一種細(xì)胞培養(yǎng)用微載體及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種細(xì)胞培養(yǎng)用微載體及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng)技術(shù)是當(dāng)前生物制藥行業(yè)貼壁依賴(lài)性細(xì)胞培養(yǎng)的領(lǐng)先技術(shù)。微載體是細(xì)胞培養(yǎng)中所使用的一類(lèi)無(wú)毒性、非剛性、密度均一、透明的小顆粒。能使貼壁依賴(lài)性細(xì)胞貼附在顆粒表面進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，從而增加細(xì)胞貼附生長(zhǎng)的面積，有利于細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)和收集。
[0003]自1967年Van Wezel第一個(gè)用DEAE-Sephadex A 50作為貼壁細(xì)胞培養(yǎng)用微載體以來(lái)，研究報(bào)道的細(xì)胞培養(yǎng)用微載體已有十多種，包括葡聚糖微載體、聚賴(lài)氨酸液體微載體、大孔明膠微載體、纖維素微載體、殼聚糖微載體、甲殼素微載體、聚苯乙烯微載體、聚氨酯泡沫微載體、藻酸鹽凝膠微載體以及磁性微載體等。我國(guó)目前使用的商品化微載體主要有:如GE公司的Cytodex 1、Cytodex I1、Cytodex III和Thermo公司的Cytopore、Cytoline、B1silon、Cultispher G等，均為進(jìn)口產(chǎn)品，但是價(jià)格昂貴，目前市場(chǎng)價(jià)已達(dá)每公斤3?10萬(wàn)元人民幣，還出現(xiàn)供不應(yīng)求的現(xiàn)象，而我國(guó)國(guó)產(chǎn)的微載體大多數(shù)尚在研制之中，或者生產(chǎn)規(guī)模較小，難以工業(yè)化生產(chǎn)，不能滿(mǎn)足我國(guó)生物制藥領(lǐng)域疫苗、重組藥物蛋白、單克隆抗體、細(xì)胞因子及其受體等醫(yī)用生物制品生產(chǎn)的需要，是限制我國(guó)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)從轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞培養(yǎng)工藝向生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng)工藝轉(zhuǎn)型的技術(shù)瓶頸之一。
[0004]目前，在發(fā)達(dá)國(guó)家，生物制藥行業(yè)貼壁依賴(lài)型動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工藝已普遍采用生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng)工藝，幾千升、上萬(wàn)升的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器已用于抗體或人用及獸用疫苗的生產(chǎn)，微載體細(xì)胞培養(yǎng)的規(guī)模已達(dá)到6000L以上。而我國(guó)絕大多數(shù)疫苗類(lèi)制藥行業(yè)仍然沿用傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶(滾瓶)培養(yǎng)工藝。該工藝勞動(dòng)強(qiáng)度大，細(xì)胞產(chǎn)量低，產(chǎn)品批向差異大，且容易造成污染，耗時(shí)耗力，導(dǎo)致我國(guó)絕大多數(shù)制藥企業(yè)的生物醫(yī)藥產(chǎn)品生產(chǎn)成本高，產(chǎn)值低，無(wú)法與國(guó)外產(chǎn)品競(jìng)爭(zhēng)。要提高產(chǎn)品競(jìng)爭(zhēng)力，只有采用生物反應(yīng)器微載體大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)。
[0005]因此，開(kāi)發(fā)適合于我國(guó)生物醫(yī)藥領(lǐng)域多種動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)用的微載體，具有廣泛的應(yīng)用前景，對(duì)促進(jìn)我國(guó)生物反應(yīng)器微載體大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展具有重要的歷史意義。
[0006]淀粉是一種廉價(jià)、易得、綠色的多糖生物材料，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、紡織等行業(yè)。淀粉結(jié)構(gòu)中的大量羥基基團(tuán)為淀粉化學(xué)改性提供了良好載體，已成為最具發(fā)展?jié)摿蛻?yīng)用前景的新型高分子材料之一。以淀粉為原料制備的淀粉微載體，有微孔結(jié)構(gòu)、表面積較大且富含羥基等易接近的活性基團(tuán)，因而可以有效吸附自由組分，成為細(xì)胞能夠貼壁生長(zhǎng)的良好原材料，目前，淀粉微載體尚未見(jiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明提供了一種細(xì)胞培養(yǎng)用微載體及其制備方法和應(yīng)用。該制備方法具有以下特點(diǎn):采用普通的食用淀粉，原料無(wú)毒性，采取乳化成球常溫下交聯(lián)固化，DEAE再次偶聯(lián)修飾，整個(gè)制備過(guò)程簡(jiǎn)單易行，方法可控，成本低廉，易于形成工業(yè)化生產(chǎn)，使淀粉微載體能夠在攪拌狀態(tài)下懸浮培養(yǎng)，適合于多種貼壁細(xì)胞大規(guī)模懸浮培養(yǎng)。
[0008]本發(fā)明提供一種細(xì)胞培養(yǎng)用微載體的制備方法，步驟如下:
(1)首先配制糊化的淀粉堿溶液:將一定量的淀粉溶解于純水中，攪拌加熱至糊化，再加入一定量的NaOH溶液，攪拌冷卻形成均一穩(wěn)定的水相溶液；
(2)油水相混合制球:將無(wú)毒高密度油、異辛烷、分散劑和一定量的乳化劑混合攪拌，形成均一的油相溶液后，緩慢加入水相溶液，攪拌，形成均一穩(wěn)定的混合相；
(3)交聯(lián)固化成球:再將交聯(lián)劑緩慢加入到混合相中，常溫下攪拌交聯(lián)反應(yīng)一定時(shí)間；
(4)除油洗滌:除去上層的油乳液，將固形物用表面活性劑進(jìn)行除油，再依次用不含Ca2+、Mg2+的PBS緩沖液及純水洗滌，抽濾得到濕微球；
(5)偶聯(lián)DEAE-HCl:稱(chēng)取一定量的濕微球，加入一定濃度的NaOH溶液攪拌，再加入一定濃度的DEAE-HCl溶液，攪拌偶聯(lián)反應(yīng)一定時(shí)間；
(6)洗滌:依次用不含Ca2+、Mg2+的PBS緩沖液及純水洗滌，得到細(xì)胞培養(yǎng)用微載體；
作為優(yōu)選，步驟(6)后還包括將得到的微載體保存在體積百分濃度為30%的乙醇溶液中的步驟。
[0009]配制淀粉堿溶液的目的是加熱使淀粉糊化，分子間的氫鍵斷開(kāi)，帶電荷才能均勻分布在溶液中，使其成為均一的膠體溶液；
油相中異辛烷的存在，會(huì)降低淀粉溶液在油相中的溶解度，并且能夠完全乳化成圓滴狀，使其能夠固化成球；
DEAE (二乙胺基乙基，diethylaminoethyl )是一種弱堿性的叔胺基團(tuán)，中心N原子帶有正電荷，具有離子交換功能，同時(shí)也可以使細(xì)胞貼附在微載體表面;偶聯(lián)DEAE-HCl后，貼壁細(xì)胞可以完全貼附在淀粉微載體表面，正常生長(zhǎng)。
[0010]將微載體保存在體積百分濃度為30%的乙醇溶液中的效果為:能夠保持微載體的外觀，同時(shí)抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，保持微載體的潔凈。
[0011]優(yōu)選地，步驟(I)中，所述淀粉為木薯淀粉、馬鈴薯淀粉、大豆淀粉、玉米淀粉中的一個(gè)或者任意兩者的組合；
作為優(yōu)選，所述NaOH溶液的濃度為0.5?2mol/L;
作為優(yōu)選，所述水相溶液中，淀粉的質(zhì)量體積百分比為0.1%?15%。
[0012]在步驟(I)中，各優(yōu)選條件的效果為:水相溶液均一透明，濃稠度適合，使其能夠完全分散于油相溶液，便于成球。
[0013]優(yōu)選地，步驟(2)中，所述無(wú)毒高密度油為礦物油或植物油；
作為優(yōu)選，所述無(wú)毒高密度油為液體石蠟、機(jī)油、汽油、硅油、花生油、玉米油或大豆油； 作為優(yōu)選，所述水相和油相的體積比為1:1?10;
作為優(yōu)選，所述的乳化劑和分散劑為Span-20、Span-40、Span-60、Span-80、Tween-20、Tween-40、Tween-60、Tween-80中的一種或者任意兩者的組合；
作為優(yōu)選，所述油相中乳化劑和分散劑的體積濃度為0.1%?5%。
[0014]在步驟(2)中，各優(yōu)選條件的效果為:油乳液均一穩(wěn)定，能夠使淀粉水相溶液穩(wěn)定分散于油相溶液中，乳化成球。
[0015]優(yōu)選地，步驟(3)中，所述的交聯(lián)劑為戊二醛、聚乙二醇縮水甘油醚、聚丙二醇二縮水甘油醚、馬來(lái)酸酐、戊二酸酐、丁二酸酐、氮丙啶中的一種；
作為優(yōu)選，所述的交聯(lián)劑用量為水相溶液體積的3%?20% ；
作為進(jìn)一步優(yōu)選，所述的交聯(lián)劑用量為水相溶液體積的8%?12% ；
作為優(yōu)選，所述的交聯(lián)攪拌速度為200?lOOOrpm，反應(yīng)時(shí)間為2?10小時(shí)；
作為進(jìn)一步優(yōu)選，所述的交聯(lián)攪拌速度為400?700rpm，反應(yīng)時(shí)間為4?8小時(shí)。
[0016]在步驟(3)中，各優(yōu)選條件的效果為:交聯(lián)劑與水相溶液完全反應(yīng)，固化效果好，微球剛性及耐壓程度高，并且該攪拌速度條件下，成球的粒徑90%以上都在100?300μπι，可應(yīng)用于微載培養(yǎng)；
優(yōu)選地，步驟(4)中，所述的表面活性劑的質(zhì)量濃度為I?5%;
作為優(yōu)選，所述表面活性劑為 Tween-20、Tween-40、Tween-60、Tween-80、TRIT0N-100 或OP-1O中的一種。
[0017]在步驟(4)中，各優(yōu)選條件的效果為:表面活性劑具有特有的界面活性，使疏水基和親水基之間有一定的平衡，同時(shí)附降低水的表面張力，輔助乳化作用，使水相溶液能夠完全乳化，形成均一穩(wěn)定的乳化液。當(dāng)表面活性劑選擇以上幾種中的一種時(shí)，乳化效果最佳。
[0018]優(yōu)選地，步驟(5)中，所述的濕微球的質(zhì)量、NaOH溶液的體積和DEAE-HCl溶液的體積三者之間的比值為1:1?4:1?4;
作為優(yōu)選，所述NaOH溶液的濃度為0.5?4mo I /L，DEAE-HCl的濃度為I?5 mo I /L;
作為優(yōu)選，所述偶聯(lián)反應(yīng)的速度為400?800rpm，偶聯(lián)溫度60?80 °C，交聯(lián)時(shí)間為2?6小時(shí)。
[0019]在步驟(5)所述條件下，淀粉微球表面活性羥基都能與DEAE發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)，DEAE可以完全均與偶聯(lián)在淀粉微球表面，而且偶聯(lián)的DEAE濃度不會(huì)太高或者太低，便于細(xì)胞貼附在微載體表面正常生長(zhǎng)。
[0020]優(yōu)選地，所述步驟(6)后還將得到的微載體篩分的步驟，取粒徑在100?400μπι的微載體；
作為優(yōu)選，取粒徑在200?300μπι的微載體；
作為進(jìn)一步優(yōu)選，在篩分后還包括滅菌的步驟;所述滅菌是將微載體洗凈之后，用高壓蒸汽滅菌或用75%酒精浸泡滅菌，或