一種菰黑粉菌單倍體菌株uemt3及其應(yīng)用
【專利摘要】一種菰黑粉菌單倍體菌株UEMT3及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。該菰黑粉菌（Ustilago esculenta）單倍體菌株UEMT3，保藏號(hào)為：CGMCC No.11842。茭白人工育種需要兩種性親和單倍體菌株的共同侵染，該菌株可以作為茭白人工育種的母體菌株，通過篩選得到其性親和的單倍體菌株后，通過人工接種方法即可以實(shí)現(xiàn)人工孕茭。同時(shí)該單倍體菌株可以進(jìn)行基因工程改造從而為接下來(lái)的茭白品種改良，如提高茭白的環(huán)境適應(yīng)性、控制結(jié)茭時(shí)間等茭白育種工作提供實(shí)施基礎(chǔ)材料。CGMCC No.1184220151207
【專利說(shuō)明】
一種菰黑粉菌單倍體菌株UEMT3及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種菰黑粉菌單倍體菌株UEMT3及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]菰黑粉菌屬于擔(dān)子菌亞門黑粉菌屬，是一種典型的二型態(tài)真菌，與玉米瘤黑粉菌近源。目前為止，茭白是其所知的唯一寄主，而茭白孕茭是該專一性寄生的菰黑粉菌與茭白植株互相作用的結(jié)果。至今，茭白的種植及保種育種還是采用茭墩分離篩選的方式，人力物力投入較大，而且菰黑粉菌存在多個(gè)生理小種，其可能混合存在于茭白植株中，造成茭白品種性狀不穩(wěn)定，退化明顯。因此采用人工接種方式是茭白育種的發(fā)展方向。
[0003]研究表明菰黑粉菌的兩個(gè)性親和單倍體混合接種可以使正常開花的野茭植株孕茭，即植株莖基部發(fā)生膨大并且不再抽穗開花，而非性親和單倍體菌株混合、雙核菌絲或冬孢子接種均無(wú)法使野茭植株孕茭(近源的玉米瘤黑粉菌研究進(jìn)展亦表明黑粉菌的侵染需要兩個(gè)性親和單倍體一起混合接種)，因此，菰黑粉菌性親和單倍體的獲得是保障茭白人工育種的前提。而自然界中菰黑粉菌以二倍體冬孢子或者雙核菌絲存在，沒有單倍體菌株。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于設(shè)計(jì)提供一種菰黑粉菌單倍體菌株UEMT3及其應(yīng)用的技術(shù)方案。
[0005]本發(fā)明提供的一種菰黑粉菌(UstiIagoesculenta)單倍體菌株UEMT3能夠促使菱白人工孕茭和茭白品種改良。該菌株于2015年12月07日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏號(hào)為CGMCC N0.11842。保藏單位地址為:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)。該菌株具有以下性質(zhì):
形態(tài)特征:短桿狀，成熟的孢子在20-25微米左右，單核無(wú)隔膜，進(jìn)行芽殖(圖2)，似酵母菌，但比酵母菌大。
[0006]培養(yǎng)特性:固體培養(yǎng)(YEPS固體培養(yǎng)基:2%蛋白胨，2%蔗糖，1%酵母粉，1.5%瓊脂糖)菌落呈乳黃色，表面光滑，較濕潤(rùn)，比細(xì)菌菌落更大更厚，挑取時(shí)比細(xì)菌粘稠，類似酵母菌落。液體培養(yǎng)(YEPS液體培養(yǎng)基:2%蛋白胨，2%蔗糖，1%酵母粉)后菌液均一，如細(xì)菌菌液。
生理代謝特性:該菌株偏好復(fù)合碳源(圖4)和復(fù)合氮源(圖5)作為其生長(zhǎng)的碳氮源，對(duì)有機(jī)碳源的喜好大于無(wú)機(jī)碳源，對(duì)乳糖和半乳糖的耐受性較差，對(duì)氨基酸的喜好程度大于無(wú)機(jī)氮源。
[0007]培養(yǎng)方法:可體外培養(yǎng)，適于在PDA或YEPS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行單菌落劃線培養(yǎng)，在液體培養(yǎng)中培養(yǎng)容易降低該菌活性。另外該菌不適宜繼代三次以上，不適宜7天以上的連續(xù)培養(yǎng)或低溫放置，否則易造成活性降低或菌體降解，適宜在-80度20%甘油保藏。
[0008]繁殖方法:芽殖。
[0009]本發(fā)明的有益效果:茭白人工育種需要兩種性親和單倍體菌株的共同侵染，該菌株可以作為茭白人工育種的母體菌株，通過篩選得到其性親和的單倍體菌株后，通過人工接種方法即可以實(shí)現(xiàn)人工孕茭。同時(shí)該單倍體菌株可以進(jìn)行基因工程改造從而為接下來(lái)的茭白品種改良，如提高茭白的環(huán)境適應(yīng)性、控制結(jié)茭時(shí)間等茭白育種工作提供實(shí)施基礎(chǔ)材料。
【附圖說(shuō)明】
[0010]圖1為UEMT3單倍體菌株獲得途徑示意圖；
圖2為核定位EGFP蛋白過表達(dá)的單倍體菌株芽殖形態(tài)圖；
圖3為單倍體菌株固體培養(yǎng)形態(tài)圖；
圖4為單倍體菌株在不同碳源培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)速率變化圖；
圖5為單倍體菌株在不同氮源培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)速率變化圖；
圖6為野茭植株人工接種菰黑粉菌后孕茭過程中茭白植株莖尖組織切片熒光顯微觀察圖，其中左邊圖為接種液中含有UEMT3菌株，右邊圖為接種液中不含UEMT3菌株；
圖7為菌種及交配型基因的PCR鑒定結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0011 ]以下結(jié)合實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。
[0012]實(shí)施例1:菌株篩選方法
I.收集冬孢子:從龍茭2號(hào)正常茭中(圖1A)直接挑取冬孢子。
[0013]2.冬孢子懸液:將挑取的冬孢子堆置于5 mL無(wú)菌水中，經(jīng)4層滅菌紗布過濾，獲得較純的冬孢子懸液，最后再用無(wú)菌水將冬孢子懸液稀釋成終濃度為13個(gè)孢子/mL。冬孢子形態(tài)如圖1B所示。
[0014]3.冬孢子培養(yǎng):取100 yL冬孢子懸液涂布于擔(dān)孢子分離培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)約60h，以肉眼可見細(xì)小分散的單菌落(圖1C)為標(biāo)準(zhǔn)。擔(dān)孢子分離培養(yǎng)基(I L)配方為= K2HPO4 Ig,MgSO4.7H20 0.5 g,FeSO4.7H20 0.0lg,KCl 0.5 g，葡萄糖 18 g, (NH4)2SO4 5.28 g，瓊脂10 go
[0015]4.單孢分離培養(yǎng):挑取單個(gè)肉眼可見的菌落至清水中，稀釋成13個(gè)孢子/mL，每次取I yL置于顯微操作儀下用毛細(xì)吸管吸取單個(gè)擔(dān)孢子(圖1D)，將分離出的擔(dān)孢子在YEPS(2%蛋白胨，2%蔗糖，1%酵母粉，1.5%瓊脂粉)固體培養(yǎng)基上，28 0C培養(yǎng)4 d。一個(gè)單菌落分離5個(gè)擔(dān)孢子，取3個(gè)以上單菌落。擔(dān)孢子培養(yǎng)后的菌落形態(tài)如圖1E所示。
[0016]5.顯微觀察:對(duì)擔(dān)孢子形成的菌落形態(tài)用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行顯微觀察，若菌落邊緣光滑(圖1Π則可初步鑒定為單倍體菌株，若邊緣產(chǎn)生了菌絲(圖1G)，則舍棄。
[0017]6.性親和菌株篩選:將初步鑒定的單倍體菌株編號(hào)(圖1E)，并用YEPS液體培養(yǎng)基分別稀釋成濃度為OD6qq為2.0的菌液。通過融合反應(yīng)實(shí)驗(yàn)對(duì)性親和菌株進(jìn)行初步鑒定。融合反應(yīng)實(shí)驗(yàn)如圖1H，具體過程為:將I號(hào)菌液先在YEPS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行點(diǎn)樣，每個(gè)點(diǎn)I uL，總點(diǎn)樣數(shù)為分離得到的單倍體菌株數(shù)。之后將剩余的各菌液各取I HL分別覆蓋于I號(hào)菌株菌點(diǎn)上方，標(biāo)記菌株號(hào)，于28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d。培養(yǎng)后對(duì)菌落形態(tài)進(jìn)行肉眼觀察，若可見白色氣生菌絲，則混合培養(yǎng)的兩個(gè)菌株可能為性親和單倍體菌株。如圖1H中所示，I號(hào)菌株與
2、3、4、8或11號(hào)菌株可能為性親和單倍體菌株。
[0018]7.PCR鑒定:通過對(duì)其交配型位點(diǎn)的克隆分析，發(fā)現(xiàn)菰黑粉菌中存在3個(gè)信息素受體pra基因，分別為pral、pra2和pra3，pral的核苷酸序列如SEQ ID NO: I所示，pra2的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示，pra3的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。眾所周知，一個(gè)單倍體菌株中只可能存在一個(gè)pra基因，而兩個(gè)性親和的單倍體菌株中pra基因不一樣。因此設(shè)計(jì)特異性引物用于進(jìn)一步對(duì)篩選得到的單倍體進(jìn)行PCR驗(yàn)證并進(jìn)一步確認(rèn)彼此間的性親和性。
[0019]以上述篩選到的12個(gè)單倍體菌株為例，我們提取各菌株的DNA，先通過引物ITSl和ITS4擴(kuò)增ITS序列并測(cè)序進(jìn)行菌種鑒定，PCR結(jié)果如圖7D所示，測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI比對(duì)后表明均屬于Ustilago esculenta。
[0020]接下來(lái)我們對(duì)各個(gè)菌株基因組DNA中的pral、pra2和pra3進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖7A，B，C所示，表明2、4號(hào)菌株的信息素受體基因?yàn)閜ra2，3、8、ll號(hào)菌株的信息素受體基因?yàn)閜ral，其余菌株的信息素受體基因?yàn)閜ra3，即我們篩選得到的菌株I信息素受體基因?yàn)榭赹3，與2、3、4、8或11號(hào)菌株的基因型不一樣，因此1號(hào)菌株與2、3、4、8或11號(hào)菌株為性親和單倍體菌株。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為:10XPCR緩沖液5 yL，dNTP 4 yL，上游引物I yL，下游引物I yL，DNA模板I yL，Taq酶0.5 yL，加ddH20至50 yLWCR擴(kuò)增程序?yàn)?4 °C 4 min；94 °C30 s，55 °C 30 s，72 V 2 min，30個(gè)循環(huán);72 V 10 min；4 V終止，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度均在600 bp上下，引物序列如下:
ITSl:5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’(核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示)， ITS4:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’(核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示)， pral-F:5’-ATCGGCATCCTCGCTCATTATG-3’(核苷酸序列如SEQ ID N0:6所示)， pral-R:5’-TGCATGCTTGATCTCCGTTGCG-3’(核苷酸序列如SEQ ID N0:7所示)， pra2-F:5’-ACAGCACGCTTCCCACCTTTTC-3’(核苷酸序列如SEQ ID N0:8所示)， pra2-R:5’-GACAAAGCAGCAGTGAACTGCC-3’(核苷酸序列如SEQ ID N0:9所示)， pra3-F:5’-CACAATTCCCATCACGGTGCTC-3’(核苷酸序列如SEQ ID NO: 10所示)， pra3-R:5’-GAGCGAGAGCACTGATGGAAAG-3’(核苷酸序列如SEQ ID NO: 11所示)。
[0021 ] 8.確定單倍體菌株:當(dāng)采用引物pra3-F和pra3-R擴(kuò)增后得到長(zhǎng)度在600 bp上下擴(kuò)增片段的菌株確定為單倍體菌株UEMT3。
[0022]該菌株具有以下性質(zhì):
形態(tài)特征:短桿狀，成熟的孢子在20-25微米左右，單核無(wú)隔膜，進(jìn)行芽殖(圖2)，似酵母菌，但比酵母菌大。
[0023]培養(yǎng)特性:固體培養(yǎng)(YEPS固體培養(yǎng)基:2%蛋白胨，2%蔗糖，1%酵母粉，1.5%瓊脂糖)菌落呈乳黃色，表面光滑，較濕潤(rùn)，比細(xì)菌菌落更大更厚，挑取時(shí)比細(xì)菌粘稠，類似酵母菌落，如圖3所示。液體培養(yǎng)(YEPS液體培養(yǎng)基:2%蛋白胨，2%蔗糖，1%酵母粉)后菌液均一，如細(xì)菌菌液。
生理代謝特性:該菌株偏好復(fù)合碳源(圖4)和復(fù)合氮源(圖5)作為其生長(zhǎng)的碳氮源，對(duì)有機(jī)碳源的喜好大于無(wú)機(jī)碳源，對(duì)乳糖和半乳糖的耐受性較差，對(duì)氨基酸的喜好程度大于無(wú)機(jī)氮源。
[0024]培養(yǎng)方法:可體外培養(yǎng)，適于在PDA或YEPS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行單菌落劃線培養(yǎng)，在液體培養(yǎng)中培養(yǎng)容易降低該菌活性。另外該菌不適宜繼代三次以上，不適宜7天以上的連續(xù)培養(yǎng)或低溫放置，否則易造成活性降低或菌體降解，適宜在-80度20%甘油保藏。
[0025]繁殖方法:芽殖。
[0026]
實(shí)施例2:人工孕茭試驗(yàn)
通過PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)將過表達(dá)EGFP綠色熒光蛋白的載體轉(zhuǎn)化菰黑粉菌(Ustilago esculenta)單倍體菌株UEMT3及其性親和菌株(選取實(shí)施例1中的2號(hào)、3號(hào))，使其過表達(dá)EGFP綠色熒光蛋白，通過熒光顯微鏡可檢測(cè)獲得的過表達(dá)菌株，成功過表達(dá)EGFP綠色熒光蛋白的菌株可在熒光顯微鏡下看到綠色熒光信號(hào)，如圖2所示。而后進(jìn)行人工接種實(shí)驗(yàn)，具體人工接種過程如下:
1)將兩個(gè)菰黑粉菌性親和單倍體菌株在YEPS液體培養(yǎng)基中28°C搖菌至OD6qq為1.0，離心收集菌體，用0.5 X YEPS液體培養(yǎng)基稀釋成終濃度為OD6qq為3.0的菌液，將兩菌液混合用于接菌；
2)將帶有3個(gè)以上完整節(jié)間的野茭管狀根進(jìn)行育苗，25°C溫室培養(yǎng)20天，以萌發(fā)有3個(gè)以上小苗期植株的管狀根為接種對(duì)象，并對(duì)苗基部進(jìn)行扎孔處理；
3)將步驟I)得到的混合菌液用注射器注射管狀根，直到有菌液溢出為止；
4)將處理后的接種苗進(jìn)行修剪，防止過多的蒸騰作用導(dǎo)致植物萎焉，然后浸置于剩余的混合菌液中，25°C溫室放置12 h;
5)將浸菌后的野茭苗轉(zhuǎn)移至帶營(yíng)養(yǎng)土的小盆中進(jìn)行過渡接種，待土充分濕潤(rùn)后將混合菌液倒入土中，25°C溫室培養(yǎng)7 d，完成接種；
6)將接種后的苗移植室外或培養(yǎng)箱中進(jìn)行露天栽培，接種栽培時(shí)間控制在3月份，施肥參考正常茭白種植標(biāo)準(zhǔn)。
[0027]結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)該菌株與其性親和菌株2號(hào)一起侵染野生茭白植株可以使野生茭白植株莖基部膨大形成茭白，而2號(hào)和3號(hào)性親和菌株混合(即缺失菌株UEMT3后)野生茭白植株莖基部不再膨大，即無(wú)法孕茭。對(duì)接種后兩種表型的茭白植株莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)取樣，進(jìn)行組織切片后在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn):莖基部膨大的植株中可以明顯觀察到帶有綠色熒光的菌絲，而未膨大的植株莖尖無(wú)綠色熒光信號(hào)(圖6)，表明該孕茭過程需要UEMT3的參與，即單倍體菌株UEMT3可應(yīng)用于人工孕茭。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種菰黑粉菌(UstiIago 68(:11161^3)單倍體菌株1^]\^3，保藏號(hào)為:CGMCCN0.11842。2.如權(quán)利要求1所述的一種菰黑粉菌(UstiIagoesculenta)單倍體菌株UEMT3在菱白人工孕茭中的應(yīng)用。3.如權(quán)利要求1所述的一種菰黑粉菌(UstiIagoesculenta)單倍體菌株UEMT3在菱白品種改良中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A01G1/00GK105838617SQ201610058047
【公開日】2016年8月10日
【申請(qǐng)日】2016年1月28日
【發(fā)明人】張雅芬, 俞曉平, 崔海峰, 葉子弘
【申請(qǐng)人】中國(guó)計(jì)量學(xué)院