一種用間歇光兩步法培養(yǎng)洛氏角毛藻的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域，尤其涉及一種用間歇光兩步法培養(yǎng)洛氏角毛藻的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]洛氏角毛藻隸屬硅藻門、中心綱、盒形藻目、角毛藻科、角毛藻屬，是一種小型海洋浮游硅藻，細(xì)胞小，壁薄，單個(gè)生活。在10_39°C環(huán)境下均能生長繁殖，最適溫度25-35°C，是一種沿岸性半咸水種類。與其它藻類相比，它繁殖快且耐高溫，多不飽和脂肪酸含量較高，在良好培養(yǎng)條件下，其二十碳五烯酸(EPA)占總脂肪酸含量的10.20%。洛氏角毛藻生長快速，尤其是在春夏季節(jié)，常成為浮游植物優(yōu)勢類群。因此，其種類組成和細(xì)胞豐度對海洋生態(tài)系統(tǒng)中其它生物以及海洋環(huán)境有直接或間接影響，具重要研究價(jià)值。洛氏角毛藻是對蝦、海參、文蛤、牡蠣、魁蚶、海膽等的優(yōu)質(zhì)餌料，可用于培養(yǎng)雙殼類、海膽、海參、甲殼類等的幼體。
[0003]關(guān)于角毛藻的培養(yǎng)液配方和培養(yǎng)方法，過去，楊彥豪發(fā)明了一種牟氏角毛藻的培養(yǎng)基配方及全人工快速培養(yǎng)方法(申請?zhí)朇N201310420414.5)。培養(yǎng)基配方包括尿素0.1?
0.3g/L，碳酸氫鈉0.05?0.lg/L，娃酸鈉水結(jié)晶0.I?0.5g/L，磷酸二氫鉀0.01?0.02g/L，EDTA3?5g/L，VBiI?5mg/L，VBi21.0?3yg/L，配方溶劑為海水;培養(yǎng)方法為對培養(yǎng)罐、海水消毒后，以海水為溶劑按照以上配方配培養(yǎng)基，將接藻種接入裝有培養(yǎng)基的培養(yǎng)罐中，密封后培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)進(jìn)行三基色燈光光照并充入經(jīng)過孔徑小于0.Ιμπι空氣濾芯過濾的空氣，培養(yǎng)3?5天后采收。該發(fā)明培養(yǎng)基配方營養(yǎng)均衡、成本低，培養(yǎng)方法使角毛藻快速生長，過程操作簡單，但基礎(chǔ)投資大，易污染，洗刷困難，操作不靈活，占地面積大，生產(chǎn)受季節(jié)影響大，不穩(wěn)定。李色東等發(fā)明了一種適用于大規(guī)模培養(yǎng)牟氏角毛藻的大量元素營養(yǎng)鹽培養(yǎng)基及其制備方法(申請?zhí)朇N201510686861.4)，該大量元素配方培養(yǎng)基是由母液A和母液B按照體積比1:1混合制得，其中，母液A由20-25重量份的碳酸氫銨、1-2重量份的磷酸二氫鈉、0.39重量份的三氯化鐵、1.64重量份的乙二胺四乙酸二鈉、水余量組成的1000的母液A;母液B由15?20重量份的硅酸鈉、1000重量份的水組成。采用該發(fā)明的大量元素營養(yǎng)鹽配方養(yǎng)殖的牟氏角毛藻，可以促進(jìn)牟氏角毛藻的生長，延長培養(yǎng)時(shí)間、實(shí)現(xiàn)其高密度培養(yǎng)、降低培育成本，但操作麻煩，易污染。為了克服目前技術(shù)不足，本發(fā)明公開了一種用間歇光兩步法培養(yǎng)洛氏角毛藻的方法。與傳統(tǒng)技術(shù)相比，本發(fā)明洛氏角毛藻培養(yǎng)液配方更加科學(xué)合理，用容量瓶和萬用瓶兩步法并采用間歇光培養(yǎng)洛氏角毛藻，藻類生長快，產(chǎn)量高，多不飽和脂肪酸含量高，設(shè)備簡單，操作靈活，洗刷方便，成本低，生產(chǎn)穩(wěn)定，不受季節(jié)影響且環(huán)保、節(jié)能，操作方便，不易污染，操廣量提尚80%。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種用間歇光兩步法培養(yǎng)洛氏角毛藻的方法，本目的是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0005]步驟I洛氏角毛藻培養(yǎng)液的配制洛氏角毛藻培養(yǎng)液由以下重量份數(shù)的配料組成:尿素0.01-0.03份，氯化銨0.03-0.05份，碳酸銨0.6-0.8份，工業(yè)氨水(含氨25 %~28%)1.2~1.5份，過磷酸鈣0.1-0.2份，磷酸二氫鉀0.05-0.08份，丙酸鈣0.2-0.5份，硅酸鉀0.03-0.07份，氯化鐵0.003-0.006份，草酸鈦0.07-0.09份，重鉻酸鉀0.0004-0.0008份，五氧化二釩
0.005-0.009 份，維生素 BI 0.00001-0.00002 份，維生素 B12 0.005-0.007 份，維生素 H0.0006-0.0008 份，葉酸0.0004-0.0008份，肌醇 0.002-0.004份，復(fù)合中草藥液 1.5-2.7 份，吲哚乙酸0.0001 -0.0004份，磁化海水1000份。其中復(fù)合中草藥液制備方法:按重量比取當(dāng)歸3-6份，陳皮4-9份，金銀花1-3份，杜仲5-7份，丹參7_9份，純凈水1000份，加熱，煮沸，然后文火繼續(xù)煮沸3分鐘，?；?，冷卻到室溫，棄藥渣，取藥液。
[0006]培養(yǎng)液中各組分的生理功能如下:尿素，氯化銨，碳酸銨，工業(yè)氨水，過磷酸鈣，磷酸二氫鉀主要提供洛氏角毛藻生長所需要的氮、磷;丙酸鈣，硅酸鉀，氯化鐵，草酸鈦，重鉻酸鉀，五氧化二釩主要提供微量元素鈣，硅，鐵，鈦，鉻和釩;維生素BI，維生素B12，維生素H，葉酸，肌醇主要提供各種維生素;復(fù)合中草藥液主要用于殺滅和抑制藻液中的細(xì)菌、病毒和原生動(dòng)物;吲哚乙酸是一種植物生長刺激素，對洛氏角毛藻生長有良好促進(jìn)作用。
[0007]步驟2洛氏角毛藻的第一步培養(yǎng)方法采用容量瓶培養(yǎng)。取一透明、玻璃質(zhì)、容積為1000毫升的容量瓶，洗刷干凈，用蒸餾水潤洗3遍，加入步驟I所述的洛氏角毛藻培養(yǎng)液500毫升，取處于指數(shù)生長期、干凈、無污染、生長旺盛的洛氏角毛藻藻種接種，接種密度2.5萬個(gè)細(xì)胞/毫升，輕輕搖勻，去掉容量瓶瓶塞，用雙層、干凈的報(bào)紙和橡皮筋封住瓶口。把此容量瓶連同其中的藻液一起放進(jìn)光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，共培養(yǎng)8天，前4天，培養(yǎng)箱設(shè)置光照強(qiáng)度35001ux，溫度24°C，光暗周期設(shè)為L15min+D15min，即15分鐘光照，15分鐘黑暗，然后再15分鐘光照，15分鐘黑暗，循環(huán)往復(fù)；后4天，設(shè)置光照強(qiáng)度60001UX，溫度25°C，光暗周期設(shè)為L30min+D30min，即30分鐘光照，30分鐘黑暗，然后再30分鐘光照，30分鐘黑暗，循環(huán)往復(fù);到第5天，添加步驟I所述的新鮮培養(yǎng)液35毫升，以補(bǔ)充因生長繁殖消耗掉的營養(yǎng)鹽，到第7天，添加蒸餾水25毫升，補(bǔ)充揮發(fā)掉的水分并稀釋藻液。整個(gè)培養(yǎng)期間，每天手動(dòng)搖瓶6次，即每隔4小時(shí)搖動(dòng)一次，每次30秒鐘。到第8天末，藻細(xì)胞密度可達(dá)150 ± 20萬個(gè)細(xì)胞/毫升，停止培養(yǎng)，取下橡皮筋和報(bào)紙，將藻液從瓶口倒出，此藻液作為下一級(jí)培養(yǎng)的藻種。
[0008]步驟3洛氏角毛藻的第二步培養(yǎng)方法采用萬用瓶培養(yǎng)。萬用瓶的制作方法:取一白色、透明、5000毫升的三角燒瓶，洗刷干凈，洗刷干凈，再采用消毒劑浸泡消毒20分鐘，所述消毒劑為中草藥復(fù)合消毒劑;所述中草藥復(fù)合消毒劑組成成分(重量份數(shù)比):紅背菜2-4份，魚腥草6-9份，柴胡5-8份，連錢草7-12份，藿香10-15份，蒼術(shù)7-12份，地膚子8-15份，紫花地丁 5-7份，麥冬3-6份，板藍(lán)根0.5-0.9份，百部10-14份，穿心蓮5_8份，蒲公英2_6份，桑黃1-3份;所述中草藥復(fù)合消毒劑制備方法是按重量比例稱取各成分，純凈水1000份，加熱，煮沸，然后文火繼續(xù)煮沸3分鐘，停火，冷卻到室溫，棄藥渣，取藥液;再取一大小合適的橡膠塞，塞子上打2個(gè)直徑5毫米的孔，插入2根直徑5毫米的“L”形的玻璃管，其中一根垂直部分長60厘米，穿過橡膠塞，底部離瓶底I厘米，水平部分長20厘米，通過料管與空壓機(jī)相連，用以充氣，另一根玻璃管垂直部分長15厘米，底部穿過橡膠塞即可，水平部分長12厘米，用以排氣。三角燒瓶通過瓶口裝入步驟I所述的培養(yǎng)液2500毫升，用步驟I培養(yǎng)的藻液作為藻種進(jìn)行接種，接種密度3.5萬個(gè)細(xì)胞/毫升，連接好橡膠塞和玻璃管及空壓機(jī)，將此培養(yǎng)裝置放進(jìn)微藻培養(yǎng)室中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)室空調(diào)控溫，日光燈管提供照明，以打開燈管的數(shù)量多少來調(diào)節(jié)光照強(qiáng)度。開始充氣，進(jìn)行培養(yǎng)，充氣量為2升/分鐘，充氣量不宜太大，以藻細(xì)胞浮起不下沉即可，充氣量太大會(huì)打碎藻細(xì)胞;共培養(yǎng)10天，前5天，設(shè)置光照強(qiáng)度40001UX，溫度24°C，光周期設(shè)為L25min+D25min，即25分鐘光照，25分鐘黑暗，然后再25分鐘光照，25分鐘黑暗，循環(huán)往復(fù);后5天，設(shè)置光照強(qiáng)度70001uX，溫度26°C，光周期設(shè)為L45min+D45min，即45分鐘光照，45分鐘黑暗，然后再45分鐘光照，45分鐘黑暗，循環(huán)往復(fù);到第7天，添加步驟I所述的洛氏角毛藻培養(yǎng)液250毫升，以補(bǔ)充因細(xì)胞生長、繁殖消耗掉的營養(yǎng)鹽，到第8天，添加蒸餾水300毫升，以補(bǔ)充揮發(fā)掉的水分并稀釋藻液。到第10天末，細(xì)胞密度達(dá)180±20萬個(gè)細(xì)胞/毫升，停止充氣和照明，拔掉橡膠塞，將藻液從瓶口倒出，培養(yǎng)結(jié)束。
[0009]有益結(jié)果
[0010]與傳統(tǒng)技術(shù)相比，本發(fā)明洛氏角毛藻培養(yǎng)液配方更加科學(xué)合理，用容量瓶和萬用瓶兩步法并采用間歇光培養(yǎng)洛氏角毛藻，藻類生長快，產(chǎn)量高，多不飽和脂肪酸含量高，設(shè)備簡單，操作靈活，洗刷方便，成本低，生產(chǎn)穩(wěn)定，不受季節(jié)影響且環(huán)保、節(jié)能，操作方便，不易污染，操廣量提尚80%。
【附圖說明】
[0011]圖1用容量瓶培養(yǎng)洛氏角毛藻的示意圖；
[0012]即洛氏角毛藻的的第一步培養(yǎng)方法；其中附圖標(biāo)記為:I報(bào)紙和橡皮筋封口，2藻液；
[0013]圖2用萬用瓶培養(yǎng)洛氏角毛藻的示意圖；
[0014]即洛氏角毛藻的的第二步培養(yǎng)方法;其中附圖標(biāo)記為:3空壓機(jī)，4藻液。其中，箭頭所指為充氣氣體走向。
【具體實(shí)施方式】
[0015]下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步對該技術(shù)進(jìn)行說明。
[0016]實(shí)施例1洛氏角毛藻培養(yǎng)液由以下重量份數(shù)的配料組成:尿素0.01份，氯化銨0.03份，碳酸銨0.6份，工業(yè)氨水(含氨25 % -28 % ) 1.3份，過磷酸鈣0.1份，磷酸二氫鉀0.06份，丙酸鈣0.2份，硅酸鉀0.03份，氯化鐵0.003份，草酸鈦0.07份，重鉻酸鉀0.0004份，五氧化二釩
0.006份，維生素BI 0.00001份，維生素B12 0.005份，維生素H 0.0006份，葉酸0.0005份，肌醇0.002份，復(fù)合中草藥液1.8份，吲哚乙酸0.0002份，磁化海水1000份。實(shí)施例2洛氏角毛藻培養(yǎng)液由以下重量份數(shù)的配料組成:尿素0.02份，氯化銨0.04份，碳酸銨0.7份，工業(yè)氨水(含氨25%-28% ) 1.3份，過磷酸鈣0.1份，磷酸二氫鉀0.07份，丙酸鈣0.4份，硅酸鉀0.06份，氯化鐵0.005份，草酸鈦0.08份，重鉻酸鉀0.0006份，五氧化二釩0.008份，維生素BI0.00001份，維生素B12 0.006份，維生素H 0.0007份，葉酸0.0006份，肌醇0.003份，復(fù)合中草藥液2.2份，吲哚乙酸0.0002份，磁化海水1000份。實(shí)施例3洛氏角毛藻培養(yǎng)液由以下重量份數(shù)的配料組成:尿素0.03份，氯化銨0.05份，碳酸銨0.8份，工業(yè)氨水(含氨25 % -28 % ) 1.4份，過磷酸鈣0.2份，磷酸二氫鉀0.08份，丙酸鈣0.5份，硅酸鉀0.07份，氯化鐵0.006份，草酸鈦0.09份，重鉻酸鉀0.0008份，五氧化二釩0.009份，維生素BI 0.00002份，維生素B12
0.007份，維生素H 0.0008份，葉酸0.0007份，肌醇0.004份，復(fù)合中草藥液2.6份，吲哚乙酸
0.0004份