專(zhuān)利名稱(chēng)：人β－珠蛋白基因簇的人源染色體打靶載體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因打靶載體及其應(yīng)用，特別是涉及一種人β-珠蛋白基因簇的人源染色體打靶載體及其制備方法與其在制備β-地中海貧血癥治療性藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
人類(lèi)珠蛋白基因家族分為α和β兩個(gè)基因簇。位于16號(hào)染色體近端粒區(qū)(16p13.3)的人α-珠蛋白基因簇以5′-ζ2-φζ1-φα2-φα1-α2-α1-θ1-3′的順序排列，全長(zhǎng)約40kb，其中ζ為胚胎型功能基因，α為胎兒型和成年型功能基因。位于11號(hào)染色體p15.5區(qū)的人β-珠蛋白基因簇以5′-ε-Gγ-Aγ-ψβ-δ-β-3′的順序排列，全長(zhǎng)約75kb，其中ε為胚胎型功能基因，Gγ和Aγ為胎兒型功能基因，δ與β為成年型功能基因。在發(fā)育過(guò)程的不同階段，珠蛋白基因表達(dá)產(chǎn)物可組成6種血紅蛋白四聚體，其中三種為胚胎型Hb Gower(ζ2ε2)，Hb Gower(α2ε2)和Hb Portland(ζ2γ2)；一種為胎兒型HbF(α2γ2)；一種為主要成人型HbA(α2β2)；還有一種為次要成人型HbA2(α2δ2)。
人珠蛋白基因表達(dá)具有紅系組織特異性、發(fā)育階段特異性和α-、β-兩類(lèi)珠蛋白基因的表達(dá)終產(chǎn)物始終維持平衡的特性。在發(fā)育過(guò)程的任何一個(gè)階段，如果平衡失調(diào)則導(dǎo)致地中海貧血癥(簡(jiǎn)稱(chēng)地貧)，β-鏈合成減少或完全不能合成稱(chēng)β+-或β0-地貧。β-地貧是一種常見(jiàn)的造血系統(tǒng)遺傳性疾病，已知在β-珠蛋白基因簇中有多種分子缺陷可導(dǎo)致β-地貧。
β-珠蛋白基因的正確表達(dá)依賴(lài)三種調(diào)控元件紅系特異和通用的反式因子、β-珠蛋白基因的近端順式元件(啟動(dòng)子)及β-珠蛋白基因簇的遠(yuǎn)端順式元件-基因座控制區(qū)(locus control region，LCR)序列。LCR是β-珠蛋白基因簇中維持珠蛋白基因正常表達(dá)的遠(yuǎn)端調(diào)控元件。完整LCR長(zhǎng)約20kb，由四個(gè)紅系特異、發(fā)育階段穩(wěn)定的DNaseI高敏位點(diǎn)(HS1-HS4)組成。每個(gè)HS包含一個(gè)長(zhǎng)度介于200-400bp的核心序列，是體現(xiàn)HS功能活性的關(guān)鍵部位。對(duì)單一HS的功能研究表明HS2具有典型的紅系增強(qiáng)子活性；HS3在整合狀態(tài)下表現(xiàn)出增強(qiáng)子活性，優(yōu)先促進(jìn)胎兒期功能基因的表達(dá)，具有一定的染色質(zhì)開(kāi)放活性；HS4在整合狀態(tài)下促進(jìn)成人期功能基因的表達(dá)；HS1與其它高敏位點(diǎn)共同存在時(shí)，增強(qiáng)β-珠蛋白基因表達(dá)的活性達(dá)到最大，5’HS5也是LCR的構(gòu)成部分，非紅系特異，表現(xiàn)為組成型存在。LCR的功能表現(xiàn)為激活β-珠蛋白基因簇呈現(xiàn)活性染色質(zhì)結(jié)構(gòu)；賦予珠蛋白基因在紅系細(xì)胞中特異性表達(dá)的特性；具有紅系增強(qiáng)子活性，使珠蛋白基因呈現(xiàn)高水平的表達(dá)。
β-地貧是一種常見(jiàn)的造血系統(tǒng)單基因遺傳性疾病，近幾年來(lái)對(duì)β-地貧發(fā)生的分子機(jī)制有了比較深入的了解。已知在β-珠蛋白基因簇中有多種分子缺陷可導(dǎo)致β-地貧，有的使正常的β-珠蛋白肽鏈合成完全終止(β0)，有的只是部分減少了它的合成(β+)?，F(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)有超過(guò)200種的分子損傷與β地貧有關(guān)，其中90％是點(diǎn)突變或一到幾個(gè)堿基的增加或缺失，大片段的缺失會(huì)丟失整個(gè)LCR或與β地貧相關(guān)的重要元件。大片段和相對(duì)較小片段的缺失完全抑制了基因的表達(dá)并產(chǎn)生了β0地貧的表型。基因啟動(dòng)子上的點(diǎn)突變會(huì)減少基因的轉(zhuǎn)錄，主要通過(guò)減少與正調(diào)節(jié)因子的結(jié)合或增加負(fù)調(diào)節(jié)因子的結(jié)合而造成輕度地中海貧血。目前，對(duì)β-地貧的臨床治療主要有輸血治療、脾切除及干細(xì)胞或骨髓移植，但這些傳統(tǒng)的治療方法都有一定的局限性。因此，迫切需要一種安全、有效的基因治療性藥物。
β-地貧基因治療性藥物應(yīng)滿(mǎn)足如下幾個(gè)條件(1)珠蛋白基因的高效轉(zhuǎn)移；(2)在靶細(xì)胞中的高比例的整合；(3)β-珠蛋白基因呈紅系組織特異性的高水平表達(dá)；(4)安全性。將藥物中所含的正常人β-類(lèi)珠蛋白基因?qū)牖颊逪SC中，隨HSC的自我更新、分裂和分化，導(dǎo)入的正?；蚰軌蛟隗w內(nèi)長(zhǎng)期存在，并且能夠代償缺陷基因行使正常功能，從而達(dá)到β-地貧基因治療性目的。目前，限于載體的容量，常用HS4、HS3和HS2核心序列或核心序列輔以較短片段的旁側(cè)序列的組合作為載體構(gòu)建中的調(diào)控序列(″Genetic treatment of the haemoglobinopa-thiesrecombinations and new combinations.″，Br J Haematol，98(2)247-53，1997；″Genetic treatment of severe hemoglobinopathiesthe combat against transgenevariegation and transgene silencing.″，Semin Hematol，35(2)112-25，1998)，同時(shí)根據(jù)不同β-地貧類(lèi)型選擇相應(yīng)的功能基因進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移。早期的病毒載體介導(dǎo)的珠蛋白基因轉(zhuǎn)移研究發(fā)現(xiàn)僅攜帶近端調(diào)控元件的珠蛋白基因在小鼠體內(nèi)表達(dá)水平極低，且病毒載體自身仍存在著整合位點(diǎn)隨機(jī)、基因整合不穩(wěn)定等問(wèn)題；更為重要的是，目前所有用于β-地貧基因治療性藥物只是對(duì)珠蛋白基因簇中單個(gè)功能基因及其上游的部分必要的調(diào)控元件進(jìn)行轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)移的基因表達(dá)水平低。因此尋找更安全、有效、自主調(diào)控表達(dá)和大容量的新型載體用于制備β-地貧的基因治療性藥物，是科研工作者共同關(guān)心的課題。
夏家輝院士于1981年就發(fā)現(xiàn)2個(gè)攜帶額外雙隨體小染色體(bisatelliteminichromosome，BM)而表型正常的家系，并提出利用該小染色體作為基因治療載體的設(shè)想。通過(guò)顯微切割、探針池和FISH等技術(shù)證明BM來(lái)源于D、G組染色體短臂(即核仁組織區(qū)，nucleolus organization region，NOR)。
人核糖體DNA(rDNA)位于D、G組染色體短臂次縊痕區(qū)，次縊痕參與細(xì)胞內(nèi)核仁形成。不同的細(xì)胞中，參與核仁形成的染色體數(shù)目不同，造成核仁數(shù)目和大小的差異，及胞質(zhì)中核糖體數(shù)量的不同，最終引起蛋白質(zhì)合成水平的差異。因此D、G組染色體短臂可通過(guò)控制核糖體的形成來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)蛋白的合成。另有研究表明rDNA序列可以為外源基因的表達(dá)提供合適的染色質(zhì)環(huán)境(″A Drosophila rRNA gene located ineuchromatin is active in transcription and nucleolus formation″，Genes Dev，2(12B)1745-63，1988)。1981年夏家輝院士對(duì)長(zhǎng)沙市3所醫(yī)院連續(xù)出生的新生兒染色體檢查中發(fā)現(xiàn)有一例45，X，ter rea(y；13)(q1200；p11)和兩例46，XY，t(y；15)(q1110；p12)的新生兒，經(jīng)過(guò)近20年的臨床追蹤觀察，三例染色體異常攜帶者均未發(fā)現(xiàn)任何異常體征；另外，從目前發(fā)現(xiàn)和鑒定的來(lái)自全國(guó)189個(gè)實(shí)驗(yàn)室的470位臨床細(xì)胞遺傳學(xué)工作者所申報(bào)的732種世界首報(bào)核型中，有41種涉及D、G組染色體短臂，但不論易位到此區(qū)的染色體片段來(lái)源于哪一號(hào)染色體、片段多長(zhǎng)、所含基因從1個(gè)到上千個(gè)，攜帶者本人的表型都是正常的，這些數(shù)據(jù)充分說(shuō)明NOR區(qū)不但可接受外源基因，而且能讓易位到該區(qū)的外源基因正常表達(dá)。因此，將D、G組染色體短臂作為基因治療的靶位點(diǎn)應(yīng)該是安全可行的。
夏家輝教授利用從BM上獲得的特異性片段構(gòu)建了一種人D、G組染色體靶向性人源BAC靶向載體(BACMS)，構(gòu)建方法參見(jiàn)專(zhuān)利“治療血友病B的基因藥物及其制備方法”(專(zhuān)利號(hào)01102830.0)，其物理圖譜如圖1所示，這種靶向載體的基本骨架是細(xì)菌人工染色體(bacterial artificial chromosomes，BAC)，該載體含有兩段來(lái)源于D、G組染色體的靶向序列(Targeting Leading Sequence，TGLS1&TGLS2)，同源臂之間為正篩選標(biāo)記基因Neo，并有一NheI位點(diǎn)可允許外源基因的插入，同源臂以外有一負(fù)篩選基因tk，攜帶外源基因的靶向載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，通過(guò)同源重組整合于細(xì)胞染色體，經(jīng)過(guò)G418進(jìn)行正篩選，GCV進(jìn)行負(fù)篩選，所獲得的細(xì)胞克隆即為外源基因定向整合克隆。
為了證實(shí)上述靶向載體的安全性和有效性，研究人員將人凝血因子IX(FIX)和組織纖維蛋白溶酶原激活因子(tissue plasminogen activator，TPA)基因分別克隆到此載體導(dǎo)入人纖維肉瘤細(xì)胞HT1080，PCR、FISH及染色體G顯帶技術(shù)證明FIX和TPA基因均被定點(diǎn)整合到了D、G組染色體短臂，活性檢測(cè)表明，F(xiàn)IX和TPA基因不但獲得了高效表達(dá)，而且經(jīng)過(guò)500余次傳代仍表達(dá)穩(wěn)定。它們用跨內(nèi)含子的RT-PCR檢測(cè)FIX的mRNA水平的表達(dá)，并用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbentassay，ELISA)定量，Western定性，檢測(cè)到FIX表達(dá)水平為500ug/24h.10E6細(xì)胞，而對(duì)照細(xì)胞幾乎檢測(cè)不到表達(dá)，證實(shí)了該載體的安全與有效性。除此之外，該載體還具有容量大(可達(dá)300Kb)、易于操作、穩(wěn)定性強(qiáng)和無(wú)免疫原性等優(yōu)點(diǎn)，是一種非常有潛力的可制備基因治療性藥物的載體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種人β-珠蛋白基因簇的人源染色體打靶載體。
本發(fā)明所提供的人β-珠蛋白基因簇的人源染色體打靶載體，是含有人β-珠蛋白基因簇(Beta-globin gene cluster，BGGC)的重組人源染色體靶向BAC載體，所述人β-珠蛋白基因簇的GenBank號(hào)為NG 000007，用于構(gòu)建所述含有人β-珠蛋白基因簇的重組人源染色體靶向BAC載體的出發(fā)載體為人源染色體靶向BAC載體BACMS。
所述人β-珠蛋白基因簇在人源染色體靶向BAC載體BACMS中的位置可為Neo基因上游與TGLS2之間的NheI酶切位點(diǎn)或Neo基因下游與TGLS1之間的NotI酶切位點(diǎn)。
所述人β-珠蛋白基因簇的人源染色體打靶載體為BACMS/BGGC。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種所述人β-珠蛋白基因簇的人源染色體打靶載體的構(gòu)建方法。
本發(fā)明所提供的人β-珠蛋白基因簇的人源染色體打靶載體的構(gòu)建方法，是將人β-珠蛋白基因簇插入到出發(fā)載體為人源染色體靶向BAC載體BACMS中得到的重組載體。
所述人β-珠蛋白基因簇在人源染色體靶向BAC載體BACMS中的位置可為Neo基因上游與TGLS2之間的NheI酶切位點(diǎn)或Neo基因下游與TGLS1之間的NotI酶切位點(diǎn)。
整合有本發(fā)明所述載體的細(xì)胞系和宿主菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明還提供了一種β-地中海貧血癥的基因治療性藥物。
本發(fā)明所提供的β-地中海貧血癥的基因治療性藥物，它的活性成分為上述人β-珠蛋白基因簇的人源染色體打靶載體。
本發(fā)明所提供的人β-珠蛋白基因簇的人源染色體打靶載體，是以完整的人β-珠蛋白基因簇為目的DNA，以新型人源染色體靶向載體BACMS作為基因轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建的。本發(fā)明利用BAC載體的大容量，將完整的人β-珠蛋白基因簇亞克隆至新型人源染色體靶向載體BAC中，通過(guò)TGLS的引導(dǎo)作用，可能在D、G組染色體短臂BAGE基因區(qū)或在7號(hào)染色體長(zhǎng)臂末端MLL3基因的最后一個(gè)內(nèi)含子之間發(fā)生同源重組，實(shí)現(xiàn)人β-珠蛋白基因簇的定點(diǎn)整合；利用其LCR強(qiáng)大的染色質(zhì)開(kāi)放活性，有利于為目的基因提供野生型的染色質(zhì)微環(huán)境，能夠?yàn)檫B鎖基因提供整合位點(diǎn)不依賴(lài)的，拷貝數(shù)依賴(lài)的可調(diào)控表達(dá)；且發(fā)生同源重組后，新型BAC靶向載體BACMS中的兩個(gè)TGLS及其之間的目的基因整合入人的染色體中，同源臂外的載體序列(包括BAC骨架、負(fù)篩選基因tk等DNA序列)在同源重組過(guò)程中缺失，不與染色體DNA發(fā)生重組或插入基因組DNA中，有效避免了因隨機(jī)整合或插入突變帶來(lái)的安全性問(wèn)題，同時(shí)也避免了因外源基因?qū)攵幋a的外源蛋白引起的免疫反應(yīng)。本發(fā)明可制備成藥物，對(duì)靶細(xì)胞實(shí)現(xiàn)完整的人β-珠蛋白基因簇的轉(zhuǎn)移作為基因替代治療，有利于基因治療各種β-地中海貧血癥。本發(fā)明也為研究成簇基因轉(zhuǎn)移、目的DNA定點(diǎn)整合及目的基因的可調(diào)控性表達(dá)提供了基礎(chǔ)。


圖1為人D、G組染色體靶向性人源靶向載體BACMS的物理圖譜圖2為T(mén)GLS1和TGLS2序列的染色體定位圖譜圖3為人源染色體BAC靶向載體BACMS中同源臂TGLS1和TGLS2及正、負(fù)篩選基因的結(jié)構(gòu)示意4為重組子的原位菌落斑點(diǎn)雜交檢測(cè)結(jié)果圖5為用限制性?xún)?nèi)切酶NotI對(duì)經(jīng)原位菌落斑點(diǎn)雜交試驗(yàn)檢測(cè)為陽(yáng)性的單克隆的酶切鑒定結(jié)果圖6A為分別用限制性?xún)?nèi)切酶NotI、MluI、SalI和XhoI對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行酶切的預(yù)期結(jié)果分析圖6為對(duì)用限制性?xún)?nèi)切酶NotI酶切鑒定為陽(yáng)性克隆的分別用限制性?xún)?nèi)切酶MluI、SalI和XhoI作進(jìn)一步酶切鑒定的結(jié)果圖7為重組載體中人β-珠蛋白基因簇的完整性的Southern blot鑒定結(jié)果圖8為人β-珠蛋白基因簇的人源染色體打靶載體的部分物理圖譜圖9為12株抗G418的單克隆細(xì)胞株的PCR檢測(cè)結(jié)果圖10為用Southern blot進(jìn)行β-珠蛋白基因簇的人源染色體打靶載體中β-珠蛋白基因簇的整合位點(diǎn)分析結(jié)果圖11為用HS432、HS5、3’HS1、β-珠蛋白和γA-珠蛋白為模板標(biāo)記探針對(duì)細(xì)胞克隆基因組DNA進(jìn)行Southern blot分析結(jié)果圖12為以β-珠蛋白基因簇中HS432、HS5、3’HS1、β-珠蛋白和γA-珠蛋白為橫坐標(biāo)，各雜交帶分別與單拷貝質(zhì)粒DNA中對(duì)應(yīng)的各雜交帶密度的比值為縱坐標(biāo)，對(duì)5株細(xì)胞克隆和K562細(xì)胞作柱狀13為人源染色體靶向載體BACMS/BGGC通過(guò)缺口平移法標(biāo)記DNA-FISH探針圖14為為單克隆細(xì)胞IIG2的DNA FISH分析結(jié)果圖15為單克隆細(xì)胞IIG2的G-帶-DNA FISH分析結(jié)果圖16為單克隆細(xì)胞IIG12的G-帶-DNA FISH分析結(jié)果圖17為單克隆細(xì)胞IC1的G-帶-DNA FISH分析結(jié)果圖18為經(jīng)Hemin誘導(dǎo)和未經(jīng)Hemin誘導(dǎo)的各單克隆細(xì)胞的RPA分析圖譜圖19為未經(jīng)Hemin誘導(dǎo)的K562細(xì)胞的RPA檢測(cè)結(jié)果分析柱狀20為經(jīng)Hemin誘導(dǎo)的K562細(xì)胞的RPA檢測(cè)結(jié)果分析柱狀圖具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法。
實(shí)施例1、人β-珠蛋白基因簇的人源染色體打靶載體的構(gòu)建及鑒定對(duì)人源染色體BAC靶向載體BACMS中的兩個(gè)同源臂TGLS1和TGLS2進(jìn)行同源性分析及染色體定位，染色體定位圖譜如圖2所示(圖中A表示定位于21p11，B表示定位于7q36.2)，表明它們除了與D、G組染色體短臂人黑色素瘤抗原基因(B melanomaantigen，BAGE)高度同源外，還與人7號(hào)染色體長(zhǎng)臂末端7q36.2的人髓性/淋巴性白血病3(Homo sapiens myeloid/lymphoid or mixed-lineage leukemia 3，MLL3)基因高度同源，TGLS1和TGLS2序列與MLL3基因的最后一個(gè)內(nèi)含子的同源性為97％，因此認(rèn)為利用該載體構(gòu)建新的人源染色體靶向載體可介導(dǎo)外源DNA同源重組后既能夠定點(diǎn)整合到D、G組染色體的BAGE基因區(qū)，也能夠定點(diǎn)整合到7q36.2的MLL3基因區(qū)內(nèi)。
一、人源染色體BAC靶向載體BACMS的構(gòu)建人源染色體BAC靶向載體BACMS的構(gòu)建方法參見(jiàn)專(zhuān)利“治療血友病B的基因藥物及其制備方法”(專(zhuān)利號(hào)01102830.0)進(jìn)行，即利用人BAC文庫(kù)中BAC克隆RP11-208G20獲得同源臂TGLS1和TGLS2，亞克隆到BAC載體中，并在兩個(gè)同源臂中插入正篩選基因Neo的完整表達(dá)框，在同源臂外側(cè)插入負(fù)篩選基因HSVtk的表達(dá)盒(圖3)，得到人源染色體BAC靶向載體BACMS，其物理圖譜如圖1所示。
二、人β-珠蛋白基因簇的獲得用限制性?xún)?nèi)切酶NotI酶切質(zhì)粒βD(構(gòu)建方法參見(jiàn)“BAC介導(dǎo)的含97kb人β類(lèi)珠蛋白基因簇轉(zhuǎn)基因鼠模型的建立”，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào)，25(2)117-21，2003)，對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠脈沖場(chǎng)電泳檢測(cè)，用Millipore Microcon YM-30(購(gòu)自Millipore公司)濃縮并回收長(zhǎng)度為97Kb的人β-珠蛋白基因簇DNA。
三、人β-珠蛋白基因簇的人源染色體打靶載體的構(gòu)建及其鑒定1、將步驟一構(gòu)建的人源染色體BAC靶向載體BACMS用限制性?xún)?nèi)切酶NotI酶切后，用低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠回收線(xiàn)性的載體片段，并用CIAP(TaKaRa)對(duì)回收載體片段的末端進(jìn)行去磷酸化處理。再將該載體片段與步驟二獲得的人β-珠蛋白基因簇DNA片段按3∶1的比例進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物用電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B感受態(tài)細(xì)胞(每50μL感受態(tài)細(xì)胞加入4μL連接產(chǎn)物)，將轉(zhuǎn)化后的DH10B細(xì)胞涂布于含有25μg/mL氯霉素的LB抗性平板上，37℃培養(yǎng)12-24小時(shí)。用接菌環(huán)挑取凍存的βD細(xì)菌，在含有25μg/mL氯霉素的LB抗性平板上劃線(xiàn)，獲得單個(gè)βD細(xì)菌菌落。在無(wú)菌條件下，挑取長(zhǎng)出的單菌落，將其接種到新的已分區(qū)的LB平板上，同時(shí)接種三個(gè)含有βD的菌落為陽(yáng)性對(duì)照，成不規(guī)則的三角形。以人β-珠蛋白基因簇5’HS2為探針進(jìn)行原位菌落斑點(diǎn)雜交試驗(yàn)，結(jié)果如圖4所示，圖中三角形的頂點(diǎn)A、B和C是接種βD的菌落的陽(yáng)性對(duì)照，平板上90％以上是陽(yáng)性菌落。
2、酶切鑒定從原位菌落斑點(diǎn)雜交平板上挑取12個(gè)經(jīng)原位菌落斑點(diǎn)雜交試驗(yàn)檢測(cè)為陽(yáng)性的克隆，小量提取質(zhì)粒DNA，用限制性?xún)?nèi)切酶NotI酶切進(jìn)行初步鑒定，對(duì)酶切產(chǎn)物行1％瓊脂糖凝膠脈沖場(chǎng)電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖5所示，泳道1-12表示從平板上挑取的單個(gè)菌落，泳道Bd為βD質(zhì)粒的NotI酶切圖譜，得到7kb和97kb兩條電泳帶；泳道T為BACMS質(zhì)粒用NotI酶切線(xiàn)性化后的圖譜，得到一條14kb電泳帶。待鑒定的克隆質(zhì)粒經(jīng)NotI酶切可得到14kb和97kb大小片段的為陽(yáng)性克隆，在所選的12個(gè)單克隆中，除9號(hào)和11號(hào)克隆的酶切結(jié)果不確定外，其余10個(gè)克隆均是陽(yáng)性克隆。
3、不同酶切鑒定由于目的DNA和載體都是用NotI單酶切，并通過(guò)該切點(diǎn)進(jìn)行粘性末端連接，有可能存在兩種連接方向人β-珠蛋白基因簇和載體中的Neo的轉(zhuǎn)錄方向相同或相反。為鑒定所構(gòu)建的人β-珠蛋白基因簇的人源染色體打靶載體的完整性和人β-珠蛋白基因簇DNA插入載體的方向，分別用限制性?xún)?nèi)切酶MluI、SalI和XhoI消化經(jīng)步驟2鑒定的陽(yáng)性克隆(1號(hào)、2號(hào)和3號(hào)克隆)的質(zhì)粒DNA，對(duì)酶切產(chǎn)物行1％瓊脂糖凝膠脈沖場(chǎng)電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖6所示，泳道M，X，S和N分別表示上述三個(gè)克隆的MluI、SalI、XhoI和NotI酶切產(chǎn)物，泳道Bd/N表示βD質(zhì)粒的NotI酶切產(chǎn)物，泳道T/N表示BACMS質(zhì)粒的NotI酶切產(chǎn)物。陽(yáng)性克隆的預(yù)期酶切分析結(jié)果如圖6A所示。酶切鑒定結(jié)果表明1、2號(hào)克隆的酶切結(jié)果與預(yù)期有差異，原因可能是在載體重組過(guò)程中大片段人β-珠蛋白基因簇出現(xiàn)了缺失，得到了意外的酶切結(jié)果。3號(hào)克隆的酶切結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致，表明人β-珠蛋白基因簇插入方向與Neo的轉(zhuǎn)錄方向相同，選擇3號(hào)克隆提質(zhì)粒用下述方法作進(jìn)一步鑒定。
4、Southern blot鑒定重組載體中人β-珠蛋白基因簇的完整性完整的β-珠蛋白基因簇除含有ε-、γG、γA、δ和β等功能基因外，5’末端及3’末端還含有重要順式作用元件，如5’HS432、HS5和3’HS1等，對(duì)于功能基因的時(shí)空表達(dá)調(diào)控起非常重要的作用。為確定功能基因和順式作用元件在載體構(gòu)建過(guò)程中是否有缺失，分別用HS432、HS5、3’HS1、β-珠蛋白和γA-珠蛋白基因等為模板標(biāo)記探針，對(duì)構(gòu)建的人β-珠蛋白基因簇的靶向BAC載體在經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI酶切后進(jìn)行Southern blot分析，以經(jīng)EcoRI酶切的含βD的質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照。雜交后可得到10.5kb的HS432基因、6.98kb的β-珠蛋白基因、5.5kb的γ.A-珠蛋白基因、3.3kbHS5基因和1.0kb的3’HS1基因五條特異性雜交帶，結(jié)果如圖7所示。與陽(yáng)性對(duì)照βD/EcoRI結(jié)果比較，所構(gòu)建的新靶向載體包含有人β-珠蛋白基因簇關(guān)鍵的順式作用元件、β-珠蛋白及γ-珠蛋白等功能基因。
上述對(duì)重組BAC載體不同酶切結(jié)果及Southern blot分析結(jié)果表明已獲得含有完整人β-珠蛋白基因簇、且其連接的方向與Neo的轉(zhuǎn)錄方向一致的人源染色體靶向載體，將其命名為BACMS/BGGC，其部分物理圖譜如圖8所示。
實(shí)施例2、單克隆細(xì)胞株的獲得及其基因組DNA的結(jié)構(gòu)分析一、單克隆細(xì)胞株的獲得將實(shí)施例1構(gòu)建的包含有人完整β-珠蛋白基因簇的人源染色體BAC靶向載體(BACMS/BGGC)用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞(或?qū)ACMS/BGGC用限制性?xún)?nèi)切酶SgrAI使線(xiàn)性化后電轉(zhuǎn)K562細(xì)胞)。為防止在G418(購(gòu)自Sigma公司)和GCV(購(gòu)自Sigma公司)兩種篩選藥物同時(shí)作用下，陽(yáng)性細(xì)胞克隆可能丟失的狀況，采用分步篩選的方法。首先用400μg/mL的G418篩選6周后，獲得12株抗G418的單克隆細(xì)胞，提取基因組并凍存各個(gè)細(xì)胞株；同時(shí)對(duì)12株細(xì)胞加用10μg/mL GCV進(jìn)行負(fù)篩選。結(jié)果獲得2株細(xì)胞，命名為IIG2和IIG12，能在正、負(fù)篩選壓力下穩(wěn)定培養(yǎng)和傳代，對(duì)這兩個(gè)細(xì)胞株用下述方法進(jìn)行基因組DNA的結(jié)構(gòu)分析。
二、單克隆細(xì)胞株的基因組DNA結(jié)構(gòu)分析1、PCR檢測(cè)分別以步驟一獲得的12株抗G418的單克隆細(xì)胞單克隆細(xì)胞株(包括IIG2和IIG12)和正常K562細(xì)胞的基因組DNA為模板，分別用Neo、HSVtk和BAC骨架的引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其引物序列分別為NeoP15’attcctgatcgacaagaccggc 3’和NeoP25’gagaggctattcggctatga 3’；HSV-tk的PCR引物tkP15’tcccaaggcagtctggagcat 3’和tkP25’atctgcggcacgctgttgac 3’；BACMS載體BAC骨架部分PCR引物BACP15’tgaagtggagcggaattatgt 3’和BACP25’tggtcaacgaacagatacag3’。如是陽(yáng)性結(jié)果，應(yīng)分別得到420bp、523bp和636bp大小的特異性擴(kuò)增條帶；如是靶向定點(diǎn)整合，Neo基因PCR結(jié)果陽(yáng)性，而HSVtk基因和BAC骨架PCR結(jié)果為陰性；如是隨機(jī)整合，除Neo基因PCR結(jié)果陽(yáng)性外，HSVtk基因和(或)BAC骨架PCR結(jié)果也為陽(yáng)性。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖9所示(泳道N，K，B，R分別為陰性對(duì)照，K562細(xì)胞，BACMS質(zhì)粒和BACMS/BGGC質(zhì)粒的PCR產(chǎn)物；泳道1-12分別表示所獲得的12株細(xì)胞克隆的PCR產(chǎn)物，其中，泳道8和泳道9分別表示IIG2和IIG12細(xì)胞克隆，泳道m(xù)表示DL2000 DNAMarker)，在獲得的12株細(xì)胞克隆中，IIG2和IIG12的PCR檢測(cè)結(jié)果表明Neo呈陽(yáng)性、HSVtk和BAC骨架為陰性，其余克隆除Neo呈陽(yáng)性外，HSVtk和(或)BAC骨架也出現(xiàn)了陽(yáng)性結(jié)果。通過(guò)正、負(fù)篩選后得到的2株細(xì)胞克隆IIG2和IIG12的經(jīng)PCR檢測(cè)表明是定點(diǎn)整合克隆外，對(duì)其它的細(xì)胞克隆仍需作進(jìn)一步的鑒定。
2、Southern blot分析1)整合位點(diǎn)分析由于該人源染色體靶向載體中的同源臂是來(lái)自人BAC文庫(kù)RP11-208G20(包含有人7號(hào)染色體長(zhǎng)臂末端7q36.1)，在靶向載體介導(dǎo)目的DNA進(jìn)行同源重組時(shí)，將目的DNA定點(diǎn)整合于該區(qū)域(定位在7q36.1的MLL3基因最后一內(nèi)含子)，同源臂外側(cè)是染色體本身的序列，該序列與RP11-208G20中第二個(gè)同源臂下游序列一致。選擇Neo基因中一段DNA作為雜交的探針，BglII酶切細(xì)胞克隆基因組。RP11-208G20中在第二個(gè)同源臂下游3345bp的位點(diǎn)出現(xiàn)第一個(gè)BglII酶切點(diǎn)。在該重組載體上有兩個(gè)BglII酶切位點(diǎn)即97296位點(diǎn)以及102367位點(diǎn)。97296位點(diǎn)位于Neo基因下游人β-珠蛋白基因簇5’端；102367位點(diǎn)位于tk基因的內(nèi)部。如重組載體與基因組發(fā)生包含tk的隨機(jī)整合，BglII酶切基因組后與探針雜交得到一條5071bp的雜交帶；如發(fā)生定點(diǎn)整合，載體97296 BglII酶切位點(diǎn)距第二個(gè)同源臂下游3345bp的位點(diǎn)長(zhǎng)度是7871bp，Neo基因探針雜交得到7871bp的雜交帶。
用BglII對(duì)12株單細(xì)胞克隆及正常K562細(xì)胞基因組DNA進(jìn)行酶切、電泳、轉(zhuǎn)膜和雜交，同時(shí)用BglII進(jìn)行酶切后的BACMS/BGGC質(zhì)粒作為對(duì)照，如圖10所示(泳道B為BACMS/BGGC質(zhì)粒的BglII酶切產(chǎn)物，泳道1-9為9株單克隆細(xì)胞，其中泳道2表示IC1細(xì)胞克隆，泳道4和泳道7分別表示IIG2和IIG12細(xì)胞克隆)，結(jié)果表明正常的K562細(xì)胞基因組無(wú)特異雜交帶；BglII進(jìn)行酶切后的BACMS/BGGC質(zhì)粒出現(xiàn)約5kb的雜交帶；PCR檢測(cè)證實(shí)定點(diǎn)整合的兩株細(xì)胞克隆IIG2和IIG12均有一條約8.0kb的特異雜交帶；有一株單細(xì)胞克隆IC1則出現(xiàn)兩條特異的、大小分別約是5.0kb和8.0kb雜交帶；其余9株單細(xì)胞克隆都出現(xiàn)一條約5kb大小的雜交帶。單細(xì)胞克隆IC1出現(xiàn)兩條特異性雜交帶，原因可能是在該細(xì)胞株中，靶向載體介導(dǎo)目的DNA轉(zhuǎn)移時(shí)既有定點(diǎn)的同源重組，同時(shí)又有隨機(jī)整合；或者是在分離單個(gè)細(xì)胞克隆時(shí)，得到了定點(diǎn)整合和隨機(jī)整合的混合細(xì)胞克隆。此結(jié)果尚需DNA-FISH進(jìn)一步證實(shí)。
2)轉(zhuǎn)移DNA完整性分析為確定功能基因和順式作用元件在同源重組過(guò)程中是否有缺失，分別用HS432、HS5、3’HS1、β-珠蛋白和γA-珠蛋白等為模板標(biāo)記探針，對(duì)細(xì)胞克隆基因組DNA經(jīng)EcoRI酶切后進(jìn)行Southern blot分析，結(jié)果如圖11所示(泳道1-5分別為單細(xì)胞克隆IB7、IC1、IIG2、IIG12和VIA9，泳道0.1T表示0.1拷貝的質(zhì)粒BACMS/BGGC DNA，泳道1T表示1拷貝的質(zhì)粒BACMS/BGGC DNA，泳道K表示K562細(xì)胞)，0.1拷貝酶切質(zhì)粒DNA的雜交帶不明顯，不作進(jìn)一步分析。使用圖象分析軟件UVISoft UVIBandApplication V97.04進(jìn)行圖譜分析，計(jì)算所有泳道雜交帶總密度，并與一個(gè)拷貝質(zhì)粒DNA對(duì)應(yīng)的雜交帶總密度比較得到比值，結(jié)果如表1所示表1細(xì)胞克隆的拷貝數(shù)分析結(jié)果

以β-珠蛋白基因組中HS432、HS5、3’HS1、β-珠蛋白和γA-珠蛋白為橫坐標(biāo)，各雜交帶分別與單拷貝質(zhì)粒DNA中對(duì)應(yīng)的各雜交帶密度的比值為縱坐標(biāo)，對(duì)5株細(xì)胞克隆和K562細(xì)胞作柱狀圖(如圖12所示)，結(jié)果表明無(wú)論是定點(diǎn)整合克隆或隨機(jī)整合的細(xì)胞克隆，同源重組后β-珠蛋白基因簇中HS432、HS5、3’HS1、β-珠蛋白和γA-珠蛋白等組成成分的拷貝數(shù)比K562細(xì)胞1-2倍。
3、DNA FISH分析1)將構(gòu)建的人源染色體靶向載體BACMS/BGGC通過(guò)缺口平移方法標(biāo)記探針(所用Nick標(biāo)記試劑盒購(gòu)自Sigma公司)，取1μL標(biāo)記產(chǎn)物行PAGE電泳，標(biāo)記結(jié)果如圖13所示(泳道30、90、120表示Nick酶在16℃反應(yīng)時(shí)間分別為30、90、120分鐘；泳道M表示DL2000 DNA Marker)。主帶位于300bp-500bp時(shí)，探針標(biāo)記比較理想。用反應(yīng)90分鐘的標(biāo)記探針與選用的單克隆細(xì)胞IIG2染色體進(jìn)行雜交，結(jié)果如圖14所示，在單克隆細(xì)胞IIG2染色體的分裂相中除11號(hào)染色體染色體易分析外，F(xiàn)ISH信號(hào)所在其它位置較難分析。為更好地確定靶向載體轉(zhuǎn)移目的DNA在染色體上確切的位置，改作高分辨率G-顯帶-DNA FISH技術(shù)。
2)G-帶DNA-FISH分析對(duì)經(jīng)PCR和Southern blot鑒定為定點(diǎn)整合的單克隆細(xì)胞株IIG2、IIG12及既有定點(diǎn)整合又有隨機(jī)整合的單克隆細(xì)胞株IC1和隨機(jī)整合的細(xì)胞株IB7分別按照已確定的高分辨率方法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)、收獲細(xì)胞染色體，每個(gè)細(xì)胞克隆滴片20-50張。每株細(xì)胞首先選取3-5張玻片進(jìn)行G-顯帶，觀察各個(gè)細(xì)胞克隆的高分辨率G-帶并分析。在作G-顯帶時(shí)，胰酶消化的時(shí)間必須嚴(yán)格控制，一般要求是“寧欠勿過(guò)”，即比普通的G-顯帶的胰酶消化時(shí)間稍短。每張玻片選取20-40個(gè)染色體形態(tài)較好、分散均勻的分裂相，拍照片并記錄各分裂相在顯微鏡上的坐標(biāo)，對(duì)各個(gè)染色體排對(duì)、記錄。迅速將玻片進(jìn)行脫色處理并行DNA-FISH雜交。在雜交前對(duì)染色體進(jìn)行變性時(shí)，其變性的溫度和時(shí)間需進(jìn)行優(yōu)化，變性過(guò)度，易導(dǎo)致染色體脫落或染色體出現(xiàn)“發(fā)毛”現(xiàn)象，變性不夠時(shí)，不易獲得雜交信號(hào)。一般變性溫度比常規(guī)DNA-FISH低1-2℃，變性時(shí)間比常規(guī)DNA-FISH短30秒。在熒光顯微鏡下查找G-帶時(shí)記錄的坐標(biāo)，對(duì)已記錄的分裂相與原記錄的G-帶圖譜比較，確定為G-顯帶同一分裂相后拍照片記錄熒光信號(hào)。高分辨率-G-顯帶-DNA-FISH技術(shù)在實(shí)際操作中有非常多的影響因素，任何一個(gè)環(huán)節(jié)處理不當(dāng)，在FISH雜交時(shí)均不易獲得滿(mǎn)意的結(jié)果。
對(duì)上述四株細(xì)胞進(jìn)行了250多次實(shí)驗(yàn)，每個(gè)克隆記錄分析200-300個(gè)分裂相，只獲得數(shù)個(gè)比較理想FISH結(jié)果的分裂相。圖15-17分別表示IIG2、IIG12和IC1細(xì)胞克隆染色體高分辨G-顯帶-DNA FISH。IIG2和IIG12兩個(gè)細(xì)胞克隆中，雜交信號(hào)都出現(xiàn)在11pter和7qter位置，進(jìn)一步證實(shí)了這兩株細(xì)胞克隆均是定點(diǎn)整合，與PCR及Southern blot的結(jié)果一致；而IC1細(xì)胞克隆的雜交信號(hào)卻出現(xiàn)在11pter、7qter和1qter的位置，說(shuō)明靶向載體在介導(dǎo)目的DNA轉(zhuǎn)移時(shí)，既有定點(diǎn)整合又有隨機(jī)整合。
三、人γA-珠蛋白基因表達(dá)水平分析用終濃度為50μM的Hemin(購(gòu)自Sigma公司)誘導(dǎo)三株單克隆細(xì)胞IIG2、IIG12和IC1分化，4天后，提取細(xì)胞總RNA，進(jìn)行RPA檢測(cè)，以未經(jīng)Hemin誘導(dǎo)的單克隆細(xì)胞和K562細(xì)胞為對(duì)照，結(jié)果如圖18所示，泳道K、1、2、3分別表示K562、單克隆細(xì)胞IC1、IIG2、IIG12未經(jīng)Hemin誘導(dǎo)的表達(dá)譜，泳道編號(hào)KH、1H、2H、3H表示上述4株細(xì)胞經(jīng)過(guò)Hemin誘導(dǎo)后的表達(dá)譜。其中未經(jīng)Hemin誘導(dǎo)的克隆的RPA實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖19所示(縱坐標(biāo)表示Aγ-珠蛋白基因在穩(wěn)定整合克隆中的表達(dá)量)，表明Aγ-珠蛋白基因在穩(wěn)定整合克隆中的表達(dá)量較對(duì)照細(xì)胞明顯為高，平均可達(dá)到1.27-1.64倍；對(duì)經(jīng)Hemin誘導(dǎo)的細(xì)胞克隆進(jìn)行RPA實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如圖20所示，表明3個(gè)克隆的表達(dá)量是對(duì)照的1.28-1.49倍，但Hemin對(duì)K562細(xì)胞的誘導(dǎo)作用并沒(méi)有明顯的差異。
權(quán)利要求
1.一種人β-珠蛋白基因簇的人源染色體打靶載體，是含有人β-珠蛋白基因簇的重組人源染色體靶向BAC載體，所述人β-珠蛋白基因簇的GenBank號(hào)為NG_000007，用于構(gòu)建所述含有人β-珠蛋白基因簇的重組人源染色體靶向BAC載體的出發(fā)載體為BACMS。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人β-珠蛋白基因簇的人源染色體打靶載體，其特征在于所述人β-珠蛋白基因簇在人源染色體靶向BAC載體BACMS中的位置為Neo基因上游與TGLS2之間的NheI酶切位點(diǎn)或Neo基因下游與TGLS1之間的NotI酶切位點(diǎn)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人β-珠蛋白基因簇的人源染色體打靶載體，其特征在于所述人β-珠蛋白基因簇的人源染色體打靶載體為BACMS/BGGC。
4.一種權(quán)利要求1所述的人β-珠蛋白基因簇的人源染色體打靶載體的構(gòu)建方法，是將人β-珠蛋白基因簇插入到人源染色體靶向BAC載體BACMS中得到的。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法，其特征在于所述人β-珠蛋白基因簇在人源染色體靶向BAC載體BACMS中的位置為Neo基因上游與TGLS2之間的NheI酶切位點(diǎn)或Neo基因下游與TGLS1之間的NotI酶切位點(diǎn)。
6.整合有權(quán)利要求1或2或3所述的人β-珠蛋白基因簇的人源染色體打靶載體的細(xì)胞系和宿主菌。
7.一種β-地中海貧血癥的基因治療性藥物，它的活性成分為權(quán)利要求1所述的人β-珠蛋白基因簇的人源染色體打靶載體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的基因治療性藥物，其特征在于所述人β-珠蛋白基因簇的人源染色體打靶載體為BACMS/BGGC。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種人β－珠蛋白基因簇的人源染色體打靶載體及其制備方法與應(yīng)用。其目的是涉及一種人β－珠蛋白基因簇的人源染色體打靶載體及其制備方法與其在制備β－地中海貧血癥治療性藥物中的應(yīng)用。該人β－珠蛋白基因簇的人源染色體打靶載體，是含有人β－珠蛋白基因簇(Beta－globin gene cluster，BGGC)的重組人源染色體靶向BAC載體，所述人β－珠蛋白基因簇的GenBank號(hào)為NG_000007，用于構(gòu)建所述含有人β－珠蛋白基因簇的重組人源染色體靶向BAC載體的出發(fā)載體為人源染色體靶向BAC載體BACMS。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1880458SQ200510077039
公開(kāi)日2006年12月20日 申請(qǐng)日期2005年6月15日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月15日
發(fā)明者周海勝, 趙娜, 劉德培, 夏昆, 夏家輝 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所, 夏家輝