桃est-ssr分子標(biāo)記及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子標(biāo)記領(lǐng)域，具體涉及桃品種6個EST-SSR分子標(biāo)記技術(shù)及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 桃[Prunus persica(L. )Batsch]是世界重要水果之一，起源于中國，世界各地均 有種植，是我國主要水果之一，中國桃產(chǎn)量居世界第一。
[0003] 桃分布廣，品種多，但親緣關(guān)系近的桃品種之間的鑒定卻比較困難，特別是同一個 親本組合的不同后代品種之間很難鑒別。
[0004] 近年來，應(yīng)用簡單重復(fù)序列（Simple sequence repeat，SSR)對品種進(jìn)行鑒別在多 種植物上有著廣泛應(yīng)用，該標(biāo)記具有重復(fù)性好、數(shù)量多、成本低、檢測便利等特點。有一部分 SSR存在于表達(dá)序列標(biāo)簽(Express sequence tag，EST)中，與基因組SSR相比，EST-SSR具有 開發(fā)耗時短，花費低，效率高等優(yōu)點。
[0005] 目前，EST-SSR標(biāo)記已相繼應(yīng)用于葡萄，梨，草莓，蘋果，甘蔗等物種，雖然近年來關(guān) 于桃EST-SSR標(biāo)記也有報道，如桃EST-SSR標(biāo)記開發(fā)及其在薔薇科其他果樹中通用性的研究 (譚彬等，2013);隋毅等(2006)用8個EST-SSR標(biāo)記對扁桃和其它李屬物種SSR的進(jìn)化模式和 突變機(jī)制進(jìn)行研究；但對于近緣品種或同一雜交組合不同后代材料的鑒別而言EST-SSR數(shù) 量仍嫌不足。因此，開發(fā)更多的EST-SSR標(biāo)記以應(yīng)用于桃品種或育種材料鑒別以及種質(zhì)資源 遺傳多樣性研究具有必要性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供桃EST-SSR分子標(biāo)記，涉及6個新的 桃EST-SSR標(biāo)記。所述桃EST-SSR標(biāo)記分別是六組引物對，其序列如SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 12所示。
[0007] 本發(fā)明提供的6個桃分子標(biāo)記，其特征如表1所示。
[0008] 表 1 桃EST-SSR標(biāo)記特征（SEQ ID N0:1-12)
[0009]
[0010]
[0011]本發(fā)明的6個桃EST-SSR標(biāo)記通過以下方法獲得：
[0012] (1)利用GenBank公布的桃EST序列和MI SA軟件找到2146個重復(fù)基元，選取其中三 至六堿基重復(fù)且重復(fù)次數(shù)大于5的和復(fù)合堿基重復(fù)共37個SSR序列設(shè)計了引物，引物設(shè)計的 原則為:？〇?產(chǎn)物長度100-35(^?;6(：含量40%-70%，最適為50%;退火溫度50-65°(3 ;引物長 度18-25bp;避免出現(xiàn)引物二聚體。在設(shè)計好的正向引物的5 '端統(tǒng)一加18個bp的尾巴(Ml3-丁6丁六44406六066〇^1')，另合成加了？41和!^兩種不同熒光基團(tuán)標(biāo)識的組3尾巴引物，引物 委托上海生工生物工程有限公司合成；
[0013] (2)用CTAB(十六烷基三乙基溴化銨，Hexadecyl trimethyl ammonium bromide) 法提取桃品種基因組DNA;
[0014] (3)采用SSR分子標(biāo)記方法進(jìn)行桃分子標(biāo)記的篩選：以'白麗'品種的基因組DNA為 模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增:在20μ1反應(yīng)體系中分別加入lOXEx Taq Buffer(含Mg2+)，1.6yl的2.5mM dNTPJunits/yl Ex Taq DNA polymerase Ο.?μL，正向引物4pmol，反向引物5pmol，M13通 用焚光引物lpmol，lOng/μΙ DNA模板ΙμL，ddH2〇補(bǔ)充體系至20μ1。使用Eppendorf Mastercycler進(jìn)行DNA擴(kuò)增，具體步驟為:94°C預(yù)變性5min，，然后94°C(30s)/60°C(30s)/72 °C(30s)循環(huán) 20 次，之后 94°C(30s)/55°C(30s)/72°C(30s)循環(huán) 12 次，最后 72°C 延伸 15min。 產(chǎn)物檢測：在含有〇.5%ygAU EB的3%的瓊脂糖凝膠上電泳，紫外燈下觀察并照相記錄結(jié) 果；
[0015] (4)將初步篩選的有擴(kuò)增產(chǎn)物的引物在另外10個桃品種上進(jìn)行擴(kuò)增，于ABI遺傳分 析儀上進(jìn)行分析，并使用PowerMarker V3 · 25，Tree32和GenALE X 6 · 501讀取數(shù)據(jù)并分析結(jié) 果。
[0016] 本發(fā)明的另一個目的是還提供所述的桃EST-SSR標(biāo)記在桃種質(zhì)資源遺傳多樣性分 析以及品種鑒別中的應(yīng)用。
[0017] 為開發(fā)更多的EST-SSR標(biāo)記，本發(fā)明利用已發(fā)布的GenBank的EST序列和MISA軟件 開發(fā)新的標(biāo)記，找到了 500多個SSR位點，合成了 37對引物，經(jīng)11個近緣關(guān)系的桃品種篩選， 得到14個未被報道的具有多態(tài)性的標(biāo)記，本發(fā)明使用其中多態(tài)性最高的6個標(biāo)記。本發(fā)明的 有益效果是：（1)本發(fā)明的6個分子標(biāo)記在11個桃品種中有多態(tài)性，在11個桃品種中進(jìn)行遺 傳多樣性分析與桃植物分類常識相吻合（圖1)，是穩(wěn)定存在的新標(biāo)記，可以直接將本發(fā)明所 提供的6個引物對應(yīng)用于更多桃材料上，進(jìn)行種質(zhì)資源和遺傳多樣性分析。（2)本發(fā)明的6個 分子標(biāo)記均來自桃EST序列，可應(yīng)用于桃的品種鑒定、親本鑒別、遺傳多樣性分析以及分子 輔助選育等工作。
【附圖說明】
[0018] 圖1為基于6個EST-SSR標(biāo)記構(gòu)建的11個桃品種遺傳相似系數(shù)的UPGMA聚類圖。
【具體實施方式】
[0019] 本發(fā)明結(jié)合附圖和具體實施例作進(jìn)一步的說明。
[0020] 實施例1:改良CTAB法提取基因組DNA
[0021 ] (1)配制CTAB緩沖液（十六烷基三乙基溴化銨，Hexadecyl trimethyl ammonium bromide)的配方為：2%CTAB，0.1M Tris，20mM EDTA，1.4M NaCl，pH值8.0.TE緩沖液（10mM Tris,lmM EDTA,pH8.0)〇
[0022] (2)采桃幼嫩葉片，桃品種信息如圖1所示。
[0023] (3)將桃葉片放入液氮中充分研磨至粉末狀，稱取0.7g左右轉(zhuǎn)入盛有4ml CTAB溶 液與80μ1β-巰基乙醇(65°C預(yù)熱）的10ml離心管中，65°C水浴lh;加入4ml氯仿/異戊醇（24: 1，v/v)，混勻，12000rpm離心10min，取上清液并再次加入4ml氯仿/異戊醇（24:1，v/v)，混 勻，12000rpm離心10min。吸取上清液，加入2ml 5M NaCl，4ml異丙醇（-20°C預(yù)冷），混勻，放 入-20°C2h<a2000rpm離心15min，棄上清，沉淀用75%乙醇漂洗2次，晾干。加入100μ1含10μ g/ml RNase Α的ΤΕ緩沖液溶解沉淀，37°C水浴lh以降解RNA。用分光光度計法檢測DNA濃度， 用電泳法檢測質(zhì)量，保存于_20°C。
[0024] 實施例2:設(shè)計EST-SSR引物
[0025] 本發(fā)明利用GenBank公布的桃EST序列開發(fā)EST-SSR引物。引物設(shè)計軟件為 NCBIPrimer-BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih. gov/tools/primer-blast/index.cgi? LINK_L0C = Blast HomeAd)。引物設(shè)計的具體條件為:PCR產(chǎn)物長度100-350bp;GC含量40%-70%，最適為50%;退火溫度50-65°(3;引物長度18-25匕？;避免出現(xiàn)引物二聚體。引物合成中 在正向引物的5'端加上18bp的M13-tail(序列為TGTAAAACGACGGCCAGT)。共開發(fā)了37對EST-SSR引物，序列如表2所示。
[0026] 表2桃EST-SSR標(biāo)記特征
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[0028]
[0029]實施例3:有多態(tài)性引物篩選
[0030]用實施例1中抽提的桃葉片DNA為模板，用實施例2中設(shè)計的37對引物進(jìn)行擴(kuò)增。
[0031] 1、PCR反應(yīng)體系：10XEx Taq Buffer(含Mg2+)，1.6yl的2.5mM dNTP，5units/yl Ex Taq DNA polymerase Ο.?μL，正向引物4pmol，反向引物5pmol，M13通用焚光引物lpmol， lOng/μΙ DNA模板 1μ1，(ΜΗ20補(bǔ)充體系至20μ1。
[0032] 2、利用Eppendorf Mastercycler(Eppendorf Scientific，Inc · )PCR儀擴(kuò)增。反應(yīng) 程序為：94°C預(yù)變性5min，，然后94°<3(308)/60°(3(308)/72°(3(308)循環(huán)20次，之后94°〇 (3〇8)/55°(3(3〇8)/72°(3(3〇8)循環(huán)12次，最后72°(3延伸1511^11。
[0033] 3、電泳檢測：取5ylPCR產(chǎn)物加入ΙμL 6Xloading 13虹€6廣在濃度為1%的瓊脂糖 凝膠上檢測，并拍照記錄。
[0034] 4、STR片段長度分析：將上述電泳檢測中條帶長度在合理范圍內(nèi)的PCR產(chǎn)物進(jìn)行 STR片段長度分析，得到不同桃品種的SSR位點的具體長度，收集6個引物多態(tài)性信息。并用 POWERMARKER軟件和MEGA軟件構(gòu)建UPGMA聚類圖。
【主權(quán)項】
1. 一種桃EST-SSR分子標(biāo)記，其特征在于，該標(biāo)記是一組引物對，其序列如SEQIDNO: 1 和SEQIDNO:2所示。2. -種桃EST-SSR分子標(biāo)記，其特征在于，該標(biāo)記是一組引物對，其序列如SEQIDNO: 3 和SEQIDNO:4所示。3. -種桃EST-SSR分子標(biāo)記，其特征在于，該標(biāo)記是一組引物對，其序列如SEQIDNO:5 和SEQIDNO:6所示。4. 種桃EST-SSR分子標(biāo)記，其特征在于，該標(biāo)記是一組引物對，其序列如SEQIDNO:7和 SEQIDNO:8所示。5. -種桃EST-SSR分子標(biāo)記，其特征在于，該標(biāo)記是一組引物對，其序列如SEQIDNO:9 和SEQIDNO: 10所示。6. -種桃EST-SSR分子標(biāo)記，其特征在于，該標(biāo)記是一組引物對，其序列如SEQIDNO: 11和SEQIDNO: 12所示。7.權(quán)利要求1-6任一所述的桃EST-SSR標(biāo)記在桃種質(zhì)資源遺傳多樣性分析、品種鑒定、 親本鑒別和分子輔助育種中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明提供桃EST-SSR分子標(biāo)記，其序列如SEQ？ID？NO:1至SEQ？ID？NO:12所示。本發(fā)明以18個親緣關(guān)系較近的桃品種基因組DNA模板為研究對象，根據(jù)NCBI中公開的桃EST序列，采用MISA引物設(shè)計軟件，查找并設(shè)計新的EST-SSR引物。經(jīng)過PCR擴(kuò)增、聚丙烯酰胺凝膠電泳、克隆驗證、STR基因分型篩選出6個具有多態(tài)性的EST-SSR分子標(biāo)記，本發(fā)明提供的桃EST-SSR分子標(biāo)記能有效地對11個桃品種進(jìn)行區(qū)分，可用于桃的品種鑒定、親本鑒別、遺傳多樣性分析以及分子輔助選育等領(lǐng)域。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/11
【公開號】CN105483126
【申請?zhí)枴緾N201610005684
【發(fā)明人】徐昌杰, 丁毛毛, 王可, 吳大軍, 陳妙金, 王文婷, 陳昆松
【申請人】浙江大學(xué)
【公開日】2016年4月13日
【申請日】2016年1月4日