應(yīng)答羧胺三唑乳清酸鹽的方法和多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的分子藥效學(xué)生物標(biāo)志物的制作方法
【專利說明】應(yīng)答錢胺Ξ畦乳清酸鹽的方法和多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的分子藥 效學(xué)生物標(biāo)志物 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及在獲自健康對(duì)象或具有不同疾病的患者的離體人生長(zhǎng)期毛發(fā)中應(yīng)答 簇胺Ξ挫乳清酸鹽(CT0)的分子藥效學(xué)標(biāo)志物的評(píng)價(jià)。CT0是具有抗腫瘤活性的口服活性 劑，其抑制非電壓操縱式化通道，阻斷化流入細(xì)胞和胞內(nèi)儲(chǔ)存化的釋放，并且導(dǎo)致巧介 導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的破壞和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、多種酪氨酸激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(包 括ΑΚΤ、ΜΕΚ-Ε服或Bcr-Abl)的抑制。更具體地，本發(fā)明設(shè)及通過對(duì)給予至患者的或被加入至 離體培養(yǎng)的體外人生長(zhǎng)期毛發(fā)中的CT0應(yīng)答的轉(zhuǎn)錄組評(píng)估來評(píng)價(jià)總信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)輸出的分子藥 效學(xué)生物標(biāo)志物。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 目前，新型癌癥藥物的發(fā)展基于對(duì)負(fù)責(zé)引發(fā)惡性腫瘤的基因的識(shí)別W及對(duì)它們所 操縱的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的闡明。旨在研發(fā)祀向療法的小分子激酶抑制劑領(lǐng)域已有了極大的進(jìn) 展，祀向療法被設(shè)計(jì)來干擾促使腫瘤生長(zhǎng)的關(guān)鍵分子和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，例如，伊馬脊尼⑧ (BCR-A化）、吉非脊尼ilKEGFR)、i臭夢(mèng)會(huì)應(yīng)⑥化GFR)，W及針對(duì)潛伏期和臨床發(fā)展的許 多其他藥劑。重要的是集中在藥物代謝動(dòng)力學(xué)和新陳代謝特性W及祀效能和分子選擇性方 面，W優(yōu)化勒1 向療法的效果（Collin,! and Workman，Cancer Si即al Transduction 化erapy，l:3-23(2006))。在激酶抑制劑的臨床發(fā)展中，重要的是研發(fā)強(qiáng)大且有益的生物標(biāo) 志物，并且研發(fā)用于預(yù)測(cè)分子依賴性并且由此鑒定將得益于具體藥劑的個(gè)體化藥物治療的 患者的分析，W及耐藥性發(fā)展的問題。
[0004] 針對(duì)分子療法發(fā)展的另一挑戰(zhàn)是，很可能需要抑制數(shù)個(gè)致瘤祀標(biāo)W便克服由若干 異常導(dǎo)致的癌癥，W及防止或壓制耐藥性的發(fā)展。在某些情況下，對(duì)藥物的抗性可能與在腫 瘤微環(huán)境中干擾所述藥物的敏感性和功效的分子(例如，細(xì)胞因子、巧通道信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)或分子 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)）的產(chǎn)生增加有關(guān)。因此，即使最合理設(shè)想的藥物分子可能會(huì)因下述原因失效:其 祀向的祀標(biāo)下游的突變性變化，或者絕不允許藥物到達(dá)其祀標(biāo)或者引起針對(duì)該藥物分子的 反饋機(jī)制的腫瘤新陳代謝特征。
[000引當(dāng)前存在幾種用來克服耐藥性的方法。一種方法是使用高度祀向性藥劑的混合物 (cocktails),其根據(jù)具體癌癥的分子組成來設(shè)計(jì)。另一方法是使用多祀向性激酶抑制劑 (例如索拉非尼⑩）。還有一種策略是，使用控制惡性腫瘤的許多致癌物和通路的若干激 酶的抑制劑，例如，組蛋白脫乙酷基酶化DAC)和HSP90分子伴侶的抑制劑(Garon E. B等，Mo 1 (Mincer The;r.，12:890-900(2013);和Witt 0等，化ncer Letters 277:8-21(2009))。
[0006]針對(duì)引發(fā)具體癌癥的致癌標(biāo)志物的祀向藥物的篩選和基于結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)，使得用于 潛伏期和臨床研究的祀向藥物處于快速發(fā)展。然而，需要研究正常細(xì)胞中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路， W更好地理解導(dǎo)致重要的腫瘤抑制蛋白（作為正常細(xì)胞功能的守口人(gateke邱er))失效 的因素。需要更好地理解運(yùn)些腫瘤抑制蛋白如何被調(diào)控，W防止應(yīng)答應(yīng)激信號(hào)時(shí)其正常信 號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的損失。
[0007] 更具體地，重要的是研發(fā)能幫助正常細(xì)胞整合多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路或提高它們作為 守口人控制生長(zhǎng)和增殖的作用的藥物。例如，P53轉(zhuǎn)錄因子是主要的腫瘤抑制蛋白，其作為 多細(xì)胞有機(jī)體的細(xì)胞命運(yùn)守口人。在應(yīng)答各種應(yīng)激信號(hào)時(shí)P53被激活，并且通過設(shè)及P53祀 基因的反式激活的通路來啟動(dòng)細(xì)胞周期停滯、細(xì)胞衰老或細(xì)胞調(diào)亡（Stambolic V等，Mol Cell:317-325(2001))。然而，在許多人類癌癥中，運(yùn)種遺傳完整性的普遍保護(hù)作用被損壞。 新范例是研發(fā)祀向維持正常細(xì)胞周期、生長(zhǎng)和增殖的精確分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的藥劑。
[0008] 因此，基于具體癌癥中分子異常的知識(shí)，連同對(duì)應(yīng)用于阻斷指定通路的反饋回路 的理解，W及增強(qiáng)正常細(xì)胞和癌細(xì)胞中p53轉(zhuǎn)錄因子和PTEN的腫瘤抑制因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路， 合理選擇和發(fā)展組合治療極具挑戰(zhàn)性，并且存在研發(fā)祀向藥物和/或化療劑的組合的需求。
[0009] 簇胺Ξ挫乳清酸鹽(CT0)是簇胺Ξ挫(CAI)的乳清酸鹽，其為受體操縱式巧通道介 導(dǎo)的巧流入的抑制劑，并且在包括人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的數(shù)種人癌細(xì)胞系中表現(xiàn)出具有抗增 殖和抗侵入功能(Ge S等人，Clin Cancer Res 6:1248-1254(2000))。通過中斷作為第二信 使的巧動(dòng)員，CAI能抑制巧敏感的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，包括花生四締酸及其代謝物的釋放;一氧 化氮的釋放;憐酸肌醇的產(chǎn)生；和酪氨酸的憐酸化化ohn E C等人，Cancer Res 52:3208-3212(1992) ;Kohn E C等人，Proc 化tl Acad Sci 92:1307-1311(1995);化Ider CF等人，J 曲armacol E邱 Therap 257:967-971(1990) ;H叫e DJ等人，J Biol 畑em 266:10136-10142(1991) ;Mignen 0等人，J Cell Sc 118:5615-5623(2005);和化fissi E等人，Cell巧 36:459-467(2004) )dCAI抑制細(xì)胞蛋白STATS和CrkL的憐酸化，并且通過下調(diào)BCR-A化來誘 導(dǎo)耐甲橫酸伊馬替尼的慢性髓白血病細(xì)胞的細(xì)胞調(diào)亡（Alessandro等人，PL0S 7:1-13 (2012))。
[0010] 臨床研究(NCT01107522)中，具有不同腫瘤類型W及具有不同基因組突變的癌癥 患者在沒有確定最大耐受劑量的情況下，單獨(dú)給予CT0是安全且可耐受的，并且CT0治療導(dǎo) 致癌癥的應(yīng)答并表現(xiàn)出病情穩(wěn)定或顯示腫瘤收縮的部分應(yīng)答。因此針對(duì)研發(fā)CT0的信號(hào)轉(zhuǎn) 導(dǎo)輸出的分子藥效學(xué)生物標(biāo)志物投入了巨大努力，W設(shè)計(jì)針對(duì)不同的癌癥類型的分子祀標(biāo) 的組合方案。當(dāng)前用于評(píng)估腫瘤中通路激活的方法包括測(cè)量藥物祀標(biāo)、已知的致癌基因或 已知的腫瘤抑制因子。然而，一個(gè)通路可在多個(gè)位點(diǎn)被激活，因此通過僅評(píng)價(jià)已知的癌癥相 關(guān)基因來評(píng)估通路的激活是不可行的。
[0011] 因此，鑒于CT0對(duì)多種激酶、酪氨酸激酶和巧信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用，研發(fā) CT0的完全分子信號(hào)是重要的。本發(fā)明設(shè)及獲自健康對(duì)象或患者的人類細(xì)胞或組織樣品（如 生長(zhǎng)期毛發(fā))在體內(nèi)或體外應(yīng)答CT0處理的分子藥效學(xué)標(biāo)志物應(yīng)答的評(píng)價(jià)。
[0012] 在體內(nèi)模型中，于患者服用CT0之前，W及每日服用指定治療量CT0后的不同時(shí)間 點(diǎn)，獲得生長(zhǎng)期毛發(fā)。在該期間監(jiān)測(cè)患者的臨床狀態(tài)和CAI的血液水平。
[0013] 在體外模型中，從未治療的對(duì)象獲得生長(zhǎng)期毛發(fā)，并且在具有不同劑量CT0的離體 培養(yǎng)基中處理所述毛發(fā)，所述不同劑量CT0代表治療功效所需的劑量范圍。
[0014] 在運(yùn)兩種模型中，從生長(zhǎng)期毛發(fā)末端的球部提取RNA，然后從所述RNA制備cDNA，并 且通過微陣列分析或通過定量PCR(qPCR)測(cè)定總體轉(zhuǎn)錄水平或基因表達(dá)水平。然后進(jìn)行生 物信息學(xué)分析，W鑒定CT0誘導(dǎo)的生長(zhǎng)期毛發(fā)中的基因表達(dá)變化。也可將運(yùn)樣的方案應(yīng)用于 除獲自健康對(duì)象或患者的生長(zhǎng)期毛發(fā)W外的對(duì)象(iSsues)。
[0015]因此，本發(fā)明更詳細(xì)地描述了使用拔出的毛發(fā)的生物標(biāo)志物分析來研究CTO對(duì)體 夕FmRNA和蛋白表達(dá)水平的影響。拔出的頭皮毛發(fā)為用于測(cè)量直接應(yīng)答CTO處理的理想替代 物。高度血管化的毛囊可在暴露的數(shù)小時(shí)內(nèi)應(yīng)答?？紤]到該血管化、其上皮性質(zhì)和迅速的增 殖率，拔出的毛發(fā)基部的毛球和外毛根銷中的細(xì)胞是針對(duì)固體腫瘤的高度相關(guān)的替代性標(biāo) 志物組織。高度血管化的毛囊可在暴露的數(shù)小時(shí)內(nèi)應(yīng)答藥物治療。進(jìn)行生物信息學(xué)分析W 鑒定毛發(fā)中藥物誘導(dǎo)的變化。
[0016] 發(fā)明概述
[0017] 本發(fā)明設(shè)及在離體(ex vivo)培養(yǎng)的人生長(zhǎng)期毛發(fā)中應(yīng)答體內(nèi)或體外給藥CT0的 多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的分子藥效學(xué)生物標(biāo)志物的評(píng)價(jià)。使用可商購的拔出的毛發(fā)分子平臺(tái)分 析化pi stem Ltd, Manchester，UK)，評(píng)價(jià)對(duì)不同劑量CT0(等同于在患者中實(shí)現(xiàn)療效的簇胺 Ξ挫(CAI)的水平)處理的直接應(yīng)答，W測(cè)試腫瘤學(xué)和其他治療領(lǐng)域中祀向的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn) 導(dǎo)通路。
[0018] 因此，本發(fā)明使用來自對(duì)象(subject)的拔出的頭皮毛發(fā)，從生長(zhǎng)期毛發(fā)末端的球 部提取RNA，從所述RNA制備cDNA，通過微陣列分析或定量PCR(qPCR)測(cè)定基因表達(dá)水平，并 且進(jìn)行生物信息學(xué)分析，W鑒定因 CT0和其他藥物（例如，特羅凱⑧化GFR抑制劑）或 BEZ235(PI3K抑制劑））帶來的藥物誘導(dǎo)的基因表達(dá)變化。
[0019] 本發(fā)明設(shè)及通過在離體培養(yǎng)的來自有或沒有癌癥或其他疾病的人類對(duì)象的人生 長(zhǎng)期毛發(fā)中對(duì)應(yīng)答CT0進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組評(píng)估，W開發(fā)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)輸出的分子藥效學(xué)生物標(biāo)志物。 CT0 暴露的分子藥效學(xué)生物標(biāo)志物包括 RAS、GFS(PI3K、PI3K/MT0R)、MEK、HDAC、N0TCH、WNT-e 連環(huán)蛋白、服?90、66。3、？53八411?4八41離體巧信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)非電壓依賴性、巧信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的所有 基因、離體巧信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、經(jīng)典巧信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、經(jīng)典離體巧、所有基因的巧非電壓依賴性、EGR1、 PTEN、TGF0、CEACAMI或Dystonin。
[0020] 在又一方面，本發(fā)明提供抑制應(yīng)答CTO處理的RAS通路標(biāo)簽(S igna化res)的方法。
[0021] 在又一方面，本發(fā)明提供抑制應(yīng)答CT0處理的Gi^通路標(biāo)簽的方法。
[0022] 在又一方面，本發(fā)明提供抑制應(yīng)答CT0處理的通路標(biāo)簽的方法。
[0023] 在又一方面，本發(fā)明提供抑制應(yīng)答CT0處理的HDAC通路標(biāo)簽的方法。
[0024] 在又一方面，本發(fā)明提供抑制應(yīng)答CT0處理的NOTCH通路標(biāo)簽的方法。
[0025] 在又一方面，本發(fā)明提供抑制應(yīng)答CT0處理的WNT-β連環(huán)蛋白通路標(biāo)簽的方法。
[0026] 在又一方面，本發(fā)明提供抑制應(yīng)答CT0處理的服P90通路標(biāo)簽的方法。
[0027] 在又一方面，本發(fā)明提供抑制應(yīng)答CT0處理的EGFR通路標(biāo)簽的方法。
[0028] 在又一方面，本發(fā)明提供誘導(dǎo)應(yīng)答CT0處理P53通路標(biāo)簽的方法。
[0029] 在又一方面，本發(fā)明提供抑制應(yīng)答CT0處理的與非電壓依賴性巧信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的 基因的方法。具體地，本發(fā)明提供作為應(yīng)答CT0的藥效學(xué)標(biāo)志物的CAI IPA(Ingenuity 化thway Analysis)通路分析、CAI離體通路、巧信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和經(jīng)典巧信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的信 號(hào)得分（Si邑nature Scores)。
[0030] 在又一方面，本發(fā)明提供上調(diào)應(yīng)答CTO處理的EGRl通路標(biāo)簽的方法。
[0031] 在又一方面，本發(fā)明提供上調(diào)應(yīng)答CT0處理的PTEN通路標(biāo)簽的方法。
[0032] 在又一方面，本發(fā)明提供誘導(dǎo)應(yīng)答CT0處理的TGF-β通路標(biāo)簽的方法。
[0033] 在又一方面，本發(fā)明提供下調(diào)應(yīng)答CT0處理的CEACAM1通路的方法。
[0034] 在又一方面，本發(fā)明提供下調(diào)應(yīng)答CT0處理的Dystonin通路的方法。
[003引本發(fā)明還設(shè)及包含CTO和另外藥劑的藥物組合物，其被組合W改善敏感性和功效， 并且減少毒性，通過監(jiān)測(cè)離體培養(yǎng)的來自受治療哺乳動(dòng)物的生長(zhǎng)期毛發(fā)中應(yīng)答CT0的信號(hào) 轉(zhuǎn)導(dǎo)輸出的分子藥效學(xué)生物標(biāo)志物來調(diào)節(jié)一個(gè)或多個(gè)基因標(biāo)簽(gene signatures)，包括 EGFR、MEK、VEGF、HDAC、HSP90、E服、BCR-A化、p5 3、ERG 1、CEACAM UDystonin 或與非電壓依賴 性巧信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因。
[0036] 在又一方面，本發(fā)明提供治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物的病況的方法，其中對(duì)一個(gè)或多個(gè) 基因標(biāo)簽（包括EGFR、MEK、VEGF、HDAC、HSP90、E服、BCR-ABL、P 5 3、ERG 1、CEACAM UDystonin或 與非電壓依賴性巧信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因）的調(diào)節(jié)可預(yù)防、抑制或減輕所述病況的病理或癥 狀，所述方法包括W單一療法或組合療法形式施用治療有效量的CT0,并且監(jiān)測(cè)在離體培養(yǎng) 的來自受治療哺乳動(dòng)物的生長(zhǎng)期毛發(fā)中應(yīng)答CT0的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)輸出的分子藥效學(xué)生物標(biāo)志 物。
[0037] 在另一方面，本發(fā)明提供預(yù)防或治療對(duì)象的增殖病況的方法，所述方法包括單獨(dú) 或聯(lián)合另外的藥劑施用治療有效量的CT0,并且監(jiān)測(cè)在離體培養(yǎng)的來自受治療哺乳動(dòng)物的 生長(zhǎng)期毛發(fā)中應(yīng)答CT0的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)輸出的分子藥效學(xué)