一種破囊壺菌的分離培養(yǎng)基及分離純化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種破囊壺菌的分離培養(yǎng)基及其分離純化方法。
【背景技術(shù)】
[0002]破囊壺菌(Thraustochytrids)是一類(lèi)異養(yǎng)的類(lèi)真菌海洋原生生物，現(xiàn)被分類(lèi)至假菌界(Chromista)或管毛生物界(Straminipi Ia)、不等鞭毛類(lèi)(Heterokonta)、網(wǎng)粘菌綱(Labyrinthulomycetes或Labyrinthulomycota)、破囊壺菌目(Thraustochytriales)、破囊壺菌科(Thraustochytriaceae)
[0003]破囊壺菌在各類(lèi)海洋生態(tài)系統(tǒng)中廣泛存在，如近岸紅樹(shù)林系統(tǒng)、珊瑚礁、鹽沼、近海水域、深海水域以及底泥環(huán)境中。作為一類(lèi)腐食性的微生物，破囊壺菌對(duì)于整個(gè)海洋生態(tài)系統(tǒng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)循環(huán)意義重大，對(duì)于維持海洋生態(tài)系統(tǒng)的正常生態(tài)功能具有重要貢獻(xiàn)。傳統(tǒng)的生態(tài)學(xué)研究認(rèn)為，海洋細(xì)菌(包括真細(xì)菌和古細(xì)菌)和海洋真菌是海洋生態(tài)系統(tǒng)中的主要分解者，在有機(jī)碎肩的降解和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)循環(huán)方面充當(dāng)了重要的角色。然而，近年來(lái)的研究資料表明，破囊壺菌在海水中的豐度可處于13到16的水平，在個(gè)別水域中破囊壺菌的生物量甚至?xí)哂诩?xì)菌。有研究發(fā)現(xiàn)，破囊壺菌在赤道印度洋海域水體中的生物量可以高達(dá)總生物量(破囊壺菌和細(xì)菌生物量總和)的99.4%。因此，破囊壺菌在對(duì)海洋碳庫(kù)貢獻(xiàn)顯著，在海洋碳循環(huán)系統(tǒng)中具有重要作用。而除了在海洋水體中豐度較高外，破囊壺菌在底泥中的細(xì)胞密度也很高。此外，也有報(bào)道顯示，浮游植物腐殖質(zhì)中破囊壺菌的生物量也經(jīng)常會(huì)高于細(xì)菌的生物量。破囊壺菌在不同海洋生態(tài)系統(tǒng)中的高生物量表明，破囊壺菌具有重要的生理生態(tài)功能，可能在不同生態(tài)系統(tǒng)中都占據(jù)著特定的生態(tài)位，但針對(duì)可培養(yǎng)破囊壺菌的培養(yǎng)方法及培養(yǎng)基組成的研究并不多。
[0004]在破囊壺菌的應(yīng)用研究方面，大家發(fā)現(xiàn)破囊壺菌細(xì)胞內(nèi)的脂肪酸含量高，可以達(dá)到生物質(zhì)含量的50%以上。其脂肪酸的主要成分為飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸。其中，飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸是生物柴油的主要組成成分。此外，破囊壺菌還可以合成胞外多糖、胞外酶及類(lèi)胡蘿卜素等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種破囊壺菌的分離培養(yǎng)基。
[0006]本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種破囊壺菌的分離純化方法。
[0007]本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供另一種破囊壺菌的分離純化方法。
[0008]本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下:
[0009]—種破囊壺菌的分離培養(yǎng)基，用下述方法制成:稱(chēng)取葡萄糖2g、酵母提取物lg、蛋白胨lg、玉米楽lg、谷氨酸鈉lg、瓊脂20g、人工海鹽33g于錐形瓶中，加入995ml超純水并攪拌均勻，115°C滅菌21分鐘;無(wú)菌條件下，將溫度降至50 ±5°C，加入5ml現(xiàn)配制的經(jīng)0.22um濾膜過(guò)濾的抗生素混合液，搖勻，倒平板，即得破囊壺菌的分離培養(yǎng)基;所述抗生素混合液是用下述方法制成:稱(chēng)取氨節(jié)西林0.5-1 g，鏈霉素0.5-1.5g，制霉菌素5-20mg，加超純水至5ml，溶解并搖勻至溶液澄清，得抗生素混合液。
[0010]一種破囊壺菌的分離純化方法，包括如下步驟:
[0011 ]用滅過(guò)菌的剪刀將潮間帶紅樹(shù)植物腐敗落葉剪成直徑0.5-1.5cm碎片，用滅菌海水沖洗2-3遍，貼于權(quán)利要求1的破囊壺菌的分離培養(yǎng)基上，于28± TC培養(yǎng)，培養(yǎng)3天后，顯微觀察破囊壺菌形態(tài)，將顯微觀察其形態(tài)為破囊壺菌的單菌落，用接種環(huán)將破囊壺菌單菌落挑至新的破囊壺菌的分離培養(yǎng)基上劃線純化培養(yǎng);長(zhǎng)出單菌落后顯微觀察其形態(tài);劃線純化培養(yǎng)3-4次，得到純培養(yǎng)的破囊壺菌單菌落。
[0012]另一種破囊壺菌的分離純化方法，包括如下步驟:
[0013]采集20ml潮間帶紅樹(shù)林地區(qū)海水樣品于培養(yǎng)皿中，撒0.5_lg松花粉，搖勻，于28土TC培養(yǎng)1-2天，用接種環(huán)挑取花粉粒劃線于權(quán)利要求1的破囊壺菌的分離培養(yǎng)基上，于28±I °C培養(yǎng)，培養(yǎng)3-10天，顯微觀察破囊壺菌形態(tài)，將顯微觀察其形態(tài)為破囊壺菌的單菌落，用接種環(huán)將破囊壺菌單菌落挑至新的破囊壺菌的分離培養(yǎng)基上劃線純化培養(yǎng);長(zhǎng)出單菌落后顯微觀察其形態(tài);劃線純化培養(yǎng)3-4次，得到純培養(yǎng)的破囊壺菌單菌落。
[0014]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn):
[0015]利用本發(fā)明的破囊壺菌的分離培養(yǎng)基能方便地從潮間帶紅樹(shù)植物腐敗落葉或潮間帶紅樹(shù)林地區(qū)海水樣品中分離出破囊壺菌，培養(yǎng)基成本低，分離操作簡(jiǎn)便。
【附圖說(shuō)明】
[0016]圖1為實(shí)施例4分離出來(lái)的破囊壺菌的顯微形態(tài)。
[0017]圖2為實(shí)施例5分離出來(lái)的破囊壺菌的顯微形態(tài)。
[0018]圖3為實(shí)施例6分離出來(lái)的破囊壺菌的顯微形態(tài)。
[0019]圖4為實(shí)施例7分離出來(lái)的破囊壺菌的顯微形態(tài)。
[0020]圖5為實(shí)施例8分離出來(lái)的破囊壺菌的顯微形態(tài)。
[0021]圖6為實(shí)施例9分離出來(lái)的破囊壺菌的顯微形態(tài)。
【具體實(shí)施方式】
[0022]本發(fā)明使用的人工海鹽為法國(guó)紅十字公司生產(chǎn)的小丑鹽。但并不對(duì)本發(fā)明作任何限制。
[0023]下面通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0024]實(shí)施例1
[0025]一種破囊壺菌的分離培養(yǎng)基，用下述方法制成:稱(chēng)取葡萄糖2g、酵母提取物lg、蛋白胨lg、玉米楽lg、谷氨酸鈉lg、瓊脂20g、人工海鹽33g于錐形瓶中，加入995ml超純水并攪拌均勻，115°C滅菌21分鐘;無(wú)菌條件下，將溫度降至50°C，加入5ml現(xiàn)配制的經(jīng)0.22um濾膜過(guò)濾的抗生素混合液，搖勻，倒平板，即得破囊壺菌的分離培養(yǎng)基;所述抗生素混合液是用下述方法制成:稱(chēng)取氨節(jié)西林0.5g，鏈霉素0.75g，制霉菌素1mg，加超純水至5ml，溶解并搖勻至溶液澄清，得抗生素混合液。
[0026]實(shí)施例2
[0027]一種破囊壺菌的分離培養(yǎng)基，用下述方法制成:稱(chēng)取葡萄糖2g、酵母提取物lg、蛋白胨lg、玉米楽lg、谷氨酸鈉lg、瓊脂20g、人工海鹽33g于錐形瓶中，加入995ml超純水并攪拌均勻，115°C滅菌21分鐘;無(wú)菌條件下，將溫度降至45°C，加入5ml現(xiàn)配制的經(jīng)0.22um濾膜過(guò)濾的抗生素混合液，搖勻，倒平板，即得破囊壺菌的分離培養(yǎng)基;所述抗生素混合液是用下述方法制成:稱(chēng)取氨節(jié)西林0.5g，鏈霉素0.5g，制霉菌素5mg，加超純水至5ml，溶解并搖勾至溶液澄清，得抗生素混合液。
[0028]實(shí)施例3
[0029]一種破囊壺菌的分離培養(yǎng)基，用下述方法制成:稱(chēng)取葡萄糖2g、酵母提取物lg、蛋白胨lg、玉米楽lg、谷氨酸鈉lg、瓊脂20g、人工海鹽33g于錐形瓶中，加入995ml超純水并攪拌均勻，115°C滅菌21分鐘;無(wú)菌條件下，將溫度降至55°C，加入5ml現(xiàn)配制的經(jīng)0.22um濾膜過(guò)濾的抗生素混合液，搖勻，倒平板，即得破囊壺菌的分離培養(yǎng)基;所述抗生素混合液是