化子到200mL的LB培養(yǎng)基中(100yg/mL Amp)37°C，200rpm振蕩培養(yǎng)至OD6OO為0.6時(shí)，加入終濃度為0.5mM異丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)劑，30 °C誘導(dǎo)培養(yǎng)8h，用高速冷凍離心機(jī)將培養(yǎng)液在4 °C下，以13，OOOrpm離心15min，收集菌體，去上清加入無菌水，超聲波破碎細(xì)胞，隨后70°C熱處理30min，用高速冷凍離心機(jī)將培養(yǎng)液在4°C下，以13，OOOrpm離心15min，上清即為重組極耐熱β_葡萄糖苷酶的純酶。
[0048]3.重組質(zhì)粒pET-28a_Arf的構(gòu)建
[0049]3.1Thermotoga thermarum DSM 5069的培養(yǎng)
[0050]Thermotoga thermarum DSM 5069購于DSMZ菌種保藏中心(www.dsmz.de)。編號為:DSM 5069ο其培養(yǎng)基配方為:5g/L可溶性淀粉，lg/L酵母粉，I.5g/L KH2PO4，4.2g/LNa2HPO4.12H20，3.4g/L NaCl ,lg/L MgSO4X 7H20，0.76g/L EDTA，lmL/L 微量元素，0.5g/LNa2S.9H20，0.5g/L Cysteine HCl，lmg/L刃天青，調(diào)pH為7.0，煮沸沖氮?dú)?，除去氧氣后，培養(yǎng)基在無氧條件下裝入?yún)捬跗繙缇?。微量元?1000 X )配方:FeCl3 2.0g/L; H3BO30.05g/L;ZnCl2 0.05g/L；CuCl2.2H20 0.03g/L；MnCl2.4H20 0.05g/L；(NH4)2MoO4 0.05g/L；AlK(SO4)2.12H20 0.05g/L。)用注射器按照0.5wt.%接種量接種，82°C靜止培養(yǎng)24h，收集細(xì)胞。
[0051 ] 3.2基因組DNA的提取
[0052](I)靜置培養(yǎng)Thermotoga thermarum DSM 5069 24h，取30mL菌液4，OOOg離心I Omin收集細(xì)胞。
[0053](2)用9.5mL TE緩沖液重懸菌體，加入0.5mL 1wt十二烷基硫酸鈉(SDS)和50μL蛋白酶K(20mg/mL)，混合均勻，37°C保溫Ih。
[0054](3)加入 1.8mL 5mol/L NaCl，1.5mL十六烷基三乙基溴化銨(CTAB)/NaCl，混勻，65°C 溫育 20min。
[0055](4)加入等體積氯仿/異戊醇，混勻，6，000g離心lOmin。
[0056](5)為防止剪切力造成基因組DNA斷裂，用粗口吸管將上清轉(zhuǎn)入另一離心管中，加入等體積酸/氯仿/異戊醇混勾，6 ,OOOg離心1min。
[0057](6)另一離心管中，加入0.6倍體積異丙醇，輕輕晃動至白色絲狀DNA沉淀清晰可見。
[0058](7)用吸管將DNA纏繞其上，在70vt.%酒精中清洗。
[0059](8)用無菌牙簽將DNA從吸管上刮下，轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中。
[0060](9)室溫下風(fēng)干，加500yL TE緩沖液溶解。
[0061 ] (10)取50yL用核酸蛋白檢測儀檢測DNA濃度。
[0062]3.3重組質(zhì)粒pET-20b-Arf的構(gòu)建
[0063]按照已知的Thermotoga thermarum DSM 5069極耐熱阿拉伯呋喃糖苷酶基因(WP013932416.1)設(shè)計(jì)引物:(SEQ ID NO:7)下劃線表示Nco I酶切位點(diǎn)；(SEQ ID N0:8)下劃線表示Xho I酶切位點(diǎn)，并去除終止密碼子；以提取的Thermotoga thermarum DSM 5069的基因組DNA為模板，用合成的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增的條件是94°C，3min;30次循環(huán)(94°C，30s; 58°C，30s; 72°C，lmin28s)； 72°C，1min;反應(yīng)停止，4°C保溫。通過凝膠回收試劑盒對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化。得到Thermotoga thermarum DSM 5069極耐熱阿拉伯呋喃糖苷酶基因。
[0064]得到Thermotoga thermarum DSM 5069極耐熱阿拉伯呋喃糖苷酶基因和pET_28a分別用Nco I和Xho I進(jìn)行雙酶切，并分別割膠回收，濃縮后16°C連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplOF’感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆，進(jìn)行序列分析;挑選序列正確的克隆提取質(zhì)粒，獲得含有極耐熱糖苷酶基因的重組質(zhì)粒pET-28a-Arf。
[0065]4.重組極耐熱阿拉伯呋喃糖苷酶的表達(dá)及純化
[0066]將重組質(zhì)粒pET-28a_Arf轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)宿主菌(Novagen)，在含有Kan(50yg/mL)的LB平板(LB培養(yǎng)基:胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 5g/L，瓊脂15g/L)上經(jīng)過37°C培養(yǎng)過夜，挑轉(zhuǎn)化子到200mL的LB培養(yǎng)基中(50yg/mL Kan)37°C，200rpm振蕩培養(yǎng)至OD6OO為0.6時(shí)，加入終濃度為0.0lmM異丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)劑，30 °C誘導(dǎo)培養(yǎng)8h，用高速冷凍離心機(jī)將培養(yǎng)液在4 °C下，以13，OOOrpm離心15min，收集菌體，去上清加入無菌水，超聲波破碎細(xì)胞，隨后70°C熱處理30min，用高速冷凍離心機(jī)將培養(yǎng)液在4°C下，以13，OOOrpm離心15min，上清即為重組極耐熱阿拉伯呋喃糖苷酶的純酶。
[0067]5.重組酶協(xié)同轉(zhuǎn)化人參皂苷Rbl、Rb2、Rc生成20(S)_Rg3的條件
[0068]5.1酶活測定
[0069]反應(yīng)體系200yL，10yL20mmol/L pNPG中加入10yL 100mmol/L檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH 5.0)和85yL水，先在900C孵育2min，再加入5yL酶液(稀釋到合適的倍數(shù)，使0D4Q5的值在0.2?1.0之間)反應(yīng)lOmin。反應(yīng)結(jié)束后立刻加入600yL IM的Na2CO3，用分光光度計(jì)在405nm下測定其吸光值。酶活力單位(U)定義為:在測定條件下，每分鐘產(chǎn)生Ιμπιο? PNP所用的酶量為I個(gè)酶活力單位。
[0070]反應(yīng)體系200yL，10yL20mmol/L pNPArf^WAlOOyL 100mmol/L檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH 5.0)和85yL水，先在950C孵育2min，再加入5yL酶液(稀釋到合適的倍數(shù)，使0D4Q5的值在0.2?1.0之間)反應(yīng)lOmin。反應(yīng)結(jié)束后立刻加入600yL IM的Na2CO3，用分光光度計(jì)在405nm下測定其吸光值。酶活力單位(U)定義為:在測定條件下，每分鐘產(chǎn)生Ιμπιο? PNP所用的酶量為I個(gè)酶活力單位。
[0071]5.2最適反應(yīng)溫度的測定
[0072]在70-90°C范圍內(nèi)，每隔5°C，分別測定酶活。緩沖為50mmol/L檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，PH 5.0，發(fā)現(xiàn)兩種極耐熱糖苷酶的最適反應(yīng)溫度為85°C (圖2)。
[0073]5.3最適反應(yīng)pH的測定
[0074]在不同的PH(3.5-7.0，50mmol/L檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液)條件下，85°C分別測定酶活，發(fā)現(xiàn)兩種極耐熱糖苷酶的最適反應(yīng)PH為5.0(圖3)。
[0075]6.協(xié)同轉(zhuǎn)化人參皂苷Rbl、Rb2、Rc生成人參皂苷20(S)_Rg3
[0076]人參皂苷Rbl、Rb2、Rc的濃度均為lg/L，轉(zhuǎn)化條件為85°C，pH 5.0，50mmol/L檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，不同的時(shí)間點(diǎn)(O，5，1，20，30，40，50，60min)分別取樣，通過HPLC進(jìn)行檢測O結(jié)果發(fā)現(xiàn)β-葡萄糖苷酶(0.15U)和阿拉伯呋喃糖苷酶(0.6U)協(xié)同作用在60min內(nèi)可以將人參皂苷此1、此2、1^轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷20(3)-1^3，摩爾得率為97.3%(圖4)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種酶法制備稀有人參皂苷20(S)-Rg3的方法，其特征在于利用來源于ThermotogapetrophiIa的β-葡萄糖苷酶和Thermotoga thermarum DSM 5069的阿拉伯呋喃糖苷酶，降解人參皂苷Rbl、Rb2和Re生產(chǎn)20(S)-Rg3。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種酶法制備稀有人參皂苷20(S)-Rg3的方法，其特征在于所述β-葡萄糖苷酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，氨基酸序列如SEQ ID Ν0:2所示。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種酶法制備稀有人參皂苷20(S)-Rg3的方法，其特征在于所述阿拉伯呋喃糖苷酶的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示，氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種酶法制備稀有人參皂苷20(S)-Rg3的方法，其特征在于所述β-葡萄糖苷酶是通過重組表達(dá)制備的，步驟為: (1)以提取的ThermotogapetrophiIa基因組DNA為模板，用具有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列為上游引物和具有SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列為下游引物，PCR擴(kuò)增得到β-葡萄糖苷酶的DNA分子； (2)將β-葡萄糖苷酶的DNA分子和pET-20b分別用NdeI和Xho I進(jìn)行雙酶切，連接并轉(zhuǎn)化得到含有β-葡萄糖苷酶的DNA分子的重組質(zhì)粒； (3)將上述獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主Ε.coliBL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)β-葡萄糖苷酶表達(dá)，收集菌體，破碎細(xì)胞，70 0C熱處理30分鐘，獲得純化的β_葡萄糖苷酶。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種酶法制備稀有人參皂苷20(S)-Rg3的方法，其特征在于所述阿拉伯呋喃糖苷酶是通過重組表達(dá)制備的，步驟為: (1)以提取的Thermotogathermarum DSM 5069的基因組DNA為模板，用具有SEQ IDN0:7所示的核苷酸序列為上游引物和具有SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列為下游引物，PCR擴(kuò)增得到阿拉伯呋喃糖苷酶的DNA分子； (2)將阿拉伯呋喃糖苷酶的DNA分子和pET-28a分別用NcoI和Xho I進(jìn)行雙酶切，連接并轉(zhuǎn)化得到含有阿拉伯呋喃糖苷的DNA分子的重組質(zhì)粒； (3)將上述獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主E.coliBL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)阿拉伯呋喃糖苷表達(dá)，收集菌體，破碎細(xì)胞，70 0C熱處理30分鐘，離心獲阿拉伯呋喃糖苷。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種酶法制備稀有人參皂苷20(S)-Rg3的方法，其特征在于降解條件為:Rbl、Rb2、Rc各Ig/L，i3-葡萄糖苷酶0.15U，阿拉伯呋喃糖苷酶0.6U，pH 5.0，85°C條件下，降解lh，最終可以將人參皂苷Rbl、Rb2、Rc轉(zhuǎn)化為人參皂苷20(S)-Rg3，摩爾得率為.97.3%。
【專利摘要】一種酶法制備稀有人參皂苷20(S)-Rg3的方法，利用來源于Thermotoga petrophila的β-葡萄糖苷酶和Thermotoga thermarum DSM 5069的阿拉伯呋喃糖苷酶，降解人參皂苷Rb1、Rb2和Rc生產(chǎn)20(S)-Rg3。本發(fā)明可以提高資源利用率和降低人參皂苷原料的提取成本，本發(fā)明中所述的β-葡萄糖苷酶和阿拉伯呋喃糖苷酶能在1h內(nèi)幾乎將人參皂苷Rb1、Rb2和Rc完全轉(zhuǎn)化為20(S)-Rg3。
【IPC分類】C12N9/24, C12N15/70, C12N9/42, C12N15/66, C12P33/06, C12P33/20
【公開號】CN105695553
【申請?zhí)枴緾N201610219176
【發(fā)明人】趙林果, 趙東霞, 解靜聰, 裴建軍, 李琦, 房仙穎
【申請人】南京林業(yè)大學(xué)
【公開日】2016年6月22日
【申請日】2016年4月8日