一種自發(fā)永生化仔豬口腔黏膜上皮細(xì)胞系及其建立方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種自發(fā)永生化仔豬口腔黏膜上皮細(xì)胞系及其建立方法，利用剛出生未哺乳仔豬口腔黏膜上皮組織進(jìn)行原代培養(yǎng)、連續(xù)傳代培養(yǎng)，最終獲得一株純度高、穩(wěn)定性好的自發(fā)永生化仔豬口腔黏膜上皮細(xì)胞系。本發(fā)明獲得的自發(fā)永生化仔豬口腔黏膜上皮細(xì)胞系生長(zhǎng)迅速、性能穩(wěn)定，第110代的細(xì)胞仍保持著原代細(xì)胞的形態(tài)特征，核型分析表明細(xì)胞沒有發(fā)生突變。本發(fā)明構(gòu)建的永生化仔豬口腔黏膜上皮細(xì)胞系為連續(xù)傳代后自發(fā)形成，不存在外源基因的插入和基因突變，作為疫苗研發(fā)中的基質(zhì)細(xì)胞，沒有生物安全風(fēng)險(xiǎn)。本發(fā)明的細(xì)胞系可以為分子生物學(xué)和病毒學(xué)研究提供一個(gè)良好的細(xì)胞模型，也可用于豬源病毒疫苗的研發(fā)。
【專利說明】
一種自發(fā)永生化仔豬口腔黏膜上皮細(xì)胞系及其建立方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種自發(fā)永生化仔豬口腔黏膜上皮細(xì)胞系及其建立方法。
【背景技術(shù)】
[0002]自然條件下，病毒、細(xì)菌等病原體入侵宿主大都是通過口鼻途徑?？谇火つど掀ぜ?xì)胞作為動(dòng)物免疫系統(tǒng)的第一道防線，是病毒、細(xì)菌感染宿主遇到的最早的一類細(xì)胞。口腔黏膜上皮細(xì)胞表面表達(dá)多種模式識(shí)別受體，能夠識(shí)別大多數(shù)入侵病原表達(dá)的病原體相關(guān)分子模式，口腔黏膜免疫是機(jī)體天然免疫的重要組成部分。
[0003]口腔黏膜上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)存在很大的困難，傳代次數(shù)有限，細(xì)胞穩(wěn)定性、均一性很差，極大地限制了相關(guān)科學(xué)研究和應(yīng)用。目前國(guó)內(nèi)外尚未有自發(fā)永生化的口腔黏膜上皮細(xì)胞系報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種自發(fā)永生化仔豬口腔黏膜上皮細(xì)胞系及其建立方法，旨在解決口腔黏膜上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)存在的傳代次數(shù)有限，細(xì)胞穩(wěn)定性、均一性很差，極大地限制了其應(yīng)用的問題。
[0005]本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種自發(fā)永生化仔豬口腔黏膜上皮細(xì)胞系的建立方法，所述自發(fā)永生化仔豬口腔黏膜上皮細(xì)胞系的建立方法包括:
[0006]首先將未哺乳的仔豬麻醉后，心臟采血致死。酒精消毒，剪取面頰部位對(duì)應(yīng)的口腔上皮組織，無菌條件下PBS漂洗數(shù)遍，除去肉眼可見的非上皮組織，將口腔上皮組織剪成
0.2cm X I cm組織塊，移入離心管中，加入2.5mg/mL DispaseII溶液；
[0007]然后將組織剪成小塊，PBS漂洗，離心，接種于培養(yǎng)板，加入原代培養(yǎng)用生長(zhǎng)液，置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)情況；
[0008]原代細(xì)胞生長(zhǎng)至80 %?90 %融合時(shí)，吸去培養(yǎng)液，I3BS洗一遍，加入0.25 %胰酶消化，倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞變圓脫落時(shí)，加入含10%血清的培養(yǎng)基終止消化，消化后的細(xì)胞按1:2或1: 3的比例進(jìn)行傳代，置于37°C/5%C02條件下培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞再次生長(zhǎng)至80%?90 %融合時(shí)，繼續(xù)傳代培養(yǎng)，當(dāng)傳代細(xì)胞能夠度過衰老危機(jī)傳代超過50代時(shí)，獲得自發(fā)永生化的細(xì)胞系。
[0009]進(jìn)一步，所述PBS含600IU/ml雙抗，5yg/mL的兩性霉素B。
[0010]進(jìn)一步，所述加入2.5mg/mLDispaseII溶液，4°C消化 18?20h;
[0011 ] 所述PBS漂洗3遍，1000r/min離心5min，接種于96孔培養(yǎng)板，靜置lOmin。
[0012]進(jìn)一步，所述置于37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，24h觀察有無細(xì)菌污染，每3d換一次液，每日動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)增殖情況，培養(yǎng)7?12d。
[0013]本發(fā)明的另一目的在于提供一種所述自發(fā)永生化仔豬口腔黏膜上皮細(xì)胞系的建立方法建立的自發(fā)永生化仔豬口腔黏膜上皮細(xì)胞系。
[0014]本發(fā)明提供的自發(fā)永生化仔豬口腔黏膜上皮細(xì)胞系及其建立方法，利用剛出生尚未吃初乳的新生仔豬口腔黏膜上皮組織進(jìn)行原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)最終獲得一株純度高、穩(wěn)定性好的自發(fā)永生化仔豬口腔黏膜上皮細(xì)胞系。本發(fā)明獲得的自發(fā)永生化仔豬口腔黏膜上皮細(xì)胞系生長(zhǎng)迅速、性能穩(wěn)定，傳代110代以后的仍保持著原代細(xì)胞的形態(tài)特征，核型分析表明細(xì)胞沒有發(fā)生突變。本發(fā)明構(gòu)建的永生化仔豬口腔黏膜上皮細(xì)胞系為連續(xù)傳代后自發(fā)形成，不存在外源基因的插入和基因突變，作為疫苗研發(fā)中的基質(zhì)細(xì)胞，沒有生物安全風(fēng)險(xiǎn)。本發(fā)明的細(xì)胞系可以為分子生物學(xué)和病毒學(xué)研究提供一個(gè)良好的細(xì)胞模型，也可用于豬源病毒疫苗的研發(fā)。。本發(fā)明通過不斷傳代培養(yǎng)，最終獲得了一株自發(fā)永生化的仔豬口腔黏膜上皮細(xì)胞系；自發(fā)永生化的細(xì)胞系能夠?yàn)檠芯靠谔阋卟《?、豬水泡病病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒的入侵、復(fù)制、致病等機(jī)理提供一個(gè)可供選擇的細(xì)胞模型，并為相關(guān)病原疫苗的研發(fā)提供了基礎(chǔ)材料。
[0015]與現(xiàn)有技術(shù)先比，本發(fā)明有以下進(jìn)步:
[0016]1.本發(fā)明的自發(fā)永生化仔豬口腔黏膜上皮細(xì)胞系是保持著正常豬口腔黏膜上皮細(xì)胞的基本生物學(xué)特性，是研究口蹄疫病毒、豬水泡病病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒的入侵、復(fù)制、致病等機(jī)理的理想的細(xì)胞模型。
[0017]2.本發(fā)明自發(fā)永生化仔豬口腔黏膜上皮細(xì)胞是通過正常體細(xì)胞自發(fā)永生化獲得的，不是通過轉(zhuǎn)基因等細(xì)胞工程手段所得，在作為研發(fā)豬源病毒疫苗的基質(zhì)細(xì)胞，不存在生物安全隱患。
[0018]3.本發(fā)明的自發(fā)永生化仔豬口腔黏膜上皮細(xì)胞系，形態(tài)均一，生長(zhǎng)迅速，解決了原代豬口腔黏膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)難的問題。
【附圖說明】
[0019]圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的自發(fā)永生化仔豬口腔黏膜上皮細(xì)胞系的建立方法流程圖。
[0020]圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的組織塊法培養(yǎng)的原代仔豬口腔黏膜上皮細(xì)胞示意圖。
[0021]圖3是本發(fā)明實(shí)施例提供的永生化仔豬口腔黏膜上皮細(xì)胞系第100代示意圖。
[0022]圖4是本發(fā)明實(shí)施例提供的間接免疫熒光鑒定角蛋白表達(dá)示意圖。
[0023]圖5是本發(fā)明實(shí)施例提供的核型分析結(jié)果照相示意圖。
[0024]圖6是本發(fā)明實(shí)施例提供的核型分析結(jié)果染色體配對(duì)示意圖。
[0025]圖7是本發(fā)明實(shí)施例提供的第80代永生化仔豬口腔黏膜上皮細(xì)胞致瘤實(shí)驗(yàn)示意圖。
[0026]圖8是本發(fā)明實(shí)施例提供的Hela細(xì)胞致瘤實(shí)驗(yàn)示意圖。
[0027]圖9是本發(fā)明實(shí)施例提供的永生化仔豬口腔黏膜上皮細(xì)胞系第95代細(xì)胞周期分布示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0028]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0029]下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用原理作詳細(xì)的描述。
[0030]如圖1所示，本發(fā)明實(shí)施例的自發(fā)永生化仔豬口腔黏膜上皮細(xì)胞系的建立方法包括以下步驟:
[0031]SlOl:將未哺乳的仔豬麻醉后，心臟采血致死，酒精消毒，剪取面頰部位對(duì)應(yīng)的口腔上皮組織，無菌條件下PBS(含600IU/ml雙抗，5yg/mL的兩性霉素B)漂洗數(shù)遍，除去肉眼可見的非黏膜上皮組織，將口腔黏膜上皮組織剪成0.2cm X I cm組織塊，移入離心管中，加入2.5mg/mL DispaseII溶液，4°C消化18?20h;
[0032]S102:然后將組織剪成<lmm3的組織小塊，PBS漂洗3遍，1000r/min離心5min，接種于96孔培養(yǎng)板，靜置lOmin，小心加入原代培養(yǎng)用生長(zhǎng)液，置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，24h觀察有無細(xì)菌污染，每3d換一次液，每日動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)增殖情況，培養(yǎng)7?12d;
[0033]S103:原代細(xì)胞生長(zhǎng)至80 %?90 %融合時(shí)，吸去培養(yǎng)液，I3BS洗一遍，加入0.025 %胰酶消化，倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞變圓脫落時(shí)，加入含10%血清的培養(yǎng)基終止消化，消化后的細(xì)胞按1:2或1:3的比例進(jìn)行傳代，置于37°(:/5%0)2條件下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞再次生長(zhǎng)至80 %?90 %融合時(shí)，繼續(xù)傳代培養(yǎng)。
[0034]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用原理作進(jìn)一步的說明。
[0035]實(shí)施例1原代培養(yǎng)仔豬口腔黏膜上皮細(xì)胞
[0036]將未哺乳的仔豬麻醉后，心臟采血致死，酒精消毒，剪取面頰部位對(duì)應(yīng)的口腔上皮組織，無菌條件下PBS(含600IU/ml雙抗，5yg/mL的兩性霉素B)漂洗數(shù)遍，，除去肉眼可見的非黏膜上皮組織，將□腔黏膜上皮組織剪成0.2cm X I cm組織塊，移入離心管中，加入2.5mg/mL Dis pasell溶液，4°C消化18?20h，然后將組織剪成<Imm3的組織小塊，PBS漂洗3遍，1000r/min離心5min，接種于96孔培養(yǎng)板，靜置lOmin，小心加入原代培養(yǎng)用生長(zhǎng)液，置于370C,5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，24h觀察有無細(xì)菌污染，每3d換一次液，每日觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)情況，培養(yǎng)7?12d。原代培養(yǎng)的豬口腔黏膜上皮細(xì)胞見圖2，呈典型上皮樣細(xì)胞特征。
[0037]實(shí)施例2.傳代培養(yǎng)仔豬口腔黏膜上皮細(xì)胞
[0038]原代細(xì)胞生長(zhǎng)至80 %?90 %融合時(shí)，吸去培養(yǎng)液，I3BS洗一遍，加入0.25 %胰酶消化，倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞變圓脫落時(shí)，加入含10%血清的培養(yǎng)基終止消化，消化后的細(xì)胞按1:2或1:3的比例進(jìn)行傳代，置于37°(:/5%0)2條件下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞再次生長(zhǎng)至80%?90%融合時(shí)，用此方法繼續(xù)傳代培養(yǎng)。目前細(xì)胞已傳代超過100代(圖3)，細(xì)胞依然保持著正常上皮細(xì)胞的特征。
[0039]實(shí)施例3.間接免疫熒光法鑒定細(xì)胞類型
[0040]1.鋪板:在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板孔內(nèi)放置無菌的蓋玻片0.5cm X 0.6cm，將仔豬口腔黏膜上皮細(xì)胞用胰酶消化成單細(xì)胞，計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度至2X 15個(gè)/mL，每孔中接種0.5mL細(xì)胞懸液。
[0041 ] 2.固定:待細(xì)胞生長(zhǎng)至近融合狀態(tài)(低密度單層)時(shí)，用roS(0.01mol/L，pH 7.4)洗3遍，加入0.4g/L多聚甲醛磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)，細(xì)胞面朝上，室溫固定1min，用PBS洗滌3次，每次3min。
[0042]3.穿透:加入I %的Tri ton穿透液(PBS配制)，37 °C作用15min，用PBS洗滌3次，每次3min。
[0043]4.封閉:5%的脫脂奶粉PBS溶液，37°C，封閉lh。
[0044]5.孵育一抗:用去封閉液，加入1: 300倍稀釋的廣譜角蛋白抗體Ant1-panCytokeratin antibody [PCK-26] (Abcam，貨號(hào)ab6401)50yL于蓋玻片上，放入濕盒內(nèi)4°C過夜。同時(shí)滴加等量PBS溶液代替一抗作為陰性對(duì)照，用PBS洗滌3次，每次3min。
[0045]6.孵育二抗:棄去PBS，滴加1:100倍稀釋的FITC Goat anti Mouse IgG(H+L)，于37 °C孵育Ih。PBS洗滌3次，每次3min。
[0046]7.核染:用DAPI復(fù)染，37 °C、5min。然后立即在熒光顯微鏡下觀察，照相。
[0047]間接免疫熒光結(jié)果如圖4所示，細(xì)胞被綠色熒光標(biāo)記，說明仔豬口腔黏膜上皮細(xì)胞表達(dá)角蛋白，是上皮細(xì)胞來源。
[0048]實(shí)施例4.核型分析
[0049]1.在培養(yǎng)36h的永生化仔豬口腔黏膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞瓶中添加秋水仙素溶液，使終濃度為0.2yg/mL，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)5?6h;
[0050]2.倒掉細(xì)胞瓶中的培養(yǎng)基，加入2mL 0.25%的胰酶，顯微鏡下觀察細(xì)胞變圓脫壁后加入2mL含血清培養(yǎng)基終止消化；
[0051 ] 3.收集細(xì)胞于15mL離心管中，1000r/min離心1min;
[0052]4.加入37°C預(yù)熱的低滲液(0.075mol/L)5mL，吹打至均勻，37°C水浴15-20min，離心，1200r/min 1min，棄上清;
[0053]5.沿管壁緩慢加入固定液(甲醇:冰乙酸=3:1 )0.5-1.0mL，邊滴加邊震蕩均勻，靜置5min后離心棄上清；
[0054]6.加入3mL固定液，吹打均勻，靜置30min，離心棄上清;再次加入3mL固定液，吹打均勾并靜置30min ；
[0055]7.離心棄上清液，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量情況，加入I?2mL固定液，吹打細(xì)胞制成懸液，懸液呈微白色時(shí)為最佳；
[0056]8.用滴管吸取細(xì)胞懸液，高空滴在冰凍玻片(4°C )上，立即在酒精燈的火焰下過火幾次固定，室溫下放置，空氣干燥后，置-20°C保存?zhèn)溆茫?br>[0057]9.Giemsa染色lOmin，清水沖洗染液，用吹風(fēng)機(jī)吹干；
[0058]10.在分裂相區(qū)域滴加PBS后，鏡檢，照相，進(jìn)行核型分析。
[0059]正常豬體細(xì)胞有19對(duì)染色體。染色體核型分析結(jié)果顯示，永生化仔豬口腔黏膜上皮細(xì)胞含有19對(duì)38條染色體(圖5、圖6)，沒有發(fā)生染色體條數(shù)變異，明顯的XY基因型，與細(xì)胞取材來源于雄性小豬一致。
[0060]下面結(jié)合實(shí)驗(yàn)對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用效果作詳細(xì)的說明。
[0061 ] 細(xì)胞致瘤試驗(yàn)
[0062]動(dòng)物試驗(yàn)中使用Hela細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照，第80代自發(fā)永生化仔豬口腔黏膜上皮細(xì)胞為試驗(yàn)組進(jìn)行裸鼠致瘤試驗(yàn)。具體操作步驟如下:
[0063]1.將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞胰酶消化并計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為I X 16個(gè)/mL。
[0064]2.用一次性注射器將0.2mL的細(xì)胞懸液注射到裸鼠右側(cè)后腿臀部。
[0065]3.飼養(yǎng)裸鼠至肉眼可見瘤體。
[0066]4.繼續(xù)飼養(yǎng)I?2周，結(jié)束實(shí)驗(yàn)，采集數(shù)據(jù)。
[0067]飼養(yǎng)Sd后，Hela細(xì)胞對(duì)照組裸鼠接種部位有瘤體形成，而自發(fā)永生化仔豬口腔黏膜上皮細(xì)胞接種的裸鼠，臀部無瘤體形成。通過組織切片，可以看出，實(shí)驗(yàn)組組織仍保持著正常組織的紋理(圖7);對(duì)照組細(xì)胞成彌散樣分布，排列紊亂，可見大量核分裂相(圖8)。結(jié)果表明，自發(fā)永生化仔豬口腔黏膜上皮細(xì)胞系沒有致瘤性。
[0068]細(xì)胞周期分析
[0069]應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析自發(fā)永生化仔豬口腔黏膜上皮細(xì)胞系第95代的生長(zhǎng)周期。具體步驟如下:
[0070]1.將待測(cè)細(xì)胞樣本制成單細(xì)胞懸液，然后1000r/min離心5min，棄上清。
[0071]2.用4°C預(yù)冷的70%乙醇固定，4°C保存，至少固定18h。
[0072]3.調(diào)整細(xì)胞濃度為16個(gè)/mL，取ImL細(xì)胞懸液，用I3BS洗3次，細(xì)胞重懸于ImL PI染液(終濃度為50yg/mL)中，37°C孵育30min，進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。
[0073]細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果如圖9所示，細(xì)胞處于Gl期、S期、G2期的比例分別是67.96%、24.13%、7.91% d期直接反映增殖過程的本質(zhì)——具有一定時(shí)間跨度的大量合成細(xì)胞物質(zhì)以備緊接而至的細(xì)胞等分的顯著胞內(nèi)變化，排除人為的周期阻滯，S期所占比例越多說明細(xì)胞的增殖活性越好。由此可知S期所占24.13%的自發(fā)永生化細(xì)胞具有旺盛的分裂增殖能力。
[0074]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種自發(fā)永生化仔豬口腔黏膜上皮細(xì)胞系的建立方法，其特征在于，所述自發(fā)永生化仔豬口腔黏膜上皮細(xì)胞系的建立方法包括: 首先將未哺乳的仔豬麻醉后，心臟采血致死。酒精消毒，剪取面頰部位對(duì)應(yīng)的口腔上皮組織，無菌條件下PBS漂洗數(shù)遍，PBS含600IU/ml雙抗，5yg/mL的兩性霉素B;除去肉眼可見的非上皮組織，將口腔上皮組織剪成組織塊，移入離心管中，加入2.5mg/mL Dispase II溶液； 將表皮組織剪成小塊，PBS漂洗，離心，接種于培養(yǎng)板，加入原代培養(yǎng)用生長(zhǎng)液，置于370C,5% CO2條件下培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)情況； 原代細(xì)胞生長(zhǎng)至80 %?90 %融合時(shí)，吸去培養(yǎng)液，PBS洗一遍，加入0.25 %胰酶消化，倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞變圓脫落時(shí)，加入含10%血清的培養(yǎng)基終止消化，消化后的細(xì)胞按1: 2或1:3的比例進(jìn)行傳代，置于37 °C、5 % CO2條件下培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞再次生長(zhǎng)至80 %?90 %融合時(shí)，繼續(xù)傳代培養(yǎng)，當(dāng)傳代細(xì)胞能夠傳代超過50代時(shí)，獲得自發(fā)永生化的細(xì)胞系。2.如權(quán)利要求1所述的自發(fā)永生化仔豬口腔黏膜上皮細(xì)胞系的建立方法，其特征在于，所述PBS含600IU/ml雙抗，5yg/mL的兩性霉素B。3.如權(quán)利要求1所述的自發(fā)永生化仔豬口腔黏膜上皮細(xì)胞系的建立方法，其特征在于，所述加入2.5mg/mL Dispase II溶液，4°C消化18?20h; 所述PBS漂洗3遍，1000r/min離心5min，接種于96孔培養(yǎng)板，靜置1min。4.如權(quán)利要求1所述的自發(fā)永生化仔豬口腔黏膜上皮細(xì)胞系的建立方法，其特征在于，所述置于37 °C,5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，24h觀察有無細(xì)菌污染，每3d換一次液，每日動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)增殖情況，培養(yǎng)7-12d。5.一種如權(quán)利要求1?4任意一項(xiàng)所述自發(fā)永生化仔豬口腔黏膜上皮細(xì)胞系的建立方法建立的自發(fā)永生化仔豬口腔黏膜上皮細(xì)胞系。
【文檔編號(hào)】C12N5/071GK105838662SQ201610027035
【公開日】2016年8月10日
【申請(qǐng)日】2016年1月15日
【發(fā)明人】張彥明, 崔紅杰, 郭抗抗
【申請(qǐng)人】張彥明