水稻OsRhoGAP2基因在提高水稻有效分蘗中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)和分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及水稻0sRhoGAP2基因在提高水稻有效分蘗中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]全球近一半人口都以水稻為食。水稻，學(xué)名:0ryza sativa L.，是世界上最重要的糧食作物之一?，F(xiàn)階段，糧食短缺的危機日益嚴重，糧食作物產(chǎn)量尤其是水稻的產(chǎn)量迫切需要提高。水稻基因組計劃已經(jīng)完成，越來越多的重要農(nóng)藝性狀基因以及基因定位(數(shù)量性狀位點)被科研工作者陸續(xù)鑒定出來。根據(jù)其研究進展，可以運用一系列分子生物學(xué)的知識應(yīng)用于水稻育種方案，來提高水稻產(chǎn)量的方法。
[0003]水稻的分蘗和抽穗是決定其籽粒產(chǎn)量的重要性狀。第一個被鑒定出來的控制水稻分蘗的基因是水稻的單蘗基因(MOCl)，在確定與水稻產(chǎn)量相關(guān)的重要基因方面取得了重大的進展，從而對闡明水稻產(chǎn)量相關(guān)性狀的遺傳基礎(chǔ)得以實現(xiàn)。其中的一些重要基因是可以用于高產(chǎn)水稻的分子育種。
[0004]隨著越來越多的證據(jù)表明，水稻產(chǎn)量受數(shù)量形狀位點控制。水稻分蘗是一個重要的農(nóng)藝學(xué)性狀，會影響到水稻的產(chǎn)量，比如單株的分蘗數(shù)量決定穗數(shù)，有效分蘗數(shù)決定分蘗長成的穗數(shù)和每穗粒數(shù)的數(shù)量。之后發(fā)現(xiàn)的與分蘗數(shù)相關(guān)的基因還有:TADl、TE、LAX1、LAX2、0sTBl、0sMADS57、FCl、D3、D17、D10、D14、D27、DLT 等等，這些基因都通過直接或者間接來調(diào)節(jié)了水稻的穗分支。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明的目的是提供水稻0sRhoGAP2基因在提高水稻有效分蘗中的應(yīng)用，即將含有0sRhoGAP2基因的表達載體轉(zhuǎn)染到水稻中，然后培育水稻獲得T2代過表達0sRhoGAP2基因的轉(zhuǎn)基因水稻。
[0006]本發(fā)明為實現(xiàn)上述目的采用如下技術(shù)方案，水稻0sRhoGAP2基因在提高水稻有效分蘗中的應(yīng)用，其特征在于該水稻0sRhoGAP2基因序列如SEQ ID N0.1所示。
[0007]本發(fā)明所述的水稻0sRhoGAP2基因在提高水稻有效分蘗中的應(yīng)用，其特征在于具體過程為:設(shè)計引物Pl: 5，-TATCTGCAGATGGAGGGCGAGGTGCC-3，，含有PstI酶切位點和引物P2:5，-GCGAAGCTTTACACAGGCTTGTCCCGC-3，，含有Hindm酶切位點，通過PCR擴增為0sRhoGAP2基因cDNA編碼區(qū)5’端和3’端分別添加PstI和Hindm酶切位點，連接到植物表達載體PCAMBIA1302的相應(yīng)位點，再通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織獲得T2代過表達0sRhoGAP2基因的轉(zhuǎn)基因水稻。
[0008]本發(fā)明將水稻Rho蛋白調(diào)控因子編碼基因0sRhoGAP2構(gòu)建過表達植物載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織獲得T2代過表達0sRhoGAP2基因的轉(zhuǎn)基因水稻，與對照相比，轉(zhuǎn)基因水稻的分蘗數(shù)提高了32.35%-38.75%。
【附圖說明】
[0009]圖1為對照水稻和0sRhoGAP2基因過表達轉(zhuǎn)基因水稻T2代不同株系分蘗數(shù)的統(tǒng)計學(xué)比較，其中WT為對照水稻日本晴，0E-0sRhoGAP2為轉(zhuǎn)基因水稻；
圖2為對照水稻和0sRhoGAP2基因過表達轉(zhuǎn)基因水稻T2代不同株系有效分蘗數(shù)的統(tǒng)計學(xué)比較，其中WT為對照水稻日本晴，0E-0sRhoGAP2為轉(zhuǎn)基因水稻；
圖3為0sRhoGAP2植物過表達載體的構(gòu)建，其中A為0sRhoGAP2的cDNA編碼區(qū)擴增膠回收產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳，B為pMD18-T-0sRhoGAP2載體Hindm和PstI雙酶切鑒定，圖C為pCAMBIA1302-0sRhoGAP2-eGFP 表達載體 Hindm 和 PstI 雙酶切鑒定；
圖4為081^064?2過表達轉(zhuǎn)基因水稻了2代的？0?檢測，圖中]\1:0嫩MakerCDL 2000)，1、野生型檢測，2、陰性對照，3、陽性對照，4-13、過表達植株T2代的PCR產(chǎn)物，通過PCR檢測可以篩選到陽性植株。條帶正確且亮的代表陽性植株。
[0010]圖5為0sRhoGAP2過表達轉(zhuǎn)基因水稻T2代的表達量檢測，通過表達量檢測可以檢測該基因在此植株中的表達水平，從圖中我們可以得出轉(zhuǎn)基因水稻中該基因的表達量都有了不同程度的提高，最少的有14倍，最多的有229倍。
【具體實施方式】
[0011]以下通過實施例對本發(fā)明的上述內(nèi)容做進一步詳細說明，但不應(yīng)該將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實施例，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
[0012]實施例1
1、水稻0sRhoGAP2基因過表達載體的構(gòu)建
設(shè)計引物P1: (5 ’ -TATCTGCAGATGGAGGGCGAGGTGCC-3 ’，含有Pst I酶切位點)和引物P2:(5 ’ -GCGAAGCTTTACACAGGCTTGTCCCGC-3 ’，含有Hindm酶切位點)，通過PCR擴增為0sRhoGAP2基因cDNA編碼區(qū)5’端和3’端分別添加PstI和Hindm酶切位點，連接到植物表達載體pCAMBIA1302(購自CAMBIA公司)的相應(yīng)位點。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，在含有卡那霉素的LB平板上篩選轉(zhuǎn)化子，經(jīng)酶切和PCR鑒定后，已經(jīng)測序確認。
[0013]2、水稻的遺傳轉(zhuǎn)化、篩選和T2代轉(zhuǎn)0sRhoGAP2基因水稻性狀的分析
采用常規(guī)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化方法，利用農(nóng)桿菌浸染法將0sRhoGAP2基因過表達載體轉(zhuǎn)化至水稻愈傷組織(將去穎殼的水稻種子點播在愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基N6D2上。大約一周后，水稻種子能夠長出愈傷。除去芽和根后，將愈傷置于新的的N6D2培養(yǎng)基上繼續(xù)誘導(dǎo)，大約10天能夠形成比較堅硬的愈傷組織，可用于農(nóng)桿菌侵染。)利用潮霉素篩選陽性愈傷組織，進一步誘導(dǎo)培育再生陽性轉(zhuǎn)基因植株，并進行分子鑒定。轉(zhuǎn)基因水稻篩選至T2代時，對同一批次的對照水稻和T2代轉(zhuǎn)基因水稻進行觀察，測量分蘗數(shù)(如圖2-3所示)，進行統(tǒng)計學(xué)分析，統(tǒng)計樣本各20株，統(tǒng)計結(jié)果顯示未轉(zhuǎn)基因的對照水稻的平均分蘗數(shù)為13.90±2.77，轉(zhuǎn)基因水稻的平均分蘗數(shù)為18.93 ±4.20，與對照相比，轉(zhuǎn)基因水稻的分蘗數(shù)提高了32.35%_38.75%。
[0014]以上實施例描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征及優(yōu)點，本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明原理的范圍下，本發(fā)明還會有各種變化和改進，這些變化和改進均落入本發(fā)明保護的范圍內(nèi)。
[0015] SEQUENCE LISTING<110>河南師范大學(xué)
〈120〉水稻0sRhoGAP2基因在提高水稻有效分蘗中的應(yīng)用 〈130〉 2015 〈160〉 I
<170> PatentIn vers1n 3.3
〈210〉 I
〈211〉 1300
〈212〉 DNA
〈213〉人工序列
〈400〉 I
atggagggcg aggtgccggtgtcatcgccg ctgatgctgccggcggcgag gggaggagga 60
ggaggagggg tgtccgtcgtggagacggtg gcggcggcgctgcggaggtc gctgctgctg 120
tgcagcagcg tgcgcgccgcggaggacgaa ggggccgcgg cggcggcggc ggctgctgcg 180
gggatgcaga ttggccggcccaccgacgtg cggcacgtctcgcacgtcac cttcgaccgc 240
ttcgtggggt tcctcggcctccccgccgacctcgagcccg acgtgccccg ccccgcgcct 300
agcgccagtg tgagtgtatttggagtttca ccaacgtcca tgcaatgctc atacgataac 360
agaggaaaca gtgtgccaacaatactattg accatgcaaa agaagttata tcaacttggg 420
gggcttcagg ctgaaggaatcttcagaata aatgcagaca atagtcagga actacatgtc 480
agggagcaac taaacatgggtgttgttccg gatggtgttg acatgcactg tctgacgggc 540
ctcataaagg catggtttcgtgaacttcca agtggagtattggactcatt gactccagaa 600
caagtgatgc actgcaacactgaagaagaa tgcgctctccttgcgagtac tctacctcca 660
gtggaagcag cactacttgattgggccatcaatctgatgg cagatgttgt ggaacatgaa 720
aactacaata agatgaacgctcgcaacattgctatggtttttgcaccaaa catgactcag 780
atggccgatc ccttgactgctttgatacatgcagttcaag tgatgaattt tctcaagaca 840
cttatcttga agactgtgaagggacgggaa gaaacagcta tgccatcaag tgcattccca 900
tcaagctctg gttccccaagtgacaaagatgaacctcagg cattagagca tttggacaag 960
cccaccattt gttcaactcagcaaaataatgattttccaa tgattagtgg ggctactctt 1020
gatcacttcc tctttagagcagaaccattg cgtcataatg acgcacaagg tagtgctgga 1080
cgacccaaga aacgcgacaataaggaccatgacaacagca gcagggaatt ttctcccata 1140
gatagtgatt caagtagccaagccagcaattctgcaagca aattcagtaa tgacaatgtg 1200
gaaggtttat ttgacagatttaaatttcgg aaaggagtag ggaggctgtg cagacaccct 1260
gtttttcagt tgagtaggtccatgaaaaaa tcaggtgaag cgggacaagc ctgtgtatga 1300
【主權(quán)項】
1.水稻OsRhoGAP2基因在提高水稻有效分蘗中的應(yīng)用，其特征在于該水稻OsRhoGAP2基因序列如SEQ ID N0.1所示。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水稻OsRhoGAP2基因在提高水稻有效分蘗中的應(yīng)用，其特征在于具體過程為:設(shè)計引物Pl: 5，-TATCTGCAGATGGAGGGCGAGGTGCC-3，，含有PstI酶切位點和引物P2:5’-GCGAAGCTTTACACAGGCTTGTCCCGC-3’，含有Hindm酶切位點，通過PCR擴增為OsRhoGAP2基因cDNA編碼區(qū)5’端和3’端分別添加PstI和Hindm酶切位點，連接到植物表達載體PCAMBIA1302的相應(yīng)位點，再通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織獲得T2代過表達OsRhoGAP2基因的轉(zhuǎn)基因水稻。
【專利摘要】本發(fā)明公開了水稻<i>OsRhoGAP2</i>基因在提高水稻有效分蘗中的應(yīng)用，將水稻Rho？GTP酶激活蛋白編碼基因<i>OsRhoGAP2</i>構(gòu)建過表達植物載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織，獲得T2代過表達<i>OsRhoGAP2</i>基因的轉(zhuǎn)基因水稻，與對照相比，轉(zhuǎn)基因水稻的分蘗數(shù)提高了32.35%-38.75%。
【IPC分類】C12N15/29, A01H5/00, C12N15/82
【公開號】CN105462992
【申請?zhí)枴緾N201610002409
【發(fā)明人】梁衛(wèi)紅, 閆鑫甜, 李佳佳, 張靜, 黃俊駿, 王高華, 杜京堯, 石佳, 葛慧雯
【申請人】河南師范大學(xué)
【公開日】2016年4月6日
【申請日】2016年1月6日