一種從三文魚罐頭中提取dna的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種從三文魚罐頭中提取DNA的方法。進(jìn)一步地，本發(fā)明的方法看用于鑒別三文魚罐頭中三文魚品種。本發(fā)明的方法可以包括如下步驟：a)：稱取一定質(zhì)量的三文魚罐頭樣品，利用DNA提取液提取DNA，其中所述的DNA提取液的組成為：4％CTAB、100mmol/L Tris?HCl(pH 8.0)、1.4mol/L NaCl、20mmol/L EDTA(pH 8.0)；b)：以a)中得到的DNA為模板，擴(kuò)增出COI的212bp的DNA片段；c)：將b)中擴(kuò)增得到的片段進(jìn)行測(cè)序，與已有DNA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列特征比對(duì)，得到三文魚品種信息。本發(fā)明建立了能成功提取用于鑒別三文魚罐頭中三文魚品種的DNA的方法，對(duì)提高我國(guó)罐頭工業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量安全水平，規(guī)范行業(yè)發(fā)展，保護(hù)消費(fèi)者合法權(quán)益和知情權(quán)具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。
【專利說明】
-種從H文魚罐頭中提取DNA的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ] 一種提取DNA的方法，特別是從S文魚罐頭中提取DNA的方法。根據(jù)本發(fā)明的方法 所提取的DNA可用于鑒別S文魚罐頭中S文魚品種，進(jìn)而用于鑒別食品真實(shí)性。
【背景技術(shù)】
[0002] =文魚，是娃縛科魚類的總稱，食用性名貴魚類，主要分布于高締度地區(qū)的冷水魚 類，由于其含有豐富蛋白質(zhì)和人體所需的脂肪酸，健康綠色無(wú)污染，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，深受大 眾的喜愛。娃科魚包括3亞科7屬36種，主要為娃亞科(Salmoniae)，白娃亞科(Coregoninae) 和茵魚亞科(Thymallidae)。食品法典委員會(huì)CAC(O)DEX STAN 3-1981KS文魚罐頭》中規(guī) 定，大西洋娃魚（Salmo salar)、紅大麻哈魚（Oncorhynchus nerka)、銀大馬哈魚 (Oncorhynchus kisutch)、娃魚（Oncorhynchus tschaw}ftscha)、駝背大馬哈魚 (Oncorhynchus gorbusch曰）大馬哈魚（Oncorhynchus ket曰）、蟲工魚尊（Oncorhynchus m曰sou)7 種魚類均可W加工成=文魚罐頭。
[0003] 魚類制品原料品種鑒別成為水產(chǎn)加工行業(yè)中面臨的重要問題之一，目前國(guó)內(nèi)外市 場(chǎng)上=文魚W次充好、假冒的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，損害了消費(fèi)者的合法權(quán)益和知情權(quán)。例如，據(jù) 統(tǒng)計(jì)國(guó)內(nèi)挪威立文魚每公斤市場(chǎng)價(jià)高達(dá)240元，虹縛魚的市場(chǎng)價(jià)格每公斤60元左右，=文魚 罐頭食品標(biāo)簽中僅標(biāo)注原料為=文魚，并不標(biāo)注出=文魚的具體品種。
[0004] 對(duì)于加工肉制品中原料品種鑒別技術(shù)，目前?；趯?duì)肉制品中特定理化成分的分 析，如蛋白質(zhì)、脂肪酸等，采用色譜、光譜、電泳等方法識(shí)別，運(yùn)些方法適用于加工程度相對(duì) 較低的肉制品，如火腿腸、肉干、肉脯等，對(duì)于=文魚罐頭食品，與一般加工肉類食品不同， 其在制作過程中須經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間的高溫殺菌處理，一般在118~12rc下處理20~90min，運(yùn)給 魚罐頭食品中所用原料的品種鑒別帶來了困難。
[0005] 細(xì)胞色素氧化酶(切tochrome oxidase,C0X)是線粒體內(nèi)呼吸鏈電子傳遞的終末 復(fù)合物，是線粒體氧化能力的關(guān)鍵調(diào)節(jié)物質(zhì)。細(xì)胞色素 C氧化酶亞基I (C0I)是細(xì)胞色素 C氧 化酶具有酶催化活性的3個(gè)亞基之一。COXI在生物的系統(tǒng)分類W及種類鑒定方面有著廣泛、 重要的作用。劉君等人報(bào)道了基于線粒體COI的DNA條形碼技術(shù)在貽貝科種類鑒定中的應(yīng)用 (水生生物學(xué)報(bào)，2011,35(5):874-88);梁華芳等人報(bào)道了利用COI基因序列對(duì)中國(guó)沿海龍 郵屬8種龍郵進(jìn)行分子系統(tǒng)學(xué)研究（2011);王敏曉等人基于線粒體COXl片段序列對(duì)對(duì)膠州 灣浮游動(dòng)物進(jìn)行了 DNA條形碼分析(2011);李新光報(bào)道了基于COI的DNA條形碼的魚片（肉） 真?zhèn)舞b別技術(shù)研究(2013)。
[0006] 在魚類物種鑒別中，DNA條形碼技術(shù)是W-段650bp細(xì)胞色素 C氧化酶亞基I(COI) 基因序列作為標(biāo)準(zhǔn)序列，從而實(shí)現(xiàn)魚類的快速鑒別。但是對(duì)于DNA降解嚴(yán)重的魚類罐頭，DNA 條形碼技術(shù)可能不能夠擴(kuò)增出適當(dāng)大小的目的片段，從而導(dǎo)致無(wú)法對(duì)魚類品種進(jìn)行有效鑒 別。
[0007] 為了提高我國(guó)魚類罐頭(尤其是=文魚類罐頭)工業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量安全水平，規(guī)范行業(yè) 發(fā)展，保護(hù)消費(fèi)者合法權(quán)益和知情權(quán)，急需能擴(kuò)增出適當(dāng)大小的目的片段，從而對(duì)魚類品種 進(jìn)行有效鑒別的方法。運(yùn)對(duì)于消費(fèi)者而言，將具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[000引本發(fā)明的主要目的是針對(duì)=文魚罐頭食品原料標(biāo)示模糊，現(xiàn)有鑒別分析技術(shù)無(wú)法 準(zhǔn)確鑒別其原料品種的問題，開發(fā)一種從S文魚罐頭提取能有效鑒別S文魚種類的DNA的 方法。
[0009] 本發(fā)明的發(fā)明人通過優(yōu)化S文魚罐頭中DNA提取方法，得到適用于PCR擴(kuò)增的DNA 模板，W細(xì)胞色素 C氧化酶亞基I(COI)基因部分序列為目的片段，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增出DNA片段 (例如長(zhǎng)度212bp大?。?，進(jìn)行序列測(cè)定，與國(guó)際通用DNA數(shù)據(jù)庫(kù)，如Genbank中的已有的立文 魚COI基因序列比對(duì)，確定罐頭樣品中的=文魚品種。
[0010] -方面，本發(fā)明提供了一種從=文魚罐頭中提取DNA的方法，所述方法包括使用含 有CTAB的DNA提取液。
[0011] 優(yōu)選地，本發(fā)明的DNA提取液中含有4 %的CTAB。更優(yōu)選地，本發(fā)明的DNA提取液的 組成為：4%CTAB、100mmol/L Tris-HCUpH 8.0)、1.4mol/L NaCl、20mmol/L 抓 TA(pH 8.0)。
[0012] 任選地，本發(fā)明的從=文魚罐頭中提取DNA的方法包括稱取一定質(zhì)量的=文魚罐 頭樣品，加入適量氯仿：甲醇:水混合溶液，室溫靜置過夜，離屯、，棄上清，并用無(wú)菌去離子水 清洗樣品。
[0013] 優(yōu)選地，其中氯仿：甲醇：水混合溶液是氯仿：甲醇：水=1: 2:0.8(體積比）的混合 液。
[0014] 具體而言，本發(fā)明的從S文魚罐頭中提取DNA的方法包括如下步驟：
[0015] a):稱取一定量的=文魚罐頭樣品，加入適量氯仿：甲醇:水混合溶液，室溫靜置過 夜，離屯、，棄上清，并用無(wú)菌去離子水清洗樣品；和
[0016] b)在步驟a)中得到的樣品中加入適量DNA提取液，提取S文魚罐頭中DNA。
[0017] 本發(fā)明還提供了一種用于從S文魚罐頭中擴(kuò)增COI的部分基因序列的方法，其包 括：
[0018] a):稱取一定量的=文魚罐頭樣品，加入適量氯仿：甲醇:水混合溶液，室溫靜置過 夜，離屯、，棄上清，并用無(wú)菌去離子水清洗樣品；
[0019] b)在步驟a)中得到的樣品中加入適量DNA提取液，提取S文魚罐頭中DNA;
[0020] C) W步驟b)中獲得DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0021] 在本發(fā)明中，擴(kuò)增COI的部分基因序列所用的引物可W為S文魚的細(xì)胞色素 C氧化 酶亞基I ( C 0 I )基因的部分序列的通用引物對(duì)，例如，上游引物序列可為： TGTAAAACGACGGCCAGTTCCACTAATCACAARGAT ATTGGT AC;下游引物序列可為： CAGGAAACAGCTATGACGAAAATCATAATGAAGGCATGAGC。
[0022] 示例性地，所述PCR的擴(kuò)增條件為：95°C預(yù)變性2min;95°C變性lmin，46°C退火 lmin，72°C 延伸 3〇8,5個(gè)循環(huán)；95°(：變性1111111，53°(：退火1111111，72°(：延伸3〇3,35個(gè)循環(huán)；721： 延伸5min;反應(yīng)體系為IOXPCR buffer 2.5化，dNTP 0.2mmol/L，上游引物0.8pmol/L，下游 引物0.8pmol/L，DNA模板200ng，Taq酶1.5U，用d地2〇將總體積補(bǔ)充至化化。
[0023] 本發(fā)明進(jìn)而提供了鑒別=文魚罐頭中=文魚品種的方法，其包括如下步驟：
[0024] (I)從S文魚罐頭制品中提取DM, W得到適于PCR擴(kuò)增的DNA模板；
[0025] (2) W步驟(1)中提取的DNA為模板，對(duì)細(xì)胞色素 C氧化酶亞基I(COI)基因部分序列 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，W擴(kuò)增出DNA片段(優(yōu)選為長(zhǎng)度100-5(K)bp，更優(yōu)選150-25化P，最優(yōu)選21化P大 ?。?；
[0026] (3)對(duì)步驟(2)中擴(kuò)增出的DNA片段進(jìn)行測(cè)序并將所測(cè)得的DNA序列與已知的S文 魚品種的COI基因序列進(jìn)行比對(duì)，并確定該=文魚罐頭中的=文魚品種。
[0027] 任選地，步驟(3)中的比對(duì)是通過將所測(cè)定的COI基因的部分序列與DNA數(shù)據(jù)庫(kù)(如 Genbank)中的已有的S文魚COI基因序列比對(duì)。優(yōu)先地，所述比對(duì)是通過Blast比對(duì)。
[0028] 通過本發(fā)明的擴(kuò)增方法所擴(kuò)增的產(chǎn)物可用于鑒別=文魚罐頭中=文魚品種中，其 包括如下步驟:測(cè)序所擴(kuò)增的序列W及將所測(cè)序的序列與已知的S文魚品種的COI基因序 列進(jìn)行比對(duì)，并確定該=文魚罐頭中的=文魚品種。
[0029] 作為一個(gè)非限制性的實(shí)施方式，利用本發(fā)明的方法所提取或擴(kuò)增的DNA可用于鑒 別=文魚罐頭中=文魚品種，例如，可W通過如下步驟：
[0030] a):稱取一定質(zhì)量的=文魚罐頭樣品，加入適量氯仿：甲醇:水混合溶液，室溫靜置 過夜，離屯、，棄上清，并用無(wú)菌去離子水清洗樣品；
[0031] b):在步驟a)中得到的樣品中加入適量DNA提取液(如上述的DNA提取液），提取S 文魚罐頭中DNA;
[0032] C): W步驟b)中得到的DNA為模板，W細(xì)胞色素 C氧化酶亞基I(COI)基因部分序列 為目的片段，采用微條形碼引物擴(kuò)增，得到片段大小為212bp的DNA片段，上游引物序列： TGT AAAA CGACGGCCAGTTC CA CTAAT CACA ARGATATTGGTAC，下游引 物序列： CAGGAAACAGCTATGACGAAAATCATAATGAAGGCATGAGC。
[0033] (1):?〇?擴(kuò)增條件為95。(：預(yù)變性2111111;95。(：變性1111111，46。(：退火1111111，72。(：延伸303， 5個(gè)循環(huán);95°C變性lmin，53°C退火lmin，72°C延伸3〇3,35個(gè)循環(huán);72°(：延伸5111111;反應(yīng)體系 為IOXPCR buffer 2.5化，dNTP 0.2mmol/L，上游引物0.8pmol/L，下游引物0.8pmol/L，DNA 模板20化g Jaq酶1.抓，用dd出明尋總體積補(bǔ)充至化化。
[0034] e):將步驟d)中擴(kuò)增得到的DNA片段進(jìn)行序列測(cè)定，并將序列在Genbank中進(jìn)行 Blast比對(duì)，確定S文魚品種。
[0035] 優(yōu)選地，本發(fā)明所述的氯仿：甲醇：水混合溶液是氯仿：甲醇：水=1: 2 :0.8 (體積 比）的混合液。
[0036] 本發(fā)明針對(duì)罐頭中DNA降解嚴(yán)重，PCR反應(yīng)容易失敗的情況，WCOI部分序列（微條 形碼)作為目的片段，同時(shí)優(yōu)化了S文魚罐頭中DNA的提取方法，能夠準(zhǔn)確可靠的得到S文 魚罐頭中=文魚的具體品種信息，其優(yōu)點(diǎn)在于操作簡(jiǎn)便易行，操作流程易于實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化。
【附圖說明】：
[0037] 圖1顯示了 4 % CTAB提取液和2 % CTAB提取液對(duì)DNA提取效果的影響。
[0038] 圖2是針對(duì)=文魚罐頭進(jìn)行引物篩選W擴(kuò)增分別是2^bp、358bp和47化P的目的片 段的結(jié)果，其中：圖2A是212bp目的片段擴(kuò)增結(jié)果；圖2B是358bp目的片段擴(kuò)增結(jié)果；W及圖 2C是472bp目的片段擴(kuò)增結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】：
[0039] 為了更好的理解本發(fā)明，下面結(jié)合具體實(shí)例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說明。
[0040] 實(shí)施例：
[0041] 1.樣品采集從市面采集不同加工方式的=文魚罐頭樣品，如蒲燒、水浸、油浸等。 [00創(chuàng) 2. DNA提取
[0043] a)稱取1 OOmgS文魚罐頭肌肉組織樣品于2mL離屯、管中，加入ImL氯仿：甲醇：水= 1:2:0.8(體積比），室溫靜置過夜，500化pm離屯、3min，棄上清，無(wú)菌去離子水清洗樣品，樣品 組織于-40°C保存?zhèn)溆茫?br>[0044] b)將步驟a)得到樣品，無(wú)菌條件下剪碎后加入ImL DNA提取液，提取液組成為4% CTAB、100mmol/L Tris-HCl(抑 8.0)、1.4mol/L NaCl、20mmol/L 抓TA(pH 8.0)，置于65°C 恒溫水浴槽中，溫育I-化，期間不時(shí)顛倒混勻，直至樣品完全消化;溫育后，離屯、取上清液至 一新的2mL離屯、管中，加等體積的氯仿：異戊醇= 24:1(體積比）溶液緩慢震蕩至乳白色， 1200化/min離屯、IOmin;重復(fù)上述步驟一次;取上清液加2/3體積預(yù)冷的異丙醇沉淀DNA，-20 °C，比;離屯、棄上清液，加入80化L 70%乙醇進(jìn)行洗涂?jī)纱危缓髼壢ヒ掖?，干燥，沉淀?0y L無(wú)菌dd出0溶解，-20°C保存。
[0045] 3. PCR 擴(kuò)增
[0046] 采用微條形碼引物對(duì)提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，上游引物序列： TGT AAAA CGACGGCCAGTTC CA CTAAT CACA ARGATATTGGTAC，下游引 物序列： CAGGAAACAGCTATGACGAAAATCATAATGAAGGCATGAGC，目的片段大小為21 化P。
[0047] PCR 擴(kuò)增條件為 95°C 預(yù)變性2min;95°C 變性 1111111，46°(：退火1111111，72°(：延伸3〇3,5個(gè) 循環(huán);95°C變性lmin，53°C退火lmin，72°C延伸3〇3,35個(gè)循環(huán);72°(：延伸5111111;反應(yīng)體系為10 X PCR buf f er2.5化，dNTP 0.2mmo 1 /L，上游引物0. Spmo 1 /L，下游引物0. Spmo 1 /L，DNA模板 200ng，Taq酶1.抓，用d地2〇將總體積補(bǔ)充至化化。
[0048] 4.將擴(kuò)增產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，并送往測(cè)序公司測(cè)序，運(yùn)用NCBI的 BLAST程序，把所有樣品的PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已有S文魚COI基因序列進(jìn) 行比較，確認(rèn)=文魚品種，比對(duì)結(jié)果見表1。
[0049] 表1=文魚罐頭中=文魚品種鑒別結(jié)果
[(K)加 ]
[0051 ] 對(duì)比實(shí)施例1:關(guān)于DNA提取說明
[0052]采用四種DNA提取方法針對(duì)不同加工類型的S文魚罐頭進(jìn)行DNA提取。分別是如實(shí) 施例1的CTAB法W及常規(guī)的SDS法、脈鹽法、試劑盒法，W不同片段長(zhǎng)度引物進(jìn)行擴(kuò)增，W擴(kuò) 增的結(jié)果(能否順利擴(kuò)增為依據(jù))判斷DNA提取方法的優(yōu)劣。
[0化3]四種DNA提取方法PCR擴(kuò)增結(jié)果匯總
[0化4]
[0化5] +:擴(kuò)增良好，未擴(kuò)增出
[0056]從擴(kuò)增結(jié)果來看，4種提取方法均能得到123bp的目的片段，當(dāng)目的片段增大到 224bp時(shí)，CTAB法能夠擴(kuò)增絕大多數(shù)樣品，所WCTAB法為最優(yōu)的方法。
[0化7] 對(duì)比實(shí)施例2:關(guān)于CTAB法的優(yōu)化
[0058] 根據(jù)實(shí)施例1的方法，采用不同系列濃度的CTAB對(duì)S文魚罐頭進(jìn)行DNA提取。結(jié)果 發(fā)現(xiàn)，4 % CTAB的提取效果最佳。示例性地，圖1顯示了 4 % CTAB提取液和2 % CTAB提取液對(duì) DNA提取效果的影響。其中左側(cè)的1-7泳道對(duì)應(yīng)于4 %CTAB提取液；右側(cè)的泳道對(duì)應(yīng)于2 % CTAB提取液。
[0059] 對(duì)比實(shí)施例3:關(guān)于目的片段的選擇
[0060] 盡管能從=文魚罐頭中獲得123bp的目的片段(如上述實(shí)施例中的表1所示），但根 據(jù)研究結(jié)果，基于123bp并不能鑒定到種水平，只能到屬(下表）。
[0061 ] S文魚罐頭商品原料品種鑒定 [00621
[0063] 因此需要獲得更大的片段。針對(duì)=文魚罐頭進(jìn)行引物篩選W擴(kuò)增分別是212bp、 358bp和47化P的目的片段，擴(kuò)增結(jié)果如圖2A-圖2C:其中圖2A是212bp目的片段擴(kuò)增結(jié)果；圖 2B是358bp目的片段擴(kuò)增結(jié)果；W及圖2C是472bp目的片段擴(kuò)增結(jié)果。
[0064] 根據(jù)電泳結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在當(dāng)目的片段為212bp時(shí)，所有樣品均能獲得較好的擴(kuò)增，并 且基于該片段的測(cè)序分析能夠?qū)?文魚罐頭鑒定至種水平。
[0065] 最后應(yīng)當(dāng)說明的是，W上實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參 照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可W對(duì)發(fā)明的 技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在 本發(fā)明的權(quán)利要求范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種從三文魚罐頭中提取DNA的方法，其包括使用含有CTAB的DNA提取液。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述DNA提取液中含有4 %的CTAB。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述DNA提取液的組成為：4 % CTAB、1 OOmmo 1 /L Tris-HCl(pH 8.0)、1.4mol/L NaCl、20mmol/L EDTA(pH 8.0)。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其包括稱取一定質(zhì)量的三文魚罐頭樣品，加入適量氯 仿：甲醇:水混合溶液，室溫靜置過夜，離心，棄上清，并用無(wú)菌去離子水清洗樣品。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中氯仿：甲醇:水混合溶液是氯仿：甲醇:水=1: 2:0.8 (體積比）的混合液。6. -種擴(kuò)增三文魚罐頭中細(xì)胞色素 C氧化酶亞基I(COI)基因的部分序列的方法，其包 括以權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的方法提取的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中擴(kuò)增所用的引物對(duì)序列如下：上游引物序列： TGTAAAACGACGGCCAGTTCCACTAATCACAARGATATTGGTAC;下游引物序列： CAGGAAACAGCTATGACGAAAATCATAATGAAGGCATGAGC〇8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中PCR擴(kuò)增的條件為：95 °C預(yù)變性2min ; 95 °C變性 111^11，46°(：退火1111丨11，72°(：延伸3〇8,5個(gè)循環(huán)；95°(：變性1111丨11，53°(：退火1111丨11，72°(：延伸3〇8， 35個(gè)循環(huán)；72°C延伸5min;反應(yīng)體系為 10XPCR buffer 2.5yL，dNTP 0.2mmol/L，上游引物 0 · 8pmol/L，下游引物0 · 8pmol/L，DNA 模板200ng，Taq酶 1 · 5U，用ddH20將總體積補(bǔ)充至 25yL。9. 根據(jù)權(quán)利要求6-8中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)胞色素 C氧化酶亞基I(COI)基因 的部分序列的大小為212bp。10. 根據(jù)權(quán)利要求6-9中任一項(xiàng)所述的方法所擴(kuò)增的產(chǎn)物在鑒別三文魚罐頭中三文魚 品種中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK105838708SQ201610282830
【公開日】2016年8月10日
【申請(qǐng)日】2016年4月29日
【發(fā)明人】孟鎮(zhèn), 仇凱, 鐘其頂, 安麗艷, 楊彤輝
【申請(qǐng)人】中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院