干擾羊駝黑色素細胞CDK5基因表達的siRNA及其表達質(zhì)粒和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種干擾羊駝黑色素細胞CDK5基因表達的siRNA，具有Seq ID No.1和Seq ID No.2所示的正義鏈和反義鏈序列，以及構(gòu)建了干擾羊駝黑色素細胞CDK5基因表達的pENTR/U6 shRNA表達質(zhì)粒。本發(fā)明所述pENTR/U6 shRNA表達質(zhì)粒在黑色素細胞系中的生物性效應(yīng)體現(xiàn)為對羊駝黑色素細胞系TYR和MC1R的調(diào)節(jié)作用，以及對小鼠毛色表型變化的影響。
【專利說明】
干擾羊駝黑色素細胞CDK5基因表達的s i RNA及其表達質(zhì)粒和 應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種干擾羊駝黑色素細胞⑶K5基因表達的 siRNA片段及其shRNA表達質(zhì)粒。
【背景技術(shù)】
[0002] 細胞周期素依賴蛋白激酶5(Cyclin_dependent Kinase 5，CDK5)屬于細胞周期素 (cyclin)依賴性蛋白激酶(CDK)家族成員，CDK5最早利用生物化學方法從牛腦組織中分離 出來，于1992年被發(fā)現(xiàn)。CDK5是由脯氨酸引導(dǎo)的絲氨酸/蘇氨酸激酶，對真核細胞的細胞分 裂周期起磷酸化/脫磷酸化的調(diào)控作用。
[0003] 研究表明，CDK5主要在神經(jīng)元表達，與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和神經(jīng)元的正常功能密切相 關(guān)。近來發(fā)現(xiàn)CDK5在非神經(jīng)元的組織或細胞中表達，如在鼠晶狀體和兔角膜的上皮細胞中 可調(diào)節(jié)細胞與基質(zhì)及細胞間的粘附和迀移。Lee等人發(fā)現(xiàn)，CDK5在鼠的卵巢中表達，可能對 卵巢內(nèi)某些細胞的分化和凋亡起作用。
[0004] CDK5是一個新發(fā)現(xiàn)的能使體內(nèi)外的酪氨酸羥化酶(TH)發(fā)生磷酸化的激酶，TH被 CDK5磷酸化后的蛋白水平和活性均增加。TH是酪氨酸酶(TYR)的活性酶之一，TH在許多位點 被不同的激酶磷酸化后，不同程度地影響著TH酶的活性。TYR是在黑色素合成起始過程中一 種關(guān)鍵的起催化作用的限速酶，至少具有酪氨酸羥化酶(TH)和多巴氧化酶2種活性。TYR催 化酪氨酸產(chǎn)生真黑素和褐黑素，而真黑素和褐黑素的量決定著哺乳動物的毛色。專利申請 201110162723.8發(fā)現(xiàn)，CDK5通過調(diào)控TYR基因的表達而參與調(diào)控羊駝毛色的形成。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)中還沒有最適宜的干擾羊駝黑色素細胞⑶K5 基因表達的s iRNA的問題，提供一種干擾羊駝黑色素細胞CDK5基因表達的s iRNA。
[0006] 本發(fā)明提供的干擾羊駝黑色素細胞⑶K5基因表達的siRNA包括正義鏈和反義鏈， 分別具有Seq ID No. 1和Seq ID No.2所示的序列： 正義鏈:5 ' 一GCGACAAGAAGCUGACUUU-3 ' 反義鏈:5 ' 一AAAGUCAGCUUCUUGUCGC-3 '。
[0007] 本發(fā)明同時還提供了包含上述Seq ID No. 1和Seq ID No.2所示siRNA的shRNA，以 及編碼有所述shRNA的DNA。
[0008] 所述shRNA具有Seq ID No. 3和Seq ID No.4所示的正義鏈和反義鏈序列： Seq ID No·3:5，一CACCGCGACAAGAAGCUGACUUUCGAAAAAGUCAGCUUCUUGUCGC-3， Seq ID No·4:5，-AAAAGCGACAAGAAGCUGACUUUUUCGAAA⑶CAGCUUCU腳CGC-3，。
[0009] 所述DNA具有Seq ID No. 5和Seq ID No.6所示的正義鏈和反義鏈序列： Seq ID No.5:5 ' 一CACCGCGACAAGAAGCTGACTTTCGAAAAAGTCAGCTTCTTGTCGC-3 ' Seq ID No.6:5 ' 一AAAAGCGACAAGAAGCTGACTTTTTCGAAAGTCAGCTTCTTGTCGC-3 ' 〇
[0010] 進而，本發(fā)明構(gòu)建了 一種可使上述shRNA在黑色素細胞系中轉(zhuǎn)染的干擾羊駝黑色 素細胞CDK5基因表達的pENTR/U6 shRNA表達質(zhì)粒。
[0011] 本發(fā)明還提供了干擾羊駝黑色素細胞⑶K5基因表達的PENTR/U6 ShRNA表達質(zhì)粒 在黑色素細胞系中的生物性效應(yīng)，所述生物性效應(yīng)體現(xiàn)為對羊駝黑色素細胞系TYR和MClR 的調(diào)節(jié)作用，以及對小鼠毛色表型變化的影響。
[0012] 本發(fā)明根據(jù)所獲得的羊駝皮膚⑶K5基因，構(gòu)建成PENTR/U6 ShRNA表達質(zhì)粒，將該 表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到羊駝黑色素細胞系后，調(diào)控羊駝毛色的重要關(guān)鍵基因的表達量發(fā)生了明顯 變化。同時將該表達質(zhì)粒注射到小鼠受精卵雄原核，進行胚胎移植獲得了轉(zhuǎn)基因小鼠，在第 一代轉(zhuǎn)基因小鼠皮膚中檢測到CDK5基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達量下降。以上說明所構(gòu)建的 PENTR/U6 shRNA表達質(zhì)粒對⑶K5起到了抑制作用，而且該表達質(zhì)粒可成為通過轉(zhuǎn)基因技術(shù) 改變羊駝毛色的基因資源。
【附圖說明】
[0013] 圖1為siRNA 531、siRNA 171、siRNA 215在黑色素細胞中的干擾效果。
[0014] 圖2為pENTR/U6 shRNA表達質(zhì)粒對羊駝黑色素細胞系中CDK5的表達量。
[0015] 圖3為pENTR/U6 shRNA表達質(zhì)粒對羊駝黑色素細胞系中CDK5表達的影響。
[0016] 圖4為pENTR/U6 shRNA表達質(zhì)粒對羊駝黑色素細胞系中TYR的表達量。
[0017] 圖5為PENTR/U6 ShRNA表達質(zhì)粒對羊駝黑色素細胞系中TYR表達的影響。
[0018] 圖6為PENTR/U6 ShRNA表達質(zhì)粒對羊駝黑色素細胞系中MClR的表達量。
[0019] 圖7為pENTR/U6 shRNA表達質(zhì)粒對羊駝黑色素細胞系中MClR表達的影響。
[0020] 圖8為PENTR/U6 ShRNA表達質(zhì)粒對轉(zhuǎn)基因小鼠皮膚黑色素細胞中黑色素顆粒產(chǎn)生 的影響。
[0021] 圖9為PENTR/U6 ShRNA表達質(zhì)粒在轉(zhuǎn)基因小鼠皮膚中的表達。
[0022] 圖10為CDK5在轉(zhuǎn)基因小鼠皮膚中的表達量。
[0023]圖11為轉(zhuǎn)基因小鼠毛色的變化。
【具體實施方式】
[0024]以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明。
[0025] 實施例1。
[0026] 設(shè)計干擾羊駝⑶K5基因表達的siRNA人工合成序列，以細胞轉(zhuǎn)染法篩選⑶K5的 SiRNA0
[0027] 根據(jù)從羊駝皮膚中擴增到得的CDK5全長序列(HM623674)，參照siRNA設(shè)計原則，設(shè) 計并篩選出以下表1所示的3個siRNA雙鏈人工合成序列。 翁i雜纖::_S慕戀纖論A:綱
[0028]用六孔組織培養(yǎng)板，每孔接種2X IO5黑色素細胞，2ml無抗生素含胎牛血清正常培 養(yǎng)，在二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)18-24小時，至細胞貼壁達60-80%。配置如下液體:溶液A:每次轉(zhuǎn) 染將2-8μ I siRNA雙鏈用100μI siRNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基sc-36868稀釋;溶液B:每次轉(zhuǎn)染將2-8μ 1 siRNA轉(zhuǎn)染試劑sc-29528用100μΙ siRNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基sc-36868稀釋。
[0029]用加樣器將s iRNA雙鏈(溶液A)直接加入稀釋后的轉(zhuǎn)染試劑(溶液B)中，輕輕混勻 并在室溫下孵育15-45分鐘。用2ml siRNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基sc-36868漂洗細胞一次，吸去培養(yǎng)基 并迅速在siRNA轉(zhuǎn)染試劑混合液(溶液A+溶液B)中加入0.8ml siRNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，小心混勻 并覆蓋在漂洗過的細胞上。將細胞放入37 °C二氧化碳培養(yǎng)箱孵育5-7小時。不移去原來的轉(zhuǎn) 染混合液，加入1ml含有2倍正常血清的培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育18-24小時。棄去原培養(yǎng)基，用1倍 正常生長培養(yǎng)基替換并繼續(xù)培養(yǎng)24-72小時后，對細胞進行測定。
[0030] 篩選結(jié)果如圖1所示。圖中，A為FAM檢測轉(zhuǎn)染效率，B、C、D、E分別為⑶K5在對照組 (NC)、siRNA531、siRNA171 和siRNA215組中的表達(n = 3)。
[0031] 可以看出，在黑色素細胞中轉(zhuǎn)染siRNA215后，⑶K5蛋白的表達量明顯下降，說明 s iRNA215對CDK5的表達起到了抑制作用，因此s iRNA215是CDK5較理想的s iRNA 〇
[0032] 篩選出的干擾羊駝黑色素細胞⑶K5基因表達的siRNA序列如Seq ID No. GPSeq ID No.2所示： Seq ID No.l:5'一GCGACAAGAAGCUGACUUU-3' Seq ID No·2:5 ' 一AAAGUCAGCUUCUUGUCGC-3 '。
[0033] 實施例2。
[0034] 根據(jù)實施例1篩選到的CDK5 siRNA序列，設(shè)計具有Seq ID No. 3和Seq ID No. 4所 示正義鏈和反義鏈序列的shRNA，所述shRNA以Seq ID No. 1和Seq ID No.2序列作為shRNA 的莖結(jié)構(gòu)，二者之間分別以CGAA和UUCG作發(fā)夾結(jié)構(gòu)，由此構(gòu)成shRNA結(jié)構(gòu)： 正義鏈:5，一CACCGCGACAAGAAGCUGACUUUCGAAAAAGUCAGCUUCUUGUCGC-3 ' 反義鏈:5，-AAAAGCGACAAGAAGCUGACUUUUUCGAAAGUCAGCUUCUUGUCGC-3 '。
[0035] 根據(jù)上述shRNA序列，合成1對shRNA寡聚單鏈DNA，并附陰性對照序列，具體序列見 表2。 戰(zhàn)鐵歿A:霧羅擧寒1>淡%序到
[0036] 雙鏈DNA的退火:將1對合成好的寡聚單鏈DNA用ddH2〇溶解成100μΜ，互補單鏈各取 5μ 1，兩兩混合，按表3給出的體系進行退火:在95 °C加熱5分鐘，放置室溫自然冷卻20分鐘形 成雙鏈DNA。
[0037]合成的雙鏈DNA與載體進行連接、轉(zhuǎn)化和克隆：使用載體構(gòu)建試劑盒BLOCK-iT U6 RNAi Entry Vector Kit進行重組克隆，將退火形成的雙鏈shRNA oligo稀釋成10nM，插入 線性的shRNA表達載體pENTR/U6 vector中，室溫連接30分鐘，構(gòu)建shRNA表達質(zhì)粒，酶連接 體系如表4所示。取5μ 1連接液，轉(zhuǎn)化100μ 1大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞，涂卡那平板，37 °C培 養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。
[0038]每個轉(zhuǎn)化平板分別挑取3個陽性克隆，搖菌后用質(zhì)粒小抽試劑盒(JETSTAR)，按照 以下步驟抽提質(zhì)粒。
[0039] 1.柱平衡:在制備澄清裂解液之前，加入10ml E4溶液平衡純化柱。
[0040] 2.收集細菌細胞:離心沉淀大腸桿菌細胞，小心去除所有培養(yǎng)基。
[0041] 3.細胞懸浮：在沉淀中加入4.0ml El溶液，重懸細胞，直至細胞懸液均勻無細胞 團。
[0042] 4.細胞裂解:加入4. Oml E2溶液，輕柔地上下顛倒徹底混勻，直至裂解液均一，室 溫下孵育5分鐘。
[0043] 5.中和：加入4.0ml E3溶液，立即顛倒多次混勻，直至獲得均一懸液。不應(yīng)殘留細 胞裂解后出現(xiàn)的粘稠物質(zhì)，在室溫下以大于12000g離心混合物10分鐘。
[0044] 6.純化柱裝填:將第5步的上清部分上樣到平衡過的JETSTAR柱中，讓裂解液在重 力流作用下流動。
[0045] 7 .純化柱淋洗:用10.0 ml E5溶液淋洗純化柱兩次，每次淋洗時，在重力流作用下 流空純化柱。
[0046] 8.質(zhì)粒洗脫:用5.0ml E6溶液洗脫DNA，勿強行排出剩余溶液。
[0047] 9.質(zhì)粒沉淀：以3.4ml異丙醇沉淀DNA，4°C下以大于12000g離心30分鐘；用70%乙醇 清洗質(zhì)粒DNA，并再次離心；空氣干燥沉淀10分鐘，用適當體積的緩沖液（IOmM Tris-HCl， pH8.0，TE緩沖液或水）重溶DNA，即得到了干擾羊駝黑色素細胞⑶K5基因表達的羊駝⑶K5 PENTR/U6 shRNA表達質(zhì)粒。
[0048] 以pENTR/U6 vector正向測序引物5' -GGACTATCATATGCTTACCG-3'對獲得的表達質(zhì) 粒進行測序，鑒定重組克隆中插入片段序列與設(shè)計的寡聚單鏈DNA序列一致，說明所述表達 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化成功。
[0049] 實施例3。
[0050]以羊駝⑶K5 pENTR/U6 shRNA表達質(zhì)粒通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染黑色素細胞，分析黑色素 細胞的生物性效應(yīng)。
[0051]轉(zhuǎn)染時，取復(fù)蘇的IX IO5黑色素細胞接種于六孔板中，于黑色素細胞培養(yǎng)基 (Sciencell，San Diego, USA)中培養(yǎng)24小時，貼壁至70%。第2天，棄培養(yǎng)基，加入800仙無 血清的培養(yǎng)基，并加入DNA fectin Transfection Reagent (TIANGEN BIOTECH,BEIJING CO. LTD)與羊駝CDK5 pENTR/U6 shRNA的復(fù)合物并混勻，37°C培養(yǎng)20小時。移去轉(zhuǎn)染試劑， 加入20ml含血清的完全培養(yǎng)基，37 °C培養(yǎng)3天。收集細胞，用于RNA提取。每一實驗組3個重 復(fù)。
[0052]進行實時熒光定量PCR實驗，以檢測目標基因的表達量變化。
[0053]所需的引物如下：
實時熒光定量PCR:收集轉(zhuǎn)染72小時的細胞，提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反應(yīng)程序如 下：
其中圖2、圖3顯示了羊駝⑶K5 pENTR/U6 shRNA表達質(zhì)粒對羊駝黑色素細胞系中⑶K5 表達的影響。圖2為siRNA215轉(zhuǎn)染組與NC組中⑶Κ5 mRNA的表達量(η = 3)，以18S rRNA作為 看家基因。圖3中Al為NC組⑶K5蛋白表達量(n = 3);A2為siRNA215轉(zhuǎn)染組⑶K5蛋白表達量(η = 3);Α3為陰性對照組(不加一抗）中CDK5蛋白表達量(η = 3)。
[0054] 圖4、圖5則顯示了羊駝CDK5 pENTR/U6 shRNA表達質(zhì)粒對羊駝黑色素細胞系中TYR 表達的影響。圖4為siRNA215轉(zhuǎn)染組與NC組中TYR mRNA的表達量(n = 3)，18S rRNA為看家基 因。圖5中Al為NC組TYR蛋白表達量(n = 3);A2為siRNA215轉(zhuǎn)染組TYR蛋白表達量(n = 3);A3 為陰性對照組(不加一抗）中TYR蛋白表達量(n = 3)。
[0055] 圖6、圖7為羊駝CDK5 pENTR/U6 shRNA表達質(zhì)粒對羊駝黑色素細胞系中MClR表達 的影響。其中圖6為siRNA215轉(zhuǎn)染組與NC組中MClR mRNA的表達量(n = 3)，18S rRNA作為看 家基因。圖7中Al為NC組MClR蛋白表達量(n = 3);A2為siRNA215轉(zhuǎn)染組MClR蛋白表達量(η = 3) ;Α3為陰性對照組(不加一抗）中MClR蛋白表達量(η = 3)。
[0056] 上述結(jié)果表示，CDK5敲除顯著降低了黑色素細胞中MClR和TYR的mRNA和蛋白表達。
[0057] 實施例4。
[0058] 將羊駝⑶K5 pENTR/U6 shRNA表達質(zhì)粒通過顯微注射法導(dǎo)入小鼠胚胎并進行胚胎 移植后，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠，檢測所構(gòu)建的表達質(zhì)粒在小鼠皮膚中的生物性效應(yīng)。
[0059] 具體過程如下。
[0060] 1.準備假孕母鼠：將雄鼠進行輸精管結(jié)扎術(shù)后，與可育雌鼠交配，刺激雌鼠發(fā)生一 系列妊娠生理變化，得到假孕母鼠。
[0061] 2.準備受精卵:將孕馬血清與絨毛膜促性腺激素(HCG)注射入可育雌鼠，促使其超 數(shù)排卵，并與可育雄鼠交配。交配次日，以手術(shù)法從輸卵管內(nèi)取受精卵。
[0062] 3.轉(zhuǎn)基因：用顯微注射系統(tǒng)將構(gòu)建的羊駝CDK5 pENTR/U6 shRNA表達質(zhì)粒DNA導(dǎo)入 小鼠受精卵的雄原核內(nèi)。
[0063] 4.胚胎移植:將帶有羊駝CDK5 pENTR/U6 shRNA表達質(zhì)粒DNA的受精卵經(jīng)手術(shù)法移 入假孕母鼠的輸卵管內(nèi)，使胚胎在假孕母鼠內(nèi)發(fā)育并產(chǎn)子。
[0064] 5.鑒定轉(zhuǎn)基因陽性鼠：1)幼鼠在出生后第5-7天，取約3cm長的尾巴組織，并提取 DNA，用PCR法(所用引物見表7)鑒定外源基因是否整合。2)目標基因表達量的檢測，取帶有 外源基因的小鼠皮膚RNA，用實時熒光定量PCR法（所用引物和反應(yīng)程序同實施例3)鑒定 ⑶K5的表達量，以鑒定羊駝⑶K5 pENTR/U6 shRNA表達質(zhì)粒在小鼠皮膚內(nèi)的效應(yīng)。3)轉(zhuǎn)基 因小鼠毛色的變化，通過肉眼觀察毛色變化，以鑒定轉(zhuǎn)基因陽性鼠毛色表型的變化。 表？：PCR法檢測轉(zhuǎn)基因:陽性小鼠用引物序列
[0065] 圖8是pENTR/U6-⑶K5-shRNA載體對黑色素細胞中黑色素顆粒產(chǎn)生的影響，圖中可 以看出，CDK5表達下調(diào)后可使黑色素細胞中黑色素顆粒的產(chǎn)量下降約40%。
[0066]圖9為從所檢測轉(zhuǎn)基因小鼠中擴增出來的陽性片段顯示，在所檢測轉(zhuǎn)基因小鼠中 檢測到了CDK5 pENTR/U6 shRNA的表達，表明轉(zhuǎn)基因陽性鼠構(gòu)建成功。
[0067]圖10為以實時熒光定量PCR法測定轉(zhuǎn)基因小鼠皮膚中⑶K5基因的表達量結(jié)果。其 中Negative為非轉(zhuǎn)基因小鼠的⑶K5表達量;sample為轉(zhuǎn)基因小鼠的⑶K5表達量。從圖中可 以看出，CDK5在轉(zhuǎn)基因小鼠樣皮膚中的表達量均明顯低于非轉(zhuǎn)基因小鼠中的表達量。
[0068]圖11提供了轉(zhuǎn)基因小鼠毛色變化的比對效果，圖中A為野生型小鼠的毛色，B為轉(zhuǎn) 基因小鼠的毛色，可以看出毛色從野生型的黑色變?yōu)榱俗厣?br>【主權(quán)項】
1. 干擾羊駝黑色素細胞〇)1(5基因表達的8丨1?祖，具有369 10如.1、369 10吣.2所示的 序列： 正義鏈:5 ' 一GCGACAAGAAGCUGACUUU-3 ' 反義鏈:5 ' 一AAAGUCAGCUUCUUGUCGC-3 '。2. 編碼shRNA的DNA，所述shRNA是含有權(quán)利要求1所述s iRNA正義鏈或反義鏈的shRNA。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼8111?熟的0財，所述0嫩具有369 10如.3、369 10如.4所 示的序列。4. 包含有權(quán)利要求3所述shRNA的干擾羊駝黑色素細胞CDK5基因表達的羊駝CDK5 PENTR/U6 shRNA表達質(zhì)粒。5. 權(quán)利要求4所述的表達質(zhì)粒在調(diào)控羊駝毛色上的應(yīng)用。6. 權(quán)利要求4所述的表達質(zhì)粒在調(diào)節(jié)羊駝TYR和MC1R基因上的應(yīng)用。7. 權(quán)利要求4所述的表達質(zhì)粒對小鼠毛色表型變化的影響。
【文檔編號】C12N5/10GK105861502SQ201610259139
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年4月25日
【發(fā)明人】范瑞文, 董常生, 張俊珍, 楊珊珊, 姬凱元, 石占全, 劉彧, 胡帥鵬, 劉學賢
【申請人】山西農(nóng)業(yè)大學