用于表征可動(dòng)關(guān)節(jié)軟組織損傷后細(xì)胞修復(fù)反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)指數(shù)的制作方法
【專利說明】用于表征可動(dòng)關(guān)節(jié)軟組織損傷后細(xì)胞修復(fù)反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組學(xué) 指數(shù) 巧001]相關(guān)申請(qǐng)
[0002] 本專利申請(qǐng)要求于2013年9月12日遞交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)No. 61 /877011的申請(qǐng) 日優(yōu)先權(quán)，所述臨時(shí)專利申請(qǐng)的內(nèi)容通過引用的方式并入本專利。
[000引在聯(lián)邦政府資助的研究與發(fā)展下做出的發(fā)明的權(quán)利聲明
[0004] 本發(fā)明是在美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院（National Institutes of Health)授予的 NO.R01-AR057066政府支持下進(jìn)行的。聯(lián)邦政府擁有本發(fā)明的若干權(quán)利。
技術(shù)領(lǐng)域
[000引本發(fā)明主要設(shè)及測(cè)定關(guān)節(jié)損傷恢復(fù)質(zhì)量的方法，W及基于所述測(cè)定治療關(guān)節(jié)損傷 的方法。
【背景技術(shù)】
[0006] 增加施加在關(guān)節(jié)的力度導(dǎo)致關(guān)節(jié)損傷。運(yùn)樣的關(guān)節(jié)損傷通常被視為外傷的結(jié)果， 例如，軟骨損傷常見于運(yùn)動(dòng)員且通常與急性炎癥有關(guān)。關(guān)節(jié)損傷(例如，初帶撕裂或者半月 板撕裂)的治療W及損傷后患者的康復(fù)設(shè)及多種組分。關(guān)節(jié)損傷后的即時(shí)護(hù)理通常包括:休 息、冷敷、緊壓和抬高。運(yùn)種治療方式的目的在于使急性損傷后期間的炎癥、出血、疼痛和細(xì) 胞代謝最小化，W及使后續(xù)恢復(fù)的潛能最佳化。
[0007] 在損傷后，經(jīng)過運(yùn)樣的初步治療后，隨后通常經(jīng)過1~3個(gè)星期的固定而保護(hù)損傷 組織。固定的目的在于讓愈合開始，并讓愈合不受干擾，并且固定還可W防止關(guān)節(jié)的再次損 傷，再次損傷通常導(dǎo)致更長(zhǎng)的恢復(fù)時(shí)間，并且可能具有長(zhǎng)期的影響。在組織開始愈合后(通 常在損傷3周后），進(jìn)行有控制的運(yùn)動(dòng)。在損傷后4~8周，可W開始更加劇烈的康復(fù)治療從而 恢復(fù)肌肉質(zhì)量和關(guān)節(jié)功能。
[0008] 急性腫脹和損傷消退出血一旦發(fā)生，通常就要進(jìn)行嚴(yán)重?fù)p傷的骨科修復(fù)。然而，目 前醫(yī)生沒有體系或者方法可用于區(qū)分需要侵入性治療的急性損傷和不需要侵入性治療就 可W完全愈合的損傷。
[0009] 在可W導(dǎo)致關(guān)節(jié)退化的損壞開始前就分辨出運(yùn)樣的損傷是尤為重要的。目前，只 能通過關(guān)節(jié)的結(jié)構(gòu)成分的核磁共振成像(MRI imaging)獲得運(yùn)樣的信息，W確定諸如軟骨 容量等關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)性指標(biāo)（S化uctural measures)是否被維持或者正在發(fā)生進(jìn)行性退化。 通常，在損傷后每隔1~2年需要進(jìn)行拍片。也可W使用關(guān)節(jié)液中的標(biāo)記蛋白試驗(yàn)，W檢測(cè)和 監(jiān)控關(guān)節(jié)退化。然而，因?yàn)檫\(yùn)樣的標(biāo)記試驗(yàn)通常是基于數(shù)量很少的基因產(chǎn)物，并且運(yùn)些產(chǎn)物 在關(guān)節(jié)液中的豐度可能高度變化，因此，運(yùn)種試驗(yàn)的預(yù)測(cè)能力往往非常有限。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 一方面，本發(fā)明提供了一種用于表征人類對(duì)象或者動(dòng)物對(duì)象的關(guān)節(jié)損傷后修復(fù)反 應(yīng)的質(zhì)量的方法。所述方法包括:測(cè)定在組織樣品中表達(dá)的多個(gè)基因的mRNA表達(dá)水平，所述 組織樣品取自關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)內(nèi)（intra-adixular)區(qū)域。在一個(gè)實(shí)施例中，所述多個(gè)基因至少 包括列于表1、表2和表3的基因。指示所述修復(fù)反應(yīng)質(zhì)量的修復(fù)指數(shù)值是基于運(yùn)些基因的 mRNA表達(dá)水平而計(jì)算的。
[0011] 在一個(gè)實(shí)施例中，所述mRNA表達(dá)水平是使用逆轉(zhuǎn)錄酶-實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)進(jìn)行測(cè)定的。 所述組織樣品可W包括:軟骨、滑膜、半月板組織、關(guān)節(jié)囊內(nèi)襯、初帶或者運(yùn)些材料中至少兩 者的組合。
[0012] 在特定的實(shí)施例中，計(jì)算所述修復(fù)指數(shù)值包括:將獲自患者組織的所述mRNA表達(dá) 水平與所述基因的第一標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)水平和所述基因的第二標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)水平進(jìn)行比較，其中所述 第一標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)水平指示修復(fù)情況(r巧arative profile)，且其中所述第二標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)水平表 示非修復(fù)情況(non-reparative prof ile)。所述修復(fù)指數(shù)值是基于獲自所述患者組織的所 述mRNA表達(dá)水平，所述第一標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)水平和所述第二標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)水平的相對(duì)值。
[0013] 所述第一標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)水平可W是野生小鼠的損傷后表達(dá)水平，并且所述第二標(biāo)準(zhǔn)表 達(dá)水平可W是缺乏透明質(zhì)酸合成酶-1的小鼠的損傷后表達(dá)水平。所述方法也可W包括：用 校正因子調(diào)整小鼠水平相對(duì)于所述患者組織樣品中表達(dá)的基因的相對(duì)豐度。
[0014] 在另一個(gè)實(shí)施例中，所述多個(gè)基因至少包括列于表4、表5和表6的基因，或者至少 包括列于表7、表8和表9的基因。所述多個(gè)基因也可W包括列于表13、表14和/或表15的基 因。
[0015] 本發(fā)明的另一方面是提供了一種用于治療人類對(duì)象或者動(dòng)物對(duì)象的關(guān)節(jié)損傷的 方法，所述方法包括:根據(jù)上述修復(fù)指數(shù)值實(shí)施治療。在特定的實(shí)施例中，所述治療是手術(shù) 重建、物理治療、粘彈性補(bǔ)充透明質(zhì)酸療法(viscosupplementation HA therapy)、飲食推 薦、生活方式改變推薦、抗炎乳膏、抗炎凝膠或噴霧、熱冷凍治療、非醬體類抗炎藥 (NSAIDs)、針灸、補(bǔ)充性和替代性藥物、類固醇注射或類固醇藥片。
【附圖說明】
[0016] 圖1包括柱狀圖，該柱狀圖顯示了列于表7的22個(gè)纖維化基因的相對(duì)mRNA豐度
[0017] 圖2包括柱狀圖，該柱狀圖顯示了列于表8的22個(gè)創(chuàng)傷愈合基因的相對(duì)mRNA豐度。
[0018] 圖3包括柱狀圖，該柱狀圖顯示了列于表9的22個(gè)炎癥基因的相對(duì)mRNA豐度。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 定義
[0020] 除非另有規(guī)定，在本文中所使用的所有科技術(shù)語(yǔ)具有通常被本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技 術(shù)人員所理解的相同含義。在有沖突的情況下，由本文(包括定義)決定。盡管與本文所述相 似或者等同的方法和材料可W用于本發(fā)明的實(shí)踐或試驗(yàn)中，優(yōu)選方法和優(yōu)選材料如下所 述。
[0021 ]術(shù)語(yǔ)"一"、"一個(gè)"W及"所述"W及在描述本發(fā)明的上下文中（尤其在W下的權(quán)利 要求書的上下文中）的類似的使用可W理解為既包括單數(shù)也包括復(fù)數(shù)，除非在本文中另有 說明或者與上下文明顯矛盾。在本文中列舉的數(shù)值范圍僅作為一種單獨(dú)表示每個(gè)獨(dú)立的落 入所述范圍的數(shù)值的簡(jiǎn)便方法，除非本文另有說明，每個(gè)獨(dú)立的數(shù)值均并入本說明書，就如 在本文中單獨(dú)地列舉運(yùn)些數(shù)值。本文所述的所有方法可任何適當(dāng)?shù)捻樞驁?zhí)行，除非本 文另有說明，或者與上下文明顯矛盾。本文中所提供的任意一個(gè)和所有例子，或者示范性語(yǔ) 言(例如，"例如"，"諸如"）的使用僅意在更好地說明本發(fā)明，并不對(duì)本發(fā)明的保護(hù)范圍構(gòu)成 任何限制，除非另有申明。在本說明書中，沒有語(yǔ)言應(yīng)當(dāng)解釋為表示任何非申明的部分作為 實(shí)施本發(fā)明必要的要素。
[0022] 在本文所使用的術(shù)語(yǔ)"包括"、"包含"、"具有"、"有"、"可能"及其變體意在為開放 式的過渡性的短語(yǔ)、術(shù)語(yǔ)或詞語(yǔ)，不排除附加行為的可能性。本發(fā)明也考慮其它例子"包括" "由…組成""基本由…組成"，運(yùn)些例子或者其中出現(xiàn)的組成部分，不管是否明確規(guī)定。
[0023] 測(cè)定關(guān)節(jié)損傷后恢復(fù)反應(yīng)質(zhì)量的方法
[0024] 為了助于理解本發(fā)明的原理，現(xiàn)可W參考實(shí)施例，其中的一些實(shí)施例在附圖中顯 示，并且將使用特定的語(yǔ)言描述。然而，應(yīng)理解的是，本發(fā)明的保護(hù)范圍并不因此而受限制。 對(duì)所描述的實(shí)施例的任何改變和進(jìn)一步調(diào)整，W及對(duì)本文所描述的本發(fā)明原理的任何進(jìn)一 步運(yùn)用，都可W被認(rèn)為對(duì)于本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員而言通常會(huì)發(fā)生。在接下來的論述 中，公開了檢測(cè)方法、分析方法或其它方面的大量的潛在特征或選擇。應(yīng)理解的是，所公開 的每一個(gè)特征或者多個(gè)特征可W與所討論的廣義的特征進(jìn)行組合，形成本發(fā)明的公開實(shí)施 例。
[0025] 本發(fā)明的一個(gè)方面提供了一種生成修復(fù)指數(shù)的方法，所述修復(fù)指數(shù)可W指示在節(jié) 損傷后修復(fù)反應(yīng)的質(zhì)量。所述關(guān)節(jié)可W是人體對(duì)象或者動(dòng)物對(duì)象身體上的任何關(guān)節(jié)，包括 但不限于膝蓋、肩部、臀部、肘或踩關(guān)節(jié)，或者手、腳或脊椎的關(guān)節(jié)。所述方法包括取自所述 關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)內(nèi)間隙的組織樣品的基因表達(dá)分析。
[0026] 在一個(gè)實(shí)施例中，所述方法測(cè)定了組織的轉(zhuǎn)錄組變化，所述組織包含臨近損傷位 點(diǎn)的基質(zhì)細(xì)胞和多能祖細(xì)胞。具體地，運(yùn)些關(guān)節(jié)組織中的一套"纖維增生 (fib;rop;roliferativeΓ和"纖維化(p;rofib;roticΓ基因的轉(zhuǎn)錄豐度預(yù)示了長(zhǎng)期修復(fù)過程 的質(zhì)量。運(yùn)樣的基因包括在纖維化、細(xì)胞因子和/或NFkB途徑中的基因，運(yùn)些基因設(shè)及纖維 化、創(chuàng)傷愈合和炎癥。在小鼠動(dòng)物模型中，在早至損傷后4周，運(yùn)些基因的表達(dá)水平的測(cè)定可 W預(yù)測(cè)期待的關(guān)節(jié)修復(fù)的質(zhì)量
[0027] 在一個(gè)實(shí)施例中，所述組織樣品取自所述關(guān)節(jié)內(nèi)區(qū)域。本文中所使用的術(shù)語(yǔ)"關(guān)節(jié) 內(nèi)"指的是兩骨之間的關(guān)節(jié)內(nèi)的空間，具體指被關(guān)節(jié)囊容納的關(guān)節(jié)部分。所述樣品可包括： 軟骨、滑膜、扁平的半月板組織、關(guān)節(jié)囊襯里、初帶或者運(yùn)些材料中的至少兩者的組合。
[0028] 在特定的實(shí)施例中，所述對(duì)象是人類對(duì)象，且所述