骨硬化癥新的突變致病基因plekhm1、及其編碼蛋白和應(yīng)用
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及骨硬化癥新的突變致病基因PLEKHM1、及其編碼蛋白和應(yīng)用，本發(fā)明鑒定得到突變PLEKHM1基因，同野生型PLEKHM1序列相比，該突變序列中第11個(gè)外顯子的兩個(gè)堿基發(fā)生了缺失。該突變的PLEKHM1編碼蛋白與野生型PLEKHM1蛋白相比，自1018位氨基酸開(kāi)始發(fā)生移碼突變。本發(fā)明能夠?yàn)楣怯不Y的基因診斷提供一個(gè)新的位點(diǎn)，豐富了該病相關(guān)突變位點(diǎn)的資源庫(kù)，為之后的患者診斷提供了更多依據(jù)?？梢酝ㄟ^(guò)檢測(cè)骨硬化癥患者PLEKHM1基因序列來(lái)對(duì)其疾病進(jìn)行診斷和分型，也能夠?yàn)楫a(chǎn)婦胎兒進(jìn)行合理的產(chǎn)前診斷，達(dá)到優(yōu)生優(yōu)育篩查。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
骨硬化癥新的突變致病基因 PLEKHM1、及其編碼蛋白和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種骨硬化癥新的突變致病基因 PLEIfflMU及其編碼蛋白和應(yīng)用，屬于 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 骨硬化癥，又稱(chēng)為"石骨癥"，是一種較為罕見(jiàn)的，由于破骨細(xì)胞功能損傷導(dǎo)致骨骼 硬化、骨密度增加的全身性遺傳?。?-5)。骨硬化癥的臨床特點(diǎn)主要為具有廣泛的異質(zhì)性： 部分患者可表現(xiàn)致命性臨床特征，如貧血、全血細(xì)胞減少、脈毒血癥、繼發(fā)性肝脾腫大等;部 分患者也表現(xiàn)為無(wú)癥狀或輕微癥狀，僅僅能通過(guò)骨骼影像學(xué)檢查才能發(fā)現(xiàn)。典型骨硬化癥 的骨骼影像學(xué)顯示煩底、骨盆、椎體骨密度增加，椎體呈現(xiàn)明治"樣改變，另有可能伴有 四肢骨干號(hào)端增寬，呈現(xiàn)"立角瓶"樣改變。長(zhǎng)骨、趾骨、骨盆處可見(jiàn)"骨中骨"現(xiàn)象。骨脆性增 加，骨折風(fēng)險(xiǎn)增加 (6,7)。
[0003] 骨硬化癥傳統(tǒng)上的臨床分類(lèi)分為常染色體顯性遺傳和常染色體隱性遺傳 (7-9)。 常染色體顯性遺傳臨床表現(xiàn)略輕，僅通過(guò)骨影像學(xué)檢查能夠顯示骨密度增加。常染色體隱 性遺傳類(lèi)型較為嚴(yán)重（10)，通常在嬰幼兒時(shí)期就被發(fā)現(xiàn)，其主要原因是骨吸收障礙導(dǎo)致過(guò) 度礦化，通常伴隨有貧血、溶血W及肝脾腫大，預(yù)后較差，主要治療手段依靠骨髓移植(7)。
[0004] 近年來(lái)，針對(duì)骨硬化癥相關(guān)致病基因的研究愈發(fā)深入，對(duì)骨硬化癥的基因診斷成 為該病分類(lèi)的主要依據(jù)。目前鑒定得到的致病基因有11??5、化〔^、0511^^5。11、1'(：11?；等 等巧，11)，其中由TCIRG基因異常導(dǎo)致的骨硬化癥大概占 50%，但目前對(duì)骨硬化癥致病基因 W及突變篩查工作仍不全面，目前僅有70%的骨硬化癥病例能夠鑒定到致病基因 （12，13)。 因此，鑒定新的致病基因、位點(diǎn)是了解致病機(jī)制、提供治療方案的關(guān)鍵。
[0005] 本申請(qǐng)所設(shè)及的參考文獻(xiàn)如下，
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【發(fā)明內(nèi)容】

[0019] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明主要目的在于，通過(guò)對(duì)日前收治的一個(gè)中國(guó)骨硬化 癥患者及其家系的基因篩查和隨訪(fǎng)：1.鑒定骨硬化癥的致病基因，定位出該疾病的新型致 病位點(diǎn)W及突變情況。2.提供該致病基因及其編碼蛋白質(zhì)，包含該突變基因的表達(dá)載體、表 達(dá)宿主細(xì)胞。3.開(kāi)發(fā)針對(duì)該突變基因的骨硬化癥快速基因診斷試劑盒，包括突變基因診斷 引物、突變蛋白診斷抗體等試劑盒。4.通過(guò)對(duì)該患者的臨床隨訪(fǎng)，提供疾病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)，為進(jìn) 一步診斷該病提供有價(jià)值的數(shù)據(jù)。本發(fā)明能夠?yàn)殛U明骨硬化癥的致病機(jī)制提供理論基礎(chǔ)， 為骨硬化癥的治療提供新的藥物作用祀點(diǎn)。
[0020] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明人對(duì)日前收治的一個(gè)中國(guó)骨硬化癥患者及其家系進(jìn)行了 基因篩查和隨訪(fǎng)，鑒定得到一個(gè)新型致病位點(diǎn)，該位點(diǎn)為自發(fā)突變的化EIfflMl基因，同野生 型化EKHMl序列相比，該突變序列中第11個(gè)外顯子的兩個(gè)堿基發(fā)生了缺失（g.59527_ 59528(161〔4，(3.3051_3052〔4)。其可能導(dǎo)致?1^61(歷1基因編碼的蛋白產(chǎn)物發(fā)生移碼突變，突 變蛋白能夠?qū)е鹿怯不Y相關(guān)癥狀。根據(jù)該突變基因序列，體外完成了該突變基因人工表 達(dá)載體的構(gòu)建，得到了該突變基因的表達(dá)產(chǎn)物。發(fā)生突變的化邸歷1蛋白是上述突變序列基 因的編碼產(chǎn)物。與野生型化EKHMl蛋白相比，該突變蛋白自1018位氨基酸開(kāi)始發(fā)生移碼突 變，導(dǎo)致其編碼的氨基酸序列在1018位始與野生型化EKHMl蛋白質(zhì)氨基酸序列不同，同時(shí)終 止密碼子位置發(fā)生了改變，導(dǎo)致突變蛋白氨基酸序列延長(zhǎng)了 4個(gè)殘基。
[0021] 本發(fā)明人針對(duì)上述突變序列的突變位點(diǎn)進(jìn)行了多態(tài)性分析，在100個(gè)正常對(duì)照人 群中并未發(fā)現(xiàn)該突變，證明該突變位點(diǎn)在非骨硬化癥患者中并未存在，是可能的致病突變 位點(diǎn)。
[0022] 因此，申請(qǐng)者對(duì)該患者進(jìn)行了四年的臨床隨訪(fǎng)，該患者自診斷為骨硬化癥之日起 (2011年6月），遵醫(yī)囑服用骨化S醇（羅蓋全，0.5yg/day)，血清甲狀旁腺素 (PTH)升高癥狀 有所緩解，但是貧血W及肝脾腫大癥狀無(wú)緩解。該患者每六個(gè)月進(jìn)行血常規(guī)檢驗(yàn)，血紅蛋白 水平接近70g/L。該患者于2013年6月服用腎上腺皮質(zhì)激素 (強(qiáng)的松，30mg/day)，但是貧血癥 狀仍無(wú)好轉(zhuǎn)。至2015年9月，患者肝功W及血清PTH水平穩(wěn)定，從事輕勞動(dòng)量工作，并無(wú)骨折 發(fā)生。通過(guò)對(duì)該患者的臨床隨訪(fǎng)，能夠?qū)υ擃?lèi)型骨硬化癥提供疾病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)，為進(jìn)一步診斷 該病提供有價(jià)值的數(shù)據(jù)。
[0023] 進(jìn)一步針對(duì)鑒定得到的化邸麗1該突變位點(diǎn)，設(shè)計(jì)提供了一種用于該骨硬化癥致 病位點(diǎn)的快速基因診斷試劑盒，所述試劑盒包含能夠特異性擴(kuò)增化EK歷1基因目的區(qū)段的 引物，W及能夠特異性檢測(cè)所述化EK歷1突變蛋白的抗體。所述引物其能夠擴(kuò)增化EIfflMl基 因 427bp長(zhǎng)度的片段(g.59229_59655)，該片段包含了所述PLEIfflMl突變基因的突變位點(diǎn)。所 述抗體與所述PLEKHM1突變蛋白能夠特異性結(jié)合，且不與野生型PLEKHM1基因編碼的蛋白質(zhì) 務(wù)主厶 臺(tái)口口 O
[0024] 因此，本發(fā)明
[0025] 一方面，提供了骨硬化癥新的突變致病基因化邸歷1，序列如SEQ ID NO. 1所示，該 突變的PLEIfflMl基因與野生型PLEIfflMU序列如SEQ ID NO.2所示）相比，其第11個(gè)外顯子的 兩個(gè)堿基CA發(fā)生了缺失。本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)該突變能夠?qū)е鹿怯不Y相關(guān)癥狀。
[00%]另一方面，提供該突變致病基因 PLEIfflMl所編碼的蛋白質(zhì)，序列如SEQ ID NO. 3所 示，該蛋白質(zhì)與野生型化邸歷1的蛋白質(zhì)序列（序列如SEQ ID NO.4)相比，自突變位點(diǎn)起之 后的氨基酸序列發(fā)生了移碼突變:即。該突變蛋白自1018位氨基酸開(kāi)始發(fā)生移碼突變，導(dǎo)致 其編碼的氨基酸序列在1018位始與野生型化邸HMl蛋白質(zhì)氨基酸序列不同，同時(shí)終止密碼 子位置發(fā)生了改變，導(dǎo)致突變蛋白氨基酸序列延長(zhǎng)了 4個(gè)殘基。
[0027] 再一方面，提供含有所述突變致病基因 PLKfflMl的載體。所述載體的表達(dá)產(chǎn)物是所 述的突變基因 PLEKHM1編碼的蛋白。
[0028] 另一方面，提供所述突變基因 PLHOMl在作為治療骨硬化癥的藥物祀點(diǎn)的應(yīng)用。
[0029] 再一方面，提供所述突變的基因化EKHMl在作為骨硬化癥的分子診斷W及產(chǎn)前診 斷中的應(yīng)用，即作為骨硬化癥診斷試劑盒中的應(yīng)用。
[0030] 再一方面，提供了一種用于診斷骨硬化癥的診斷試劑盒，所述試劑盒包括能特異 性的擴(kuò)增所述基因 PLEKHM1的引物，所述引物序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。所述 引物能夠擴(kuò)增化EIfflMl基因 427bp長(zhǎng)度的片段，該片段包含了所述化EIfflMl突變基因的突變 位點(diǎn)。
[0031] 再一方面，提供一種抗體，所述抗體與突變基因化邸麗1所編碼的蛋白質(zhì)（SEQ ID NO.3)特異結(jié)合，且不作用于野生型PLEIfflMl編碼的蛋白質(zhì)(序列如SEQ ID NO.4)。
[0032] 再一方面，提供了一種用于診斷骨硬化癥的診斷試劑盒，所述試劑盒包括上述能 夠特異性檢測(cè)PLEKHM1突變蛋白的抗體。
[0033] 目前，對(duì)骨硬化癥患者的基因診斷尚未全面開(kāi)展，原因之一是僅有70%的骨硬化 癥病例能夠鑒定到致病基因。也未見(jiàn)骨硬化癥相關(guān)基因診斷試劑盒的開(kāi)發(fā)，對(duì)骨硬化癥致 病基因 W及突變篩查工作仍不全面，因此，鑒定新的致病基因、位點(diǎn)是了解致病機(jī)制、提供 治療方案的關(guān)鍵。
[0034] 本發(fā)明通過(guò)對(duì)日前收治的一名骨硬化癥患者W及其家系進(jìn)行了基因篩查，首次發(fā) 現(xiàn)了一個(gè)骨硬化癥致病基因的新突變位點(diǎn)，并針對(duì)此位點(diǎn)研究開(kāi)發(fā)骨硬化癥快速基因診斷 試劑盒。
[0035] 本發(fā)明具有如下有益效果：
[0036] (1)能夠?yàn)楣怯不Y的基因診斷提供一個(gè)新的位點(diǎn)，豐富了該病相關(guān)突變位點(diǎn)的 資源庫(kù)，為之后的患者診斷提供了更多依據(jù)?？蒞通過(guò)檢測(cè)骨硬化癥患者PLEIfflMl基因序列 來(lái)對(duì)其疾病進(jìn)行診斷和分型，也能夠?yàn)楫a(chǎn)婦胎兒進(jìn)行合理的產(chǎn)前診斷，達(dá)到優(yōu)生優(yōu)育篩查。
[0037] (2)通過(guò)對(duì)本發(fā)明上述的骨硬化癥突變蛋白的獲得W及體內(nèi)體外研究，能夠較為 深入的掲示骨硬化癥發(fā)病的分子機(jī)制，可W為骨硬化癥致病機(jī)制研究提供更好的研究對(duì) 象、思路和理論基礎(chǔ)。
[0038] (3)通過(guò)對(duì)該患者進(jìn)行的多年臨床隨訪(fǎng)，能夠獲得本發(fā)明所述突變導(dǎo)致的骨硬化 癥發(fā)生發(fā)展、疾病危險(xiǎn)性W及預(yù)后的相關(guān)數(shù)據(jù)，為治療骨硬化癥提供新的通路。
[0039] (4)本發(fā)明可W為治療骨硬化癥提供一個(gè)新的可能的藥物祀點(diǎn)。
[0040] (5)基于本發(fā)明突變位點(diǎn)研究開(kāi)發(fā)的試劑盒能夠快速、有效的為骨硬化癥患者提 供分子診斷依據(jù)，并且可W考慮推廣至其他已知或未知的骨硬化癥致病位點(diǎn)。
【附圖說(shuō)明】
[0041] 圖1為本發(fā)明鑒定的骨硬化癥患者家系圖。其中正方形表示男性，圓圈表示女性， 實(shí)屯、為患病個(gè)體，空屯、為正常個(gè)體。
[0042] 圖2為本發(fā)明鑒定的骨硬化癥患者的骨骼影像圖。（A)煩骨X射線(xiàn)照片顯示煩底骨 硬化癥狀；（B-E)腰椎X射線(xiàn)顯示骨骼的硬化病理形態(tài)；（F)腿骨X射線(xiàn)照片顯示包括股骨、腔 骨在內(nèi)的長(zhǎng)骨展現(xiàn)出廣泛的骨密度增加癥狀。
[0043] 圖3為本發(fā)明鑒定的骨硬化癥患者椎體骨活檢病理涂片免疫染色圖。(A)骨髓腔內(nèi) 出現(xiàn)未吸收的巧化軟骨，骨小梁明顯增粗，骨髓腔變窄，造血組織不明顯。（B)軟骨組織可見(jiàn) 巧鹽沉積W及少量破骨細(xì)胞。（C)骨髓腔嚴(yán)重狹窄，部分閉塞，造血組織明顯減少，僅見(jiàn)少量 造血細(xì)胞。（D)造血組織僅見(jiàn)少量骨髓細(xì)胞W及造血細(xì)胞。
[0044] 圖4為本發(fā)明鑒定的骨硬化癥患者W及其直系親屬化邸HMl測(cè)序峰圖。上部分是 PLKfflMl蛋白結(jié)構(gòu)域示意圖W及化邸歷1外顯子結(jié)構(gòu)示意圖；下部分是本發(fā)明鑒定的骨硬化 癥患者W及其直系親屬PLEIfflMl測(cè)序峰圖。黑色箭頭表示發(fā)生突變的位點(diǎn)。
[0045] 圖5為本發(fā)明構(gòu)建突變型化邸歷1蛋白表達(dá)載體(FLAG-PLEIfflMl-MU)，所用載體質(zhì) 粒骨架化AG-HA-PCDNA3.1圖。
[0046] 圖6為本發(fā)明所構(gòu)建突變型化邸麗1蛋白表達(dá)載體(FLAG-化EIfflMl-MU)鑒定結(jié)果 圖。從左到右是:空載質(zhì)粒、插入質(zhì)粒、突變質(zhì)粒、marker、雙酶切(空載質(zhì)粒、插入質(zhì)粒、突變 質(zhì)粒）、hind3單酶切(空載質(zhì)粒、插入質(zhì)粒、突變質(zhì)粒）、kpnl單酶切(空載質(zhì)粒、插入質(zhì)粒、突 變質(zhì)粒）：5.4化，插入片段317化b。
[0047] 圖7為野生型及突變型PLEK麗1蛋白的巧光檢測(cè)結(jié)果。
[004引圖8為野生型及突變型PLEK麗1蛋白免疫共沉淀檢測(cè)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0049] 下面結(jié)合具體試驗(yàn)方法和附圖對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案及其所產(chǎn)生的技術(shù)效果進(jìn)行 進(jìn)一步的闡述，下述說(shuō)明僅是為了解釋本發(fā)明，但不W任何方式對(duì)本發(fā)明加 W限制，基于本 發(fā)明教導(dǎo)所作的任何變換或替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0050] 本發(fā)明中所使用的方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為本領(lǐng)域常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用 的試驗(yàn)材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0051] 本發(fā)明首先針對(duì)收治的骨硬化癥患者進(jìn)行了大量相關(guān)致病基因的測(cè)序篩查，第1 步.得到一個(gè)致病基因 PLEKHM1的新型突變位點(diǎn)。針對(duì)該突變位點(diǎn)，
【申請(qǐng)人】開(kāi)展了 W下工作： 2.體外構(gòu)建了PLEKHM1基因 W及上述突變基因的表達(dá)載體。3.建立了上述表達(dá)載體的體外 表達(dá)系統(tǒng)，獲得了PLEKHM1基因表達(dá)產(chǎn)物蛋白W及突變體蛋白。4.設(shè)計(jì)并合成了能夠擴(kuò)增包 含該位點(diǎn)在內(nèi)的427bp核巧酸序列的引物，產(chǎn)物可用于后期測(cè)序鑒定突變情況。引物序列如 SEQ ID NO.5、6所示。5.設(shè)計(jì)了針對(duì)突變蛋白特異性氨基酸序列的單克隆抗體，能夠特異性 的結(jié)合PLEKHM1該位點(diǎn)突變的蛋白，同時(shí)不與野生型PLEKHM1相結(jié)合。
[0052] 實(shí)施例1突變基因 PLEK麗1的獲得與鑒定
[0化3] 1.樣本采集
[0054]本發(fā)明人首先對(duì)收治的骨硬化癥患者進(jìn)行問(wèn)診，普通實(shí)驗(yàn)室檢查W及骨骼影像學(xué) 檢查，發(fā)現(xiàn)患者具有易骨折、牙齒脫落、貧血、肝脾腫大等癥狀，骨骼X射線(xiàn)照片顯示煩骨、椎 骨、長(zhǎng)骨等有廣泛性的骨密度增加，椎體骨活檢病理涂片顯示骨髓腔狹窄，造血組織減少， 總體符合骨硬化癥病理特征(見(jiàn)附圖1，2，3)。
[005引 2. DNA提取
[0056] 收集先證者及其家系成員的外周血，采用試劑盒（TIANGEN BIOTECH,Beijing, 化ina，DP304-03)從外周血中提取全基因組DNA，紫外分光光度計(jì)法測(cè)定DNA濃度，將DNA濃 度調(diào)整至SOngAil，-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0057] 3.PCR
[0化引 引物設(shè)計(jì)：PLEKHM1 基因序列來(lái)自于Gene ID:9842，NCBI ReferenceSequence:NC_ 000017.10，mRNA:NM_014798.2,共設(shè)計(jì)了 12對(duì)引物用于擴(kuò)增PLEIfflMl的12個(gè)外顯子及其側(cè) 翼的內(nèi)含子序列。本研究所用引物全部由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物均溶 解稀釋為1OUM的工作液，-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0059] 引物序列如下表所示：
[0060]

[0061 ] PCR所用DNA聚合酶為高保真PrimeSTAR Max Premix(Code No. =R(MSAJakara), 在25ul的PCR反應(yīng)體系中分別加入2.0ul dNTP，2.5ul IOXPCR緩沖液，0.1加 I Taq酶，2ul 基因組DNA和各0.加 1 IOum的上下游引物，17.35U1 d地2〇dPCR反應(yīng)條件為:梯度PCR儀上94 °C預(yù)變性3min;隨后94°C變性30s，退火30s(退火溫度見(jiàn)上表），72°C延伸30s，共40個(gè)循環(huán)； 最后72 °C延伸IOmin。
[006。 4.測(cè)序
[0063] 采用郵堿性憐酸酶和外切酶I純化PCR產(chǎn)物，純化的產(chǎn)物經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳定量 后，應(yīng)用ABI Prism TM3730自動(dòng)DNA分析儀（美國(guó)Applied Biosystems)進(jìn)行單向或雙向測(cè) 序。采用Autoassembler 2.0軟件（美國(guó)化rkin Elmer)將測(cè)序結(jié)果與正常野生型化EKHMl基 因組序列進(jìn)行對(duì)比分析。為保證測(cè)序結(jié)果的可靠性和可重復(fù)性，所有與正?；蛐蛄胁煌?的位點(diǎn)均進(jìn)行正反雙向測(cè)序。
[0064] 5.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0065] 通過(guò)基因測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的突變位點(diǎn)，該位點(diǎn)位于第11外顯子，為缺失框移突 變g.59527_59528delCA，c.3051_3052CA(如圖4黑色箭頭所示）。擴(kuò)增該11號(hào)外顯子引物F: 5 '-TTGGGAGGAGACGGGAGCAG-3 '；R:5 '-GATGGGCATCAGGCGAAA-3 '。
[0066] 實(shí)施例2表達(dá)載體的構(gòu)建
[0067] 野生型化EKHMl蛋白表達(dá)載體（化AG-化EKHM1-WT)由日本Osaka加iversity的 Tamotsu Yoshimori教授提供，本發(fā)明人應(yīng)用重疊延伸PCR法構(gòu)建了突變型化邸麗1蛋白表 達(dá)載體(FLAG-PLEIfflMl-MU)，所用載體質(zhì)粒骨架為化AG-HA-PCDNA3.1，詳細(xì)信息如圖5所示。 首先WFLAG-PLEIfflMl-WT質(zhì)粒為模板，應(yīng)用重疊延伸PCR技術(shù)擴(kuò)增PLEKHM1全長(zhǎng)序列，并將突 變引入目的片段，然后將帶有突變的目的片段與載體結(jié)合、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞，應(yīng)用 大腸桿菌D冊(cè)a進(jìn)行篩選和培養(yǎng)、從菌群中獲取目的基因。為本領(lǐng)域常用技術(shù)。
[0068] 經(jīng)過(guò)鑒定，本發(fā)明所構(gòu)建突變型化邸歷1蛋白表達(dá)載體(化AG-PLEIfflMl-MU)是成功 的，鑒定結(jié)果如圖6所示。所用載體質(zhì)粒的長(zhǎng)度為5.4kb，插入片段長(zhǎng)度為3171b。構(gòu)建時(shí)首先 應(yīng)用限制性?xún)?nèi)切酶化indm和KpnI)酶切載體質(zhì)粒，然后將帶有上述酶切位點(diǎn)的目的片段與 載體進(jìn)行連接。因此，用化nd虹和KpnI進(jìn)行雙酶切時(shí)，可得到5.4kb與3.化b大小的片段(見(jiàn) 第6-7泳道），而分別用化nd虹或者KpnI進(jìn)行單酶切時(shí)，可W得到8.化b大小的片段(見(jiàn)第9- 10與12-13泳道）。
[0069] 實(shí)施例3突變蛋白表達(dá)及功能的鑒定
[0070] PLEIfflMl蛋白可W與Rab7蛋白結(jié)合，將野生型及突變型蛋白通過(guò)皿K293細(xì)胞進(jìn)行 表達(dá)，然后應(yīng)用免疫巧光檢測(cè)相關(guān)蛋白，結(jié)果圖7所示。綠色所示為Rab7蛋白，紅色為 PLEKHM1蛋白，當(dāng)二者融合后顯示為黃色。左側(cè)為野生型化EKHMl蛋白，右側(cè)為突變型 PLEIfflMl蛋白。通過(guò)對(duì)比可W發(fā)現(xiàn)，突變后化EKHMl蛋白的表達(dá)減少，且與Rab7蛋白的結(jié)合減 少。
[0071] 應(yīng)用免疫共沉淀技術(shù)檢測(cè)野生型及突變型化邸麗I蛋白與Rab7蛋白的結(jié)合情況， 如圖8所示。將Rab7蛋白與野生型或者突變型化邸歷1蛋白分別轉(zhuǎn)染肥K293細(xì)胞，24小時(shí)后 裂解細(xì)胞，首先用FLAG的特異性抗體進(jìn)行免疫沉淀，然后分別用所示特異性抗體進(jìn)行免疫 印跡。結(jié)果顯示突變型PLHfflMl蛋白與Rab7蛋白的結(jié)合量較野生型明顯減少。
[0072] 實(shí)施例4 一種用于診斷骨硬化癥的診斷試劑盒
[007引所述試劑盒包括能特異性的擴(kuò)增基因化EKHM1的引物，引物序列F : 5 ' -TT GGGAGGAGACGGGAGCAG-3'（沈Q ID N0.5);R:5'-GATGGGCATCAGGCGAAA-3'（S EQ ID N0.6)。 [0074] 25ul反應(yīng)體系：
[007引 2.0ul dNTP
[0076] 2.5ul 10 X PCR 緩沖液
[0077] 0.1 加1 Taq酶(DM聚合酶為高保真PrimeSTAR Max Premix)
[0078] 2ul 基因組 DNA
[0079] 0.5ul IOum的上游引物
[0080] 0.5ul IOum的下游引物
[0081 ] 17.3加1(1地2〇。
[0082] PCR反應(yīng)條件為:梯度PCR儀上94°C預(yù)變性3min;隨后94°C變性30s，55°C退火30s， 72°C延伸30s，共40個(gè)循環(huán);最后72°C延伸lOmin。
[0083] 實(shí)施例5-種用于診斷骨硬化癥的診斷試劑盒
[0084] 制備能夠特異性結(jié)合PLEIfflMl突變體蛋白的單克隆抗體，采用現(xiàn)有技術(shù)，流程簡(jiǎn)述 如下：（1)抗原制備：目的基因片段克隆;表達(dá)載體構(gòu)建;蛋白質(zhì)表達(dá)純化；（2)免疫及化ISA 檢測(cè):抗原免疫4只BALB/C雌性小鼠；陽(yáng)性血清化ISA檢測(cè)，效價(jià)>10000; (3)融合及細(xì)胞株篩 選:取效價(jià)最高的小鼠做融合實(shí)驗(yàn);從500個(gè)單克隆細(xì)胞株中篩選陽(yáng)性克?。唬?)抗體純化： Protein A/G親和純化。
[0085] 制備包含上述抗體的試劑盒，用于檢測(cè)鑒定野生型及突變型PLHOMl蛋白。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 骨硬化癥新的突變致病基因 PLEKHM1，其特征是，序列如SEQ ID NO. 1所示。2. 權(quán)利要求1所述突變基因 PLEKHM1編碼的蛋白質(zhì)，其特征是，序列如SEQ ID NO.3所 不。3. -種載體，其特征是，含有權(quán)利要求要求1所述突變致病基因 PLEKHM1。4. 一種用于診斷骨硬化癥的診斷試劑盒，其特征是，所述試劑盒包括能特異性的擴(kuò)增 權(quán)利要求1所述基因 PLEKHM1的引物，所述引物序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。5. -種抗體，其特征是，所述抗體與權(quán)利要求2所述突變基因 PLEKHM1所編碼的蛋白質(zhì) 特異結(jié)合，且不作用于野生型PLEKHM1編碼的蛋白質(zhì)。6. -種用于診斷骨硬化癥的診斷試劑盒，其特征是，所述試劑盒包括權(quán)利要求5所述抗 體。
【文檔編號(hào)】C12N15/12GK105925584SQ201610463212
【公開(kāi)日】2016年9月7日
【申請(qǐng)日】2016年6月23日
【發(fā)明人】徐潮, 薄濤, 閆芳, 趙家軍
【申請(qǐng)人】山東省立醫(yī)院