一種無損傷提取中華鱘dna的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，特別涉及一種無損傷提取中華鋳DNA的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]中華鋳WcijOeftser sinensis是一種古老的大型海河回游性魚類，曾經(jīng)分布于我國的長江和珠江河流，由于近年來過度捕撈、環(huán)境污染、水利工程建設(shè)等人為原因造成了中華鋳的數(shù)量急劇下降，現(xiàn)在珠江流域的中華鋳已經(jīng)絕跡，中華鋳已成為極度瀕危的物種。
[0003]然而，進(jìn)行中華鋳的遺傳多樣性研究和保護(hù)需要大量的中華鋳樣本進(jìn)行生物分析，進(jìn)行生物分析的基礎(chǔ)往往是提取DNA和RNA進(jìn)行研究。傳統(tǒng)的提取中華鋳DNA的方法是從肌肉、鰭或者血液內(nèi)提取，這些提取DNA的方法會對中華鋳造成很嚴(yán)重的損傷，影響中華鋳的后期育種工作，甚至?xí)τ仔〉闹腥A鋳造成死亡，由此可見，開展一種無損傷提取中華鋳DNA的方法勢在必行。
[0004]無損傷提取DNA是指在不傷害動物本身的情況下，通過收集脫落的毛發(fā)、皮膚、羽毛、糞便、尿液、脫落的魚鱗等從中提取DNA的過程。目前關(guān)于魚類無損傷提取DNA的報道僅有幾篇，關(guān)于中華鋳無損傷提取DNA尚未報道。宋君等報道了一種魚類DNA非損傷檢測方法，宋君等用試劑盒對鯽魚粘液提取DNA，結(jié)果證明了從魚類粘液提取的DNA濃度和從尾鰭和鱗片提取的DNA濃度相差不大。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供了一種操作簡單快速的提取中華鋳DNA的方法，實現(xiàn)無損傷提取中華鋳DNA。
[0006]一種無損傷提取中華鋳DNA的方法，所述方法包括如下步驟:
1)獲取樣本:從中華鋳身上刮取粘液，置0-4°C中保存；
2)樣本的處理:把所述步驟1)的粘液離心，除去上清液，得到離心后的粘液；
3)裂解細(xì)胞:把裂解液和蛋白酶K加入所述步驟2)離心后的粘液，50-60°C下水浴
0.5-1.5 h，得到裂解細(xì)胞后的粘液；
4)沉淀蛋白質(zhì):把飽和酚放入所述步驟2)裂解細(xì)胞后的粘液中，震蕩20分鐘，離心得到上清液，然后在上清液中加入氯仿，震蕩18-25分鐘，離心得到除去蛋白質(zhì)的上清液；
飽和酚的作用是使蛋白質(zhì)變性，抑制DNA酶的作用，氯仿的作用是除去飽和酚，氯仿可以和飽和酚混合，但是不會溶于水，DNA溶于水中，飽和酚溶于氯仿中，氯仿和水是分開的，使DNA中不含有飽和酚；
5)沉淀DNA:將-28°C至_20°C的異丙醇加入所述步驟3)除去蛋白質(zhì)的上清液，劇烈震蕩，離心除去上清液，得到沉淀為DNA ;
異丙醇溶于水，但是不和DNA發(fā)生任何化學(xué)反應(yīng)，并且可以奪取DNA中的水，使DNA脫水沉淀下來；
6)洗滌DNA:將70%的乙醇加入所述步驟5)沉淀中，離心除去上清液，洗滌沉淀物2-4次，得到洗滌后的DNA;
第五步的DNA沉淀會含有鹽離子，70%乙醇的作用是除去鹽離子；
7)獲取DNA:加入超純水至所述步驟6)洗滌后的DNA中，置于0-4°C下保存；完成中華鋳DNA的提取。
[0007]所述步驟1)從中華鋳身上刮取粘液的方向為順著從中華鋳的頭到尾的方向刮取，防止對中華鋳造成損傷。
[0008]所述步驟3)裂解液的配置為 0.05M EDTA、5%SDS、0.01M Tris_Hcl、0.3M 乙酸鈉，所述蛋白酶1^濃度為20mg/ml。
[0009]所述步驟3)加入的裂解液和蛋白酶K的體積比為裂解液:蛋白酶K:尚心后的粘液=40:2:15。
[0010]所述步驟3)把裂解液和蛋白酶K加入所述步驟2)離心后的粘液，56°C下水浴lh，56°C是蛋白酶K的最適溫度，水浴lh溶解蛋白質(zhì)和裂解細(xì)胞。
[0011]所述步驟2)、步驟4)、步驟5)和步驟6)中的離心條件均為溫度0-4°C，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10-20分鐘，低溫離心的目的是防止在提取的過程中DNA降解。
[0012]本發(fā)明提供本發(fā)明的目的是提供了一種操作簡單快速的提取中華鋳DNA的方法，有益效果如下:
1、本發(fā)明建立了一套完整的提取中華鋳粘液的方法，本發(fā)明可以快速有效的提取中華鋳DNA，提取的DNA條帶清晰，無拖尾現(xiàn)象，說明提取的DNA質(zhì)量高，不收蛋白質(zhì)的污染，結(jié)果穩(wěn)定可靠；
2、本發(fā)明提供的提取中華鋳粘液DNA方法不會對中華鋳造成任何損傷；
3、本發(fā)明提供的提取中華鋳粘液DNA方法根據(jù)粘液中的DNA易提取和易降解的特點，省去了苯酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)混合液和氯仿:異戊醇(24:1)混合液，比傳統(tǒng)的酚-氯仿法更為簡單快速，節(jié)省了 DNA提取時間，從而有效防止DNA氧化造成的損失；
4、本發(fā)明提供的提取中華鋳粘液DNA方法費用比試劑盒法和酚氯仿法較低。
【附圖說明】
[0013]圖1:本發(fā)明所提取的DNA條帶示意圖；
圖2:本發(fā)明所提取的DNA為模板用微衛(wèi)星引物進(jìn)行檢測結(jié)果示意圖。
【具體實施方式】
[0014]下面結(jié)合實施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明要求保護(hù)的范圍并不局限于實施例表述的范圍。
[0015]實施例1
一種無損傷提取中華鋳DNA的方法，所述方法包括如下步驟:
1)獲取樣本:在湖北宜昌中華鋳研究所養(yǎng)殖池內(nèi)取6條中華鋳，把中華鋳從水中撈起，用手指在中華鋳體表輕輕的刮，刮的方向為從頭到尾的方向，把刮到手指上的粘液放入離心管中，等取到200ul后，把裝有粘液的離心管放入0°C下，防止DNA降解；
2)樣本的處理:把所述步驟1)的粘液離心，除去上清液，得到離心后的粘液；
3)裂解細(xì)胞:把裂解液和蛋白酶K加入所述步驟2)離心后的粘液，56°C下水浴lh，使其快速的裂解，得到裂解細(xì)胞后的粘液；
4)沉淀蛋白質(zhì):把飽和酚放入所述步驟2)裂解細(xì)胞后的粘液中，震蕩20分鐘，離心得到上清液，把上清液用減掉剪掉尖頭的槍頭移入另一個干凈的離心管內(nèi)，然后在上清液中加入氯仿，震蕩20分鐘，離心，把上清液用減掉剪掉尖頭的槍頭移入另一個干凈的離心管內(nèi)，注意不要吸到白色的隔離層，得到除去蛋白質(zhì)的上清液；
5)沉淀DNA:將_20°C的異丙醇加入所述步驟3)除去蛋白質(zhì)的上清液，劇烈震蕩，離心除去上清液，得到沉淀為DNA ;
6)洗滌DNA:將70%的乙醇加入所述步驟5)沉淀中，離心除去上清液，得到洗滌后的
DNA ；
7)獲取DNA:加入超純水50 ul至所述步驟6)洗滌后的DNA中，置于4°C下保存； 完成中華鋳DNA的提取。
[0016]所述步驟3)裂解液的配置為 0.05M EDTA、5%SDS、0.01M Tris_Hcl、0.3M 乙酸鈉，所述蛋白酶1^濃度為20mg/ml。
[0017]所述步驟3)加入的裂解液和蛋白酶K的體積比為裂解液:蛋白酶K:尚心后的粘液=40:2:15。
[0018]所述步驟2)、步驟4)、步驟5)和步驟6)中的離心條件均為溫度4°C，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘。
[0019]實施例2 DNA的檢測
1、電泳檢測:取提取的5ulDNA在1%的瓊脂糖凝膠電泳中檢測，120V電壓20分鐘，經(jīng)凝膠成像分析系統(tǒng)觀察點樣點附近是否存在DNA條帶，結(jié)果如圖1所示，在點樣點附近存在白色的DNA條帶，并且DNA條帶清晰，無拖尾的現(xiàn)象，說明DNA提取較好。
[0020]2、PCR檢測:以提取的DNA為模板用微衛(wèi)星引物進(jìn)行檢測。PCR擴增體系為:PCR反應(yīng)液12.5ul、上下游引物各lul、超純水9.5ul、DNA模板lul。PCR反應(yīng)程序為:95°C預(yù)變性2min ； 95°C變性30s，退火溫度復(fù)性30s，72°C延伸30s，35個循環(huán)；72°C延伸lOmin ；4°C保存。把PCR擴增產(chǎn)物放入1%的瓊脂糖凝膠電泳中檢測，120V電壓20分鐘，經(jīng)凝膠成像分析系統(tǒng)觀察呈現(xiàn)引物所要求的擴增條帶，結(jié)果如圖2所示，說明DNA提取較好，可用于分子實驗研究。
上述的實施例僅為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，而不應(yīng)視為對于本發(fā)明的限制，本申請中的實施例及實施例中的特征在不沖突的情況下，可以相互任意組合。本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)以權(quán)利要求記載的技術(shù)方案，包括權(quán)利要求記載的技術(shù)方案中技術(shù)特征的等同替換方案為保護(hù)范圍。即在此范圍內(nèi)的等同替換改進(jìn)，也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1.一種無損傷提取中華鋳DNA的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟: 1)獲取樣本:從中華鋳身上刮取粘液，置0-4°C中保存； 2)樣本的處理:把所述步驟1)的粘液離心，除去上清液，得到離心后的粘液； 3)裂解細(xì)胞:把裂解液和蛋白酶K加入所述步驟2)離心后的粘液，50-60°C下水浴0.5-1.5 h，得到裂解細(xì)胞后的粘液； 4)沉淀蛋白質(zhì):把飽和酚放入所述步驟2)裂解細(xì)胞后的粘液中，震蕩20分鐘，離心得到上清液，然后在上清液中加入氯仿，震蕩18-25分鐘，離心得到除去蛋白質(zhì)的上清液； 5)沉淀DNA:將-28°C至_20°C的異丙醇加入所述步驟3)除去蛋白質(zhì)的上清液，劇烈震蕩，離心除去上清液，得到沉淀為DNA ; 6)洗滌DNA:將70%的乙醇加入所述步驟5)沉淀中，離心除去上清液，洗滌沉淀物2-4次，得到洗滌后的DNA; 7)獲取DNA:加入超純水至所述步驟6)洗滌后的DNA中，置于0_4°C下保存； 完成中華鋳DNA的提取。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟1)從中華鋳身上刮取粘液的方向為順著從中華鋳的頭到尾的方向刮取。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟3)裂解液的配置為0.05M EDTA、5%SDS、0.01M Tris-Hcl、0.3M 乙酸鈉，所述蛋白酶 K 濃度為 20mg/ml。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟3)加入的裂解液和蛋白酶K的體積比為裂解液:蛋白酶K:離心后的粘液=40:2:15。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟3)把裂解液和蛋白酶K加入所述步驟2)離心后的粘液，56°C下水浴lh。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟2)、步驟4)、步驟5)和步驟6)中的離心條件均為溫度0-4°C，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10-20分鐘。
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，特別涉及一種無損傷提取中華鱘DNA的方法。所述方法包括獲取樣本、樣本的處理、裂解細(xì)胞、沉淀蛋白質(zhì)、沉淀DNA、洗滌DNA、獲取DNA。本發(fā)明建立了一套完整的提取中華鱘粘液的方法，本發(fā)明可以快速有效的提取中華鱘DNA，提取的DNA條帶清晰，無拖尾現(xiàn)象，說明提取的DNA質(zhì)量高，不收蛋白質(zhì)的污染，結(jié)果穩(wěn)定可靠。
【IPC分類】C12N15/10
【公開號】CN105400775
【申請?zhí)枴緾N201511013326
【發(fā)明人】胡亞成, 杜合軍, 劉雪清, 肖衎, 劉娟娟, 陳冬娟, 王彬忠, 趙珣
【申請人】中國長江三峽集團公司中華鱘研究所
【公開日】2016年3月16日
【申請日】2015年12月31日