 ] (4)向吸附柱CB2中加入60化L漂洗液PW(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇）， 12,000rpm(~13,400Xg)離屯、30-60sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB2放入收集管 中；
[0062] (5)重復操作步驟(4);
[0063] (6)將吸附柱CB2放回收集管中，12,000rpm(~13,400Xg)離屯、2min，盡量除去漂 洗液。將吸附柱CB2置于室溫放置數(shù)分鐘，徹底地驚干，W防止殘留的漂洗液影響下一步的 實驗；
[0064] (7)將吸附柱CB2放入一個干凈的離屯、管中，向吸附膜中間位置懸空滴加30-5化L 洗脫緩沖液邸，室溫放置2min，12，000巧m(~13，400 X g)離屯、2min收集DNA溶液。
[0065] 3.酶切PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒
[0066] PCR產(chǎn)物酶切反應體系如下：
[0067]
[006引
[0069]
[0070] 37°C解育化，酶切結束后根據(jù)普通PCR產(chǎn)物純化試劑盒進行純化，具體步驟同上。
[0071] 4.連接
[0072] 采用全式金生物公司的T4連接酶連接，具體步驟如下：
[0073] 123456789101112 ....... 2
[00巧]16°C連接過夜 3 5.轉(zhuǎn)化大腸桿菌 4 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，具體步驟，如下： 5
[007引（1)從-80°C冰箱中取出感受態(tài)細胞懸液，放置于冰上使其解凍，每SOiiL分裝一管； 6 (2)每管加入連接產(chǎn)物化L，輕輕搖勻，冰上放置30min; 7 (3) 42 r水浴中熱擊45s，然后置于冰上冷卻2-5min; 8 (4)向離屯、管中加入8(K)化不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，混勻后37°C振蕩培養(yǎng)化， 使細菌恢復正常生長狀態(tài)，并表達質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因； 9 (5)300化pm離屯、2min，倒置離屯、管去掉部分上清，留下100-20化L，用移液槍吸打 混勻，涂布于含有Kan抗性的LB平板上，37°C倒置培養(yǎng)過夜。 10 6.測序 11 挑取單克隆于ImL含有Kan抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)化，送上海桑尼 生物公司測序，測序結果正確的質(zhì)粒命名為pACOOl。 12 表1 35S擴增引物序列表
[00861
[0087] 實施例2
[0088] Ren 基因連接 PFGC5941
[0089] 1. PCR 擴增
[0090] 根據(jù)Ren序列設計特異性引物(表2中的pGreenII Ren-F和pGreenII Ren-R),并在 引物上分別加上限制性酶切位點（SacI和AscI),然后對Ren基因進行擴增，純化、酶切，連接 到pFG巧941載體中，PCR電泳圖如圖3。
[0091] PCR反應體系化下：
[0092]
[0093]
[0094]
[0095]
[0096] 2.純化
[0097] PCR反應結束后根據(jù)普通PCR產(chǎn)物純化試劑盒(TIANGEN)操作說明書進行，具體步 驟同實施例1。
[009引 3.酶切PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒
[0099] PCR產(chǎn)物酶切反應體系如下：
[0100]
[0101] J
[0102]
[0103] 37°C解育化，酶切結束后PCR產(chǎn)物根據(jù)普通PCR產(chǎn)物純化試劑盒(TIANGEN)進行純 化，具體步驟同實施例1。質(zhì)粒根據(jù)DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒(TIANGEN)進行純化，具體步 驟如下：
[0104] (1)柱平衡步驟：向吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中）加入500化的平衡液化， 12,000rpm(~13,400Xg)離屯、lmin，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CA2重新放回收集管 中；
[0105] (2)將單一的目的DNA條帶從瓊脂糖凝膠中切下（盡量切除多余部分)放入干凈的 離屯、管中，稱取重量；
[0106] (3)向膠塊中加入等倍體積溶液PN(如果凝膠重為0.1 g,其體積可視為10化1，則加 入10化1 PN溶液），50°C水浴放置，其間不斷溫和地上下翻轉(zhuǎn)離屯、管，W確保膠塊充分溶解。 如果還有未溶的膠塊，可繼續(xù)放置幾分鐘或再補加一些溶膠液，直至膠塊完全溶解；
[0107] (4)將第(3)步所得溶液加入一個吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中），室溫放置 2min，12,000巧m(~13,400Xg)離屯、30-60sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CA2放入收 集管中；
[0108] (5)向吸附柱CA2中加入60化L漂洗液PW(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇）， 12,000rpm(~13,400Xg)離屯、30-60sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CA2放入收集管 中。
[0109] (6)重復操作步驟(5);
[0110] (7)將吸附柱CA2放回收集管中，12,000rpm(~13,400Xg)離屯、2min，盡量除盡漂 洗液。將吸附柱CA2置于室溫放置數(shù)分鐘，徹底地驚干，W防止殘留的漂洗液影響下一步的 實驗；
[0111] (8)將吸附柱CA2放入一個干凈的離屯、管中，向吸附膜中間位置懸空滴加30-5化L 洗脫緩沖液邸，室溫放置2min，12，000巧m(~13，400 X g)離屯、2min收集DNA溶液。
[0112] 4.連接
[0113] 采用全式金生物公司的T4連接酶連接，具體步驟同實施例1。
[0114] 5.轉(zhuǎn)化大腸桿菌
[0115] 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，具體步驟同實施例1。
[0116] 6.測序
[0117] 挑取單克隆于ImL含有Kan抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)化，送上海桑尼 生物公司測序，測序結果正確的質(zhì)粒命名為PAC002。
[011引表2 Ren基因擴增引物序列表 [0119]
[i
[0121] 實施例3
[0122] PAC006載體構建
[0123] 1. PCR 擴增
[0124] 根據(jù)Luc序列設計特異性引物(表3中的pGreenII Luc-F和pGreenII Luc-R),并在 引物上分別加上限制性酶切位點(AscI和SmaI),然后對Luc基因進行擴增，純化、酶切，連接 到PAC002載體中，PCR電泳圖如圖4。
[01巧]PCR反應體系如下：
[0126]
[0127]
[012 引
[0129] 2.純化
[0130] PCR反應結束后根據(jù)普通PCR產(chǎn)物純化試劑盒(TIANGEN)操作說明書進行，具體步 驟同實施例1。
[0131] 3.酶切PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒
[0133]
[0132] PCR產(chǎn)物酶切反應體系如下：
[0134]
[0135]
[0136]
[0137] 37 °C解育化，酶切結束后PCR產(chǎn)物根據(jù)普通PCR產(chǎn)物純化試劑盒進行純化，具體步 驟同實施例1。質(zhì)粒根據(jù)DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒進行純化，具體步驟如實施例2。
[013引 4.連接
[0139] 采用全式金生物公司的T4連接酶連接，具體步驟同實施例1。
[0140] 5.轉(zhuǎn)化大腸桿菌
[0141] 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，具體步驟同實施例1。
[01創(chuàng) 6.測序
[0143] 挑取單克隆于ImL含有Kan抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)化，送上海桑尼 生物公司測序，測序結果正確的質(zhì)粒命名為PAC006。
[0144] 表3 Luc基因擴增引物序列表
[0145]
[0146] 實施例4
[0147] 番茄miR6027過表達載體構建
[014引根據(jù)11111?8日3日數(shù)據(jù)庫化1:19://\￥麗.111；[1'6日3日.0'旨/)查找番茄11111?6027的前體序列及 在染色體上的位置，設計可W擴增miR6027前體序列的引物（表4中的1008-miR6027S和 1008-miR6027R)，并在引物上分別加上限制性酶切位點(AscI和BamHI),然后對miR6027的 前體進行擴增，純化、酶切，連接到pFGCl 008載體中，PCR電泳圖如圖5。
[0149] PCR反應體系如下：
[0150]
[0151] ]
[0152]
[0153] 2.純化
[0154] PCR反應結束后根據(jù)普通PCR產(chǎn)物純化試劑盒(TIANGEN)操作說明書進行，具體步 驟同實施例1。
[01巧]3.酶切PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒
[0156] PCR產(chǎn)物酶切反應體系如下：
[0157]
[015 引
[0159]
[0160] 37°C解育化，酶切結束后PCR產(chǎn)物根據(jù)普通PCR產(chǎn)物純化試劑盒（TIANGEN)進行純 化，具體步驟同實施例1。質(zhì)粒根據(jù)DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒(TIANGEN)進行純化，具體步 驟如實施例2。
[0161] 4.連接
[0162] 采用全式金生物公司的T4連接酶連接，具體步驟同實施例1。
[0163] 5.轉(zhuǎn)化大腸桿菌
[0164] 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，具體步驟同實施例1。
[01例 6.測序
[0166] 挑取單克隆于ImL含有CM抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)化，送上海桑尼生 物公司測序，測序結果正確的質(zhì)粒命名為PAC003,電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，獲得含有番茄 miR6027過表達的根癌農(nóng)桿菌工程菌A。
[0167] 表4番茄miR6027擴增引物序列表 [01ARl
[0169] 實施例5
[0170] 番茄miR6027祀基因檢測
[0171] 本實施例中WmiR6027為例用于說明PAC006載體的使用方法，其它miRNA的使用方 法與本實例相同。
[0172] 本實施例中用的培養(yǎng)基和抗生素配制方法如下：
[017：3] Y邸培養(yǎng)基的配制：5g牛肉膏，Ig酵母提取物，5g蛋白腺，0.5g MgS〇4 ? 7此0,5g薦 糖，用蒸饋水定容至IL，調(diào)節(jié)抑值為7.0，121°C高壓滅菌20min備用。Y邸固體培養(yǎng)基每升加 瓊脂粉15g，其它分成份同液體培養(yǎng)基。
[0174] 利福平:50mg/m巧醇溶解，過濾除菌，-20°C分裝保存。
[0175] 卡那霉素 :50mg/mL，過濾除菌，-20°C分裝保存。
[0176] 氯霉素:34mg/mL，乙醇溶解，過濾除菌，-20°C分裝保存。
[0177] 慶大霉素:25mg/mL購于上海生物工程有限公司，-20°C保存。
[017引侵染液配制：10mM氯化儀、IOmM MES，抑=5.7，用時力日150測/1乙酷下香酬。
[0179] 番茄miR6027的成熟序列與番茄ATGlSa的mRNA序列有18個堿基配對（圖6A)，因此 我們推測ATGlSa可能是miR6027的祀基因。將ATGlSa中與miR6027配對的堿基連入PAC006質(zhì) 粒酶切位點處獲得質(zhì)粒PAC004，電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，獲得含有番茄miR6027祀序列的根 癌農(nóng)桿菌工程菌B，同時將ATGlSa中與miR6027配對的堿基突變（圖她)連入PAC006質(zhì)粒酶切 位點處獲得質(zhì)粒PAC005,電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，獲得含有根癌農(nóng)桿菌工程菌C，將構建 miR6027過表達的空載體PFGC1008電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，獲得含有根癌農(nóng)桿菌工程菌D。
[0180] 侵染方法如下：
[0181] (1)將含有目的基因的農(nóng)桿菌GV310U根癌農(nóng)桿菌工程菌A、B、C、和D)劃平板，36- 4化出現(xiàn)單菌落；
[0182] (2)挑取單菌落于含有5mL Y邸培養(yǎng)基的IOmL管中搖菌，在28°C條件下20化pm搖菌 24h；
[0183 ] (3)按1:100的比例將步驟(2)的工程菌A和的夜加入含有氯霉素、利福平、慶大霉素 巧中抗生素的50mL Y邸培養(yǎng)基中，工程菌B和C液加入卡那霉素、利福平、慶大霉素巧巾抗生素 的50mL Y邸培養(yǎng)基中，擴大培至OD冊日=0.8-1.0 (約12h);
[0184] (4)4°C，4000g，離屯、lOmin，棄上清；
[01化](5)預冷滅菌水20mL洗涂，4000g，4°C ,IOmin離屯、，棄上清；
[0186] (6)重復步驟(5)-次；
[0187] (7)預冷侵染液溶解沉淀至ODsoo = O. 6-0.8;
[0188] (8)室溫放置化，工程菌A:工程菌B = 50 :1、工程菌D:工程菌B = 50:1、工程菌A:工 程菌C = 50:l、工程菌D:工程菌C = 50:l分別混合侵染五至六葉時期的本氏煙；
[0189] (9)侵染后48-7化取樣檢測Ren和Luc基因的表達量。
[0190] 圖6C為侵染后72h miR6027的相對表達量，圖抓為侵染后72h Luc/Ren的相對表 達。
[0191] 結果表明，農(nóng)桿菌侵染后miR6027的表達提高了 600倍，miR6027與ATGlSa共侵染 Luc/Ren降低了52%，而miR6027與ATGlSa突變共侵染Luc/Ren沒有顯著性降低，表明 ATGlSa是miR6027的祀基因。
[0192] W上所述僅為本發(fā)明專利的具體實施案例，但本發(fā)明專利的技術特征并不局限于 此，任何相關領域的技術人員在本發(fā)明的領域內(nèi)，所作的變化或修飾皆涵蓋在本發(fā)明的專 利范圍之中。
【主權項】
1. 一種用于檢測植物microRNA靶基因的載體，其特征在于，包括原始載體和依次插入 原始載體的35S啟動子、Ren基因和LUC基因，所述Luc基因的3'端添加多克隆位點。2. 根據(jù)權利要求1所述載體，其特征在于，所述原始載體為PFGC5941載體。3. -種用于檢測植物mi croRNA祀基因的載體的構建方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 將35S啟動子連入pGreenll Luc載體得重組載體pACOOl，將Ren基因連入pFGC5941 載體中得重組載體PAC002; (2) 根據(jù)Luc序列設計特異性引物，以所述重組載體pACOOl為模板對Luc基因進行擴增， 擴增產(chǎn)物連入重組載體PAC002中即得。4. 一種檢測植物mi croRNA祀基因的方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 構建含有植物microRNA過表達載體的根癌農(nóng)桿菌工程菌A;構建待檢測基因和報告 基因的融合表達載體并轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌得根癌農(nóng)桿菌工程菌B; (2) 將所述根癌農(nóng)桿菌工程菌A和根癌農(nóng)桿菌工程菌B共侵染本氏煙，通過報告基因的 表達量判斷待檢測基因是否為所述植物microRNA的目標基因。5. 根據(jù)權利要求4所述方法，其特征在于，所述融合表達載體的構建方法如下： (1) 將35S啟動子連入pGreenll Luc載體得重組載體pACOOl，將Ren基因連入pFGC5941 載體中得重組載體PAC002; (2) 根據(jù)Luc序列設計特異性引物，以所述重組載體pACOOl為模板對Luc基因進行擴增， 擴增產(chǎn)物連入重組載體PAC002中得重組載體pAC006; (3) 將帶檢測基因連入重組載體pAC006的Luc基因的3'端多克隆位點，得重組載體重組 載體PAC004即為所述融合表達載體。6. 根據(jù)權利要求4所述方法，其特征在于，所述根癌農(nóng)桿菌工程菌A的構建方法如下： 將植物microRNA前體序列連入pFGC1008載體中，得過表達載體，將過表達載體轉(zhuǎn)入根 癌農(nóng)桿菌即得。7. 根據(jù)權利要求4所述方法，其特征在于，所述植物microRNA為miR6027。8. 根據(jù)權利要求7所述方法，其特征在于，所述待檢測基因為ATGl 8a基因。
【文檔編號】C12N15/65GK105925604SQ201610264351
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年4月22日
【發(fā)明人】周杰, 王玉, 喻景權
【申請人】浙江大學